胡曉韻，何華華，彭文舫

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，省部共建生物催化與酶工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062)

0 引言

蛋白酶在自然界含量豐富，種類繁多，在一系列的細(xì)胞進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用.絕大多數(shù)蛋白酶通過切割底物序列肽鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解，或使之轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘某墒煨问?此外，一些蛋白酶還具有一些特殊功能，例如，天然存在于某些植物中的環(huán)化酶，能通過轉(zhuǎn)肽反應(yīng)將前體肽進(jìn)行環(huán)化，從而形成環(huán)肽[1].

2001至2005年，研究者通過對(duì)來源于白花蛇舌草[2]、紫羅蘭[3]、三色堇[4]和鼠鞭草[5]的cDNA進(jìn)行克隆，對(duì)環(huán)化肽前體序列進(jìn)行了預(yù)測(cè)和比對(duì).結(jié)果顯示，其環(huán)化結(jié)構(gòu)域的N末端和C末端的加工位點(diǎn)周圍有幾個(gè)氨基酸殘基具有高度保守性，如其C末端P1位點(diǎn)的天冬酰胺或天冬氨酸殘基.1996年，Philip S. Sheldon等人發(fā)現(xiàn)，洋刀豆中凝集素(concanavalin) A在分泌途徑的成熟過程與天冬酰胺內(nèi)切酶有關(guān)，該研究證實(shí)豆類中存在天冬酰胺內(nèi)切酶，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)天冬酰胺內(nèi)切酶在植物中很常見[6].2014年Giang K T Nguyen等研究發(fā)現(xiàn)，來源于蝶豆的天冬酰胺內(nèi)切酶butelase1可有效環(huán)化來自各種生物的非天然肽，證明了天冬酰胺內(nèi)切酶是天然的環(huán)化酶[7].天冬酰胺內(nèi)切酶識(shí)別的底物的C末端加工位點(diǎn)的三肽基序是必需的，通常為Asn-Gly-Leu.

環(huán)化肽是一類來源于植物的可環(huán)化多肽.在20世紀(jì)60年代, Lorents Gran指出，使用白花蛇舌草葉子制成的藥茶來誘導(dǎo)分娩并可以促進(jìn)分娩，后來的研究表明活性成分是植物中一種名為Kalata B1的多肽[8]. Kalata B1是由29個(gè)氨基酸組成的環(huán)化肽，其具有的6個(gè)半胱氨酸殘基形成的3個(gè)二硫鍵可以組成一個(gè)半胱氨酸結(jié)，以增加其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[9].隨后，越來越多的環(huán)化肽陸續(xù)在植物中發(fā)現(xiàn)，植物中的環(huán)化肽具有殺線蟲，殺軟體動(dòng)物，抗HIV，抗神經(jīng)降壓素，收縮子宮，溶血和防污等生物活性[2].

天冬酰胺內(nèi)切酶(AEPs)催化形成的環(huán)化肽具有一個(gè)環(huán)狀主鏈和一個(gè)典型的半胱氨酸結(jié)，因其結(jié)構(gòu)異常穩(wěn)定，所以可作為藥物設(shè)計(jì)框架.然而，從植物組織中不易提取天然AEP環(huán)化酶，來源于蝶豆的天冬酰胺內(nèi)切酶butelase1可有效環(huán)化來自各種生物的非天然肽，但該酶在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)未能實(shí)現(xiàn)[7].最近，研究者在白花蛇舌草互補(bǔ)DNA文庫(kù)中鑒定出3種AEP同源蛋白(OaAEP1-3)，其中，OaAEP1的一個(gè)單氨基酸突變體(Glu371Val，命名為OaAEP1b)可在大腸桿菌中重組表達(dá)，其表達(dá)量為1.8 mg/L[10].本研究通過克隆白花蛇舌草(Oldenlandiaaffinis)中AEP(OaAEP1b)環(huán)化酶編碼基因并使其在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，在大腸桿菌中利用不同的融合標(biāo)簽，例如麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)[11]，N-utilization substance A(NusA)[12]，小泛素修飾蛋白(SUMO)[13]，綠色熒光蛋白(GFP)[14]和泛素(ubiquitin)[15]來促進(jìn)其可溶性表達(dá)和純化，并驗(yàn)證其對(duì)底物肽的切割活性.本研究對(duì)AEP環(huán)化酶表達(dá)量的提高，以及對(duì)其酶活性的驗(yàn)證，將為其在肽工程中的應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌XL10-Gold、大腸桿菌BL21(DE3)、載體pET-28a、pRK792-MBP均為本實(shí)驗(yàn)室所保存.

