潘菲，董彪，劉婷，陳妍，陳可丹，黃冰靜，萬(wàn)茵，劉成梅，張鵬，付桂明*

1(食品學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南昌大學(xué))，江西 南昌，330047)2 (江西省樟樹市樟樹貢酒業(yè)有限公司，江西 樟樹，331200)

中國(guó)白酒是采用典型的同步糖化發(fā)酵的固態(tài)釀造方式生產(chǎn)，霉菌的糖化作用與淀粉原料的轉(zhuǎn)化息息相關(guān)。固態(tài)發(fā)酵對(duì)原料的利用率低，淀粉質(zhì)原料的糖化發(fā)酵不完全，是造成白酒固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酒率較低的重要原因。大曲是白酒釀造過程中微生物主要來(lái)源之一[1]，其含有的大量霉菌能夠分泌多種淀粉酶、糖化酶等水解酶類[2]。這些酶能將淀粉水解成小分子糖，為酵母菌乙醇發(fā)酵及香氣物質(zhì)的生成提供能量和小分子物質(zhì)[3]，直接影響白酒出酒率和重要香氣物質(zhì)的產(chǎn)生，對(duì)整個(gè)釀造過程產(chǎn)酒精和呈香有重要貢獻(xiàn)。米曲霉、河內(nèi)白曲霉、黑曲霉和米根霉等霉菌是白酒生產(chǎn)中常用的霉菌，具有較高的糖化力[4-5]，同時(shí)其具有耐酸特性且能分泌較多酸性蛋白酶，能夠提高出酒率，已被廣泛應(yīng)用于白酒釀造。

本文對(duì)特香型白酒大曲中的霉菌進(jìn)行分離純化，篩選鑒定高產(chǎn)糖化酶霉菌，將其與釀酒酵母共同制備成麩曲強(qiáng)化大曲，接種于酒醅，按特香型白酒釀造工藝進(jìn)行強(qiáng)化釀造，分析高糖化力霉菌對(duì)提高白酒固態(tài)發(fā)酵出酒率和原酒中風(fēng)味物質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

特香型中溫大曲、大米、稻殼，江西樟樹貢酒廠有限公司。土豆、麩皮等，市購(gòu)；淀粉、酵母膏、NaCl、NaOH、(NH4)2SO4、I2、KI、醋酸鈉、冰醋酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、Na2SO3、酒石酸鉀鈉等(國(guó)產(chǎn)分析純)；乳酸石炭酸棉藍(lán)染液,廈門海標(biāo)科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒、Taq酶,天根生化科技(北京)有限公司；葡萄糖(BR純度),上海阿拉丁生化科技股份有限公司；瓊脂粉(AR純度),北京索萊寶科技有限公司；DNA Marker,寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；4-甲基-2-戊醇,德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 培養(yǎng)基和菌種

PDA培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮爛，用4層紗布過濾，加入葡萄糖和瓊脂，加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

糖化力初篩培養(yǎng)基：可溶性淀粉12 g，酵母膏8 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g，水1 000 mL。

麩皮培養(yǎng)基：新鮮麩皮10 g，加水15 mL，裝于250 mL三角瓶中，0.12 MPa高壓滅菌40 min，重復(fù)進(jìn)行2次滅菌。

SaccharomycescerevisiaeNCUF303.1 為本實(shí)驗(yàn)保存的高產(chǎn)酒精釀酒酵母。

1.3 儀器與設(shè)備

ZDX-35BI型坐式蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；PCR儀，賽默飛世爾科技有限公司；7890-7000 GC-QQQ-MS，美國(guó)Agilent公司；57330-U SPME手柄、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷 固相微萃取纖維頭，美國(guó)Supelco公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 特香型白酒大曲中霉菌的分離純化[6]

將5 g大曲粉置于含有100 mL無(wú)菌水和玻璃珠的三角瓶中，稀釋涂布于PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃下恒溫培養(yǎng)2～3 d，將選中的菌落進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并通過反復(fù)劃線進(jìn)行純化。

1.4.2 特香型白酒大曲中高糖化霉菌的篩選

將霉菌點(diǎn)種于初篩培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，向培養(yǎng)皿中加入適量顯色劑染色。靜置，測(cè)量平板中菌落和透明圈的直徑大小，計(jì)算水解圈(hydrolysis cirole,HC)值(HC=透明圈直徑/菌落直徑)，以HC值的大小作為衡量糖化力強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)。

菌株經(jīng)斜面活化后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后稀釋至孢子數(shù)達(dá)107CFU/mL,接種于麩皮培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72 h，采用DNS試劑法測(cè)定糖化酶酶活，采用Young J.Yoo改良法測(cè)定α-淀粉酶活[7]。