1.1.2 試劑 DL 5000 DNA Marker、1 kb DNA Ladder及各種限制性內(nèi)切酶均購(gòu)于Takara公司；dNTPs購(gòu)于Biosharp；Marker Color Prestained Protein Standard購(gòu)于NEB公司，其余試劑均為國(guó)藥公司提供.

1.1.3 引物 根據(jù)合成的AEP(OaAEP1b)的編碼序列(NCBI:ALG36103.1)來設(shè)計(jì)引物.

1.2 方法

1.2.1 AEP環(huán)化酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 AEP基因序列合成自生工生物工程(上海)股份有限公司，并作為DNA模板，利用AEP-F/AEP-R(表1)引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收.用XhoI和NcoI對(duì)pET28a載體進(jìn)行雙酶切，切膠回收線性化載體DNA，利用T5核酸外切酶介導(dǎo)的TEDA方法[16]將AEP片段插入到酶切后的pET28a載體中.然后將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Gold感受態(tài)細(xì)胞中，待37 ℃過夜培養(yǎng)后，通過菌落PCR篩選并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證得到正確的重組質(zhì)粒pET-28a-AEP.

表1 實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物

在得到AEP環(huán)化酶的片段后，利用融合PCR將HRV 3V蛋白酶底物識(shí)別序列添加到AEP的N端，然后通過重疊延伸PCR[17]將融合標(biāo)簽和含有HRV 3V底物序列的AEP連接在一起，方法如上所示得到測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為pET-28a-gfp-AEP、pET-28a-MBP-AEP、pET-28a-Sumo-AEP、pET-28a-NusA-AEP和pET-28a-Ubiquitin-AEP.

1.2.2 AEP環(huán)化酶底物表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以基因合成含有Kalata B1-6*His-GST序列的質(zhì)粒為模板，利用MBP-S-GST-F/ MBP-S-GST--R(表1)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增得到的Kalata B1-6*His-GST片段進(jìn)行電泳檢測(cè)并溶液回收；用HindⅢ和NcoI對(duì)pRK792-MBP載體進(jìn)行雙酶切，按照1.2.1得到正確的重組質(zhì)粒命名為pRK792-MBP-Kalata B1-6*His-GST.

將收集的菌體用Lysis Buffer(50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、0.1% triton、1 mmol/L EDTA，pH7.0)進(jìn)行重懸，并加入Lysozyme混勻后于4 ℃攪拌1 h，攪拌結(jié)束后進(jìn)行超聲波破菌(功率35%，每運(yùn)行3 s停6 s，總共處理10 min)，破菌結(jié)束后將破菌液在4 ℃，轉(zhuǎn)速17 000 r/min離心30 min，去掉細(xì)菌碎片，得到更為完全的破菌上清，隨后將破菌上清進(jìn)行掛柱.

在蛋白純化柱中加入1 mL Ni-NTA His Bind resin (Takara Blo USA)，用Wash Buffer(20 mmol/L bis-Tris、200 mmol/L NaCl、20 mmol/L imidazole，pH7.0)等體積洗滌樹脂2次.當(dāng)?shù)鞍准兓械臉渲畛浜煤?，將破菌上清加入到蛋白純化柱中，靜置待樹脂沉降下來，用等體積的Wash Buffer來洗滌樹脂，反復(fù)進(jìn)行，直至破菌上清全部流經(jīng)蛋白純化柱，再用Elution Buffer(20 mmol/L bis-Tris、200 mmol/L NaCl、200 mmol/L imidazole，pH7.0)洗脫目標(biāo)蛋白.之后，對(duì)得到的樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)分析，并用Bradford法檢測(cè)AEP環(huán)化酶及其融合蛋白的濃度.同時(shí)，用Storage Buffer (5 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl，pH7.0)對(duì)純化得到的蛋白進(jìn)行等體積超濾，將純化得到的環(huán)化酶加入到已預(yù)冷的超濾管中離心，待液面不再下降后加入Storage Buffer至原始液面高度，反復(fù)3次將AEP環(huán)化酶的保存Buffer換成Storage Buffer.