1.4.3 真菌菌落、生化鑒定

采用插片法對(duì)復(fù)篩霉菌的菌落形態(tài)進(jìn)行顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，參照真菌分類鑒定手冊(cè)，初步確定菌株分類。

1.4.4 霉菌分子鑒定

采用真菌基因組DNA提取試劑盒步驟提取霉菌DNA。以上述提取的霉菌基因組DNA為擴(kuò)增模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行比對(duì)，鑒定種屬。

1.4.5 麩曲的制備應(yīng)用分析

取篩選得到的高糖化力霉菌和實(shí)驗(yàn)室保存的1株釀酒酵母，以麩皮培養(yǎng)基制備強(qiáng)化麩曲。根據(jù)酒廠的實(shí)際生產(chǎn)工藝，功能麩曲加入量占大曲總量13%，將其與粉碎的大曲一起添加到冷卻的糧醅中，其中曲占酒糟的比例為20%，加入后需充分?jǐn)嚢杈鶆颉Ｆ渲袑?shí)驗(yàn)A組為霉菌和酵母共同添加，B組和C組分別添加霉菌和酵母，D組為對(duì)照組。

將不同實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用于模擬特香型白酒釀造體系中，發(fā)酵周期為30 d，蒸餾得酒樣，并進(jìn)行分析，釀酒實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.6 酒樣指標(biāo)分析

(1)出酒率按照中國(guó)釀酒工業(yè)學(xué)會(huì)定義，按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中：m,產(chǎn)50%(vol)酒樣質(zhì)量,g;M,大米的質(zhì)量，g。

(2)酒精度按照國(guó)標(biāo) GB 5009.225—2016測(cè)量酒樣的酒精度。

(3)揮發(fā)性成分分析

A.HS-SPME條件。取5 mL酒樣于頂空瓶中，添加10 μL 4-甲基-2-戊醇內(nèi)標(biāo)溶液，萃取參數(shù)分別為5%酒精度、0.2 g/mL NaCl、萃取溫度50 ℃、萃取時(shí)間30 min。萃取結(jié)束后，插入氣相進(jìn)樣口熱解析5 min后拔出，并分析檢測(cè)。每個(gè)樣品平行3次。

B.GC-MS條件。氣相色譜柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：He；流速1 mL/min；分流比10∶1；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始。

質(zhì)譜條件：電子能量70 eV，離子源EI，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍28～500 amu，掃描方式為全掃描。

C.酒樣揮發(fā)性成分RI和含量的測(cè)定。定性分析：將正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品液體進(jìn)樣，按上述酒樣升溫程序進(jìn)行分離，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為10∶1。根據(jù)每個(gè)正構(gòu)烷烴出峰的保留時(shí)間來(lái)計(jì)算樣品組分峰的保留指數(shù)RI[8]。與質(zhì)譜庫(kù)中的化合物進(jìn)行匹配。定量分析：以內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(4-甲基-2-戊醇)的濃度、峰面積計(jì)算各揮發(fā)物的含量,重復(fù)測(cè)量3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖化霉菌的分離、篩選

從73株霉菌菌株初篩出HC較大的14株霉菌，測(cè)定其糖化酶、液化酶酶活，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，菌株NCU-69的糖化酶和液化酶酶活均高于其他菌株，液化酶活力最強(qiáng)為631.96 U/g，糖化酶活力為938.63 U/g，綜合考慮選定其為目標(biāo)菌株。

2.2 糖化霉菌的鑒定

2.2.1 霉菌的形態(tài)及鑒定

利用插片法對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，利用乳酸石碳酸棉藍(lán)染液對(duì)其染色制片，在顯微鏡下觀察的菌株形態(tài)特征如圖2所示。

圖2顯示，從形態(tài)特征上，NCU-69菌落表面為黑褐色、粉末狀，菌落生長(zhǎng)快；分生孢子頭的頂囊球形狀為近球形、黑褐色、呈放射狀排列，孢子呈鏈狀、布滿頂囊；分生孢子梗較長(zhǎng)，表面光滑、無(wú)隔，這些都符合曲霉屬的形態(tài)特征。

2.2.2 菌種的分子生物學(xué)鑒定

將獲得的NCU-69菌株的DNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合菌落形態(tài)和顯微形態(tài)，鑒定NCU-69為黑曲霉(Aspergillusniger)，命名為NCUF413.1。