1.2.4 AEP環(huán)化酶底物融合蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)與純化 如1.2.3所示，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pRK792-MBP -Kalata B1-6*His-GST轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將收集的菌體用Lysis Buffer(50 mmol/L KH2PO4、300 mmol/L KCl、10 mmol/L imidazole，pH8.0)進(jìn)行重懸.純化時(shí)用Wash Buffer(50 mmol/L KH2PO4、300 mmol/L KCl、30 mmol/L imidazole，pH8.0)等體積洗滌樹脂，在破菌上清全部加入到蛋白純化柱后，用Elution Buffer(50 mmol/L KH2PO4、300 mmol/L KCl、300 mmol/L imidazole，pH8.0)洗脫目標(biāo)蛋白.通過SDS-PAGE對(duì)純化得到的樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用Storage Buffer(5 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl，pH7.0)將純化得到的環(huán)化酶加入到已預(yù)冷的超濾管中離心，待液面不再下降后加入Storage Buffer至原始液面高度，反復(fù)3次將AEP環(huán)化酶底物融合蛋白的保存Buffer換成Storage Buffer.

1.2.5 利用HRV 3V蛋白酶移除融合蛋白質(zhì)的融合標(biāo)簽 將融合蛋白Sumo-AEP-6*His和MBP -AEP-6*His與HRV 3V蛋白酶按照摩爾比為80∶1比例混合，并加入10×buffer(50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L DTT，pH7.5)于4 ℃條件反應(yīng)過夜以保證融合蛋白被完全切割.反應(yīng)結(jié)束后將整個(gè)切割反應(yīng)體系用Ni柱進(jìn)行第二次純化，最后用Elution Buffer洗脫得到AEP環(huán)化酶.

1.2.6 AEP環(huán)化酶的活性檢測(cè) 將純化得到的AEP環(huán)化酶在Self-activation Buffer(1 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride，用冰醋酸將pH調(diào)至4.5)中于37 ℃、pH 4.5的條件下反應(yīng)5 h.在激活反應(yīng)過程結(jié)束后，將已經(jīng)激活的AEP環(huán)化酶和底物蛋白按照摩爾比為1∶5在Activity Buffer(50 mmol/L sodium acetate、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、0.5 μmol/L Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride，pH5.0)中進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，分別于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)4、12和24 h.待反應(yīng)結(jié)束后，通過SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)的切割情況.

2 結(jié)果

2.1 AEP環(huán)化酶基因的原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建以基因合成含有AEP序列的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增從而得到1 356 bp的AEP片段，如圖1所示，再進(jìn)行一輪PCR將HRV 3V蛋白酶的多肽底物識(shí)別序列擴(kuò)增到AEP的N端，然后通過重疊延伸PCR將融合標(biāo)簽和含有HRV 3V底物序列的AEP連接在一起得到含有融合標(biāo)簽的AEP片段.用XhoI和NcoI對(duì)pET28a載體進(jìn)行酶切，如圖2所示，按照1.2.1得到正確質(zhì)粒pET-28a-AEP、pET-28a-gfp-AEP、pET-28a-MBP-AEP、pET-28a -Sumo -AEP、pET-28a-NusA-AEP和pET-28a-Ubiquitin-AEP.

圖1 AEP環(huán)化酶PCR擴(kuò)增1和2均為AEP環(huán)化酶的PCR產(chǎn)物；

圖2 pET-28a載體酶切圖1：用NcoI和XhoI雙酶切的pET-28 a載體；2：未酶切的pET-28a載體；

2.2 AEP環(huán)化酶的表達(dá)與純化將AEP環(huán)化酶及其融合蛋白按照1.2.3中的方法表達(dá)并純化如圖3所示，表達(dá)的融合蛋白由四部分組成：融合蛋白標(biāo)簽、HRV 3V蛋白酶識(shí)別序列、用于親和純化的6*His標(biāo)簽和AEP環(huán)化酶.融合表達(dá)蛋白質(zhì)1(GFP+AEP)大小為：76.0 kD，融合表達(dá)蛋白質(zhì)2(SUMO+AEP)大小為：61.0 kD，融合表達(dá)蛋白質(zhì)3(MBP-AEP)大小為：92.0 kD，融合表達(dá)蛋白質(zhì)4(NusA-AEP)大小為：104.0 kD，融合表達(dá)蛋白質(zhì)5(Ubiquitin+AEP)大小為：58.0 kD.結(jié)果顯示：表達(dá)的融合蛋白質(zhì)與預(yù)測(cè)的大小一致，經(jīng)質(zhì)譜分析確定在大腸桿菌BL21(DE3)中所表達(dá)的蛋白質(zhì)為AEP環(huán)化酶，表明不同的融合蛋白質(zhì)在大腸桿菌BL21(DE3)中均有表達(dá)，并且可以通過Ni柱親和層析可以純化得到表達(dá)的融合蛋白，其中使用NusA、GFP和Ubiquitin作為融合標(biāo)簽時(shí)，對(duì)AEP環(huán)化酶的表達(dá)沒有明顯的促進(jìn)作用，而SUMO和MBP可以明顯促進(jìn)AEP環(huán)化酶的表達(dá).