2.3 糖化霉菌應(yīng)用性能分析

2.3.1 糖化霉菌酒樣理化指標(biāo)測(cè)定

將不同菌種組合麩曲強(qiáng)化大曲釀造的酒醅進(jìn)行蒸餾，測(cè)酒樣酒精度折算成出酒率，結(jié)果如表1所示。

與對(duì)照組酒樣比較，A組出酒率由26.21%提高到34.35%。其原因可能是強(qiáng)化的A.nigerNCUF413.1和S.cerevisiaeNCUF303.1協(xié)同作用，強(qiáng)化的黑曲霉分泌糖化酶和液化酶加速了對(duì)原料糖化分解，被釀酒酵母利用轉(zhuǎn)化為酒精。B組單獨(dú)用A.nigerNCUF413.1強(qiáng)化出酒率比對(duì)照組提高0.8%，這是由于A.nigerNCUF413.1水解淀粉成小分子糖還原糖，在白酒釀造過程中，為酒醅中原有釀酒酵母乙醇發(fā)酵提供了還原糖[9]，從而提高了出酒率。而C組單獨(dú)用S.cerevisiaeNCUF303.1強(qiáng)化時(shí)，出酒率卻下降了，原因可能是強(qiáng)化了釀酒酵母，在釀造前期快速生成乙醇對(duì)霉菌的生長(zhǎng)有抑制作用[10]，反而降低了淀粉的水解。

2.3.2 功能霉菌強(qiáng)化酒樣香氣成分測(cè)定

采用GC-MS對(duì)A組和對(duì)照組酒樣中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，酒醅固相微萃取物質(zhì)質(zhì)譜總離子流色譜圖如圖3所示。

將不同菌種強(qiáng)化酒樣依次測(cè)定揮發(fā)性成分，如圖3所示，3種強(qiáng)化酒樣與對(duì)照組酒樣總離子流色譜圖基本相似，各酒樣中揮發(fā)性成分峰形一致，說明不同酒樣中香氣成分種類基本一致。

對(duì)總離子流圖中的各峰與數(shù)據(jù)庫(kù)MPW2011和NIST11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合保留指數(shù)定性，不同菌種強(qiáng)化酒樣中揮發(fā)性成分的含量結(jié)果見表2。

由表2可知，經(jīng)GC-MS從A、B、C和對(duì)照組酒樣中分別鑒定出67、66、66和67種揮發(fā)性成分，只有A組黑曲霉和釀酒酵母共強(qiáng)化的酒樣與對(duì)照組中揮發(fā)性成分種類完全一致。67種揮發(fā)性成分包括酸類物質(zhì)2種，醇類物質(zhì)9種，酯類物質(zhì)36種，醛酮類物質(zhì)16種，烴類化合物4種等。其中苯乙醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯乙酸苯乙酯、苯丙酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、苯乙醛和3-糠醛的含量較高，其總離子流圖響應(yīng)值明顯高于其他物質(zhì)。相關(guān)的研究表明[37]，特香型白酒中的特征香型物質(zhì)主要為奇數(shù)脂肪酸乙酯等酯類物質(zhì)，如乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯、癸酸乙酯等，這與本次研究結(jié)果相似。

注：n.d表示未檢出或含量較低，RI≥700開始檢測(cè)

白酒中酸類、醇類、酯類和醛酮類等眾多微量呈香物質(zhì)是決定白酒風(fēng)格和質(zhì)量的關(guān)鍵因素。其中，酯類化合物是白酒產(chǎn)品中最重要的呈香物質(zhì)之一，也是酒香濃郁的主要物質(zhì)，酯類化合物在總揮發(fā)性物質(zhì)中比例高低對(duì)白酒香味濃郁起重要作用。結(jié)果表明，A.nigerNCUF413.1強(qiáng)化可提高釀造的酒樣中總酯含量，單獨(dú)黑曲霉強(qiáng)化酒樣酯類化合物含量占總揮發(fā)性物質(zhì)的70.11%，A組黑曲霉和釀酒酵母酒樣中酯類化合物含量占總揮發(fā)性物質(zhì)的71.01%，均高于對(duì)照組的62.94%。A組酒樣中丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯等酯香風(fēng)味物質(zhì)的含量均高于對(duì)照組。HUANG Y等[38]從茅臺(tái)酒大曲中分離出一株黑曲霉，通過研究該菌蛋白酶對(duì)茅臺(tái)酒香氣的影響發(fā)現(xiàn)黑曲霉產(chǎn)酶能提高酒樣中醇和酯類的含量。

3 結(jié)論

從特香型白酒大曲中篩選得到1株高糖化酶力菌株A.nigerNCUF413.1，與S.cerevisiaeNCUF303.1共同制作強(qiáng)化麩曲，按特香型白酒釀造工藝進(jìn)行強(qiáng)化釀造發(fā)現(xiàn)，出酒率由26.21%提高到34.35%，揮發(fā)性成分種類一致，其中丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯亞油酸乙酯、油酸乙酯等酯類化合物含量升高，其占總揮發(fā)性成分比例提高了8.07%。產(chǎn)糖化酶霉菌A.nigerNCUF413.1與釀酒酵母共同強(qiáng)化釀造，有助于白酒發(fā)酵中酯類物質(zhì)的產(chǎn)生，提高出酒率，提高白酒酯香風(fēng)味成分含量。