2.3 利用HRV 3V蛋白酶移除融合蛋白的標(biāo)簽融合標(biāo)簽可促進(jìn)目的蛋白的可溶性表達(dá)，但在驗(yàn)證目的蛋白生物活性時(shí)，為了避免額外的氨基酸序列對(duì)目的蛋白相關(guān)特性的影響，往往需要對(duì)融合標(biāo)簽進(jìn)行去除.本研究中，我們?cè)谌诤蠘?biāo)簽和AEP環(huán)化酶之間加入了HRV 3V蛋白酶的底物識(shí)別位點(diǎn)，因此，可以按照1.2.5利用HRV 3V切割MBP-AEP-6*His融合蛋白和SUMO-AEP-6*His融合蛋白中底物序列LEVLFQ/GP來分離融合標(biāo)簽和AEP環(huán)化酶.反應(yīng)結(jié)束后將整個(gè)切割反應(yīng)體系用Ni柱進(jìn)行第二次純化.因AEP環(huán)化酶的C端含有6*His標(biāo)簽，故可以用來純化AEP環(huán)化酶，從而將融合標(biāo)簽蛋白和AEP進(jìn)行有效的分離，得到純AEP環(huán)化酶.將Elution Buffer洗脫下來的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖4)，SDS-PAGE中AEP條帶的大小與預(yù)測(cè)的49.7 kD大小一致，由此分別成功得到了去掉融合標(biāo)簽MBP和SUMO的純的AEP環(huán)化酶，并根據(jù)Bradford方法測(cè)其蛋白質(zhì)濃度，其蛋白濃度為分別為(3.6±0.05) mg/L和(2.8±0.05) mg/L.

圖3 不同融合蛋白純化的SDS-PAGE分析1：AEP-6*His； 2：GFP-AEP-6*His； 3：NusA-AEP-6*His；4：Ubiquitiniquitin-AEP-6*His；5：SUMO -AEP-6*His；6：MBP -AEP-6*His；M：蛋白預(yù)染

圖4 移除融合標(biāo)簽的AEP環(huán)化酶的SDS-PAGE分析M：蛋白預(yù)染Marker；1：移除融合標(biāo)簽MBP后的AEP環(huán)化；2：移除融合標(biāo)簽SUMO后的AEP環(huán)化

圖5 AEP環(huán)化酶底物融合蛋白純化的SDS-PAGE分析 1：第一次用Elution buffer洗脫的 AEP環(huán)化酶底物融合蛋白；2：第二次 用Elution buffer洗脫的AEP環(huán)化酶 底物融合蛋白；M：蛋白預(yù)染

2.4 AEP環(huán)化酶底物的設(shè)計(jì)、表達(dá)與純化由于AEP天然底物Kalata B1序列較短，為了方便檢測(cè)AEP對(duì)其切割活性，研究中我們?cè)诘孜?Kalata B1不變的基礎(chǔ)上，在兩端分別加上融合蛋白MBP和GST，倘若發(fā)生切割作用，底物融合蛋白會(huì)有大約26.0 kD的大小變化，這樣也就可以確定AEP環(huán)化酶是否有活性，按照1.2.4對(duì)AEP環(huán)化酶底物融合蛋白進(jìn)行表達(dá)純化，如圖5所示，AEP環(huán)化酶底物融合蛋白的大小為74 kD，SDS-PAGE中條帶的大小與預(yù)測(cè)的大小一致，因此我們得到了底物融合蛋白質(zhì)，并進(jìn)行了較好的純化.

2.5 AEP環(huán)化酶的活性檢測(cè)Kalata B1的前體結(jié)構(gòu)經(jīng)驗(yàn)證是具有可折疊的環(huán)化結(jié)構(gòu)域，可以用來作為AEP環(huán)化酶的底物.AEP環(huán)化酶識(shí)別其C末端的天冬酰胺(N)-甘氨酸(G)-亮氨酸(L) 3個(gè)氨基酸，并在天冬酰胺和甘氨酸之間發(fā)生切割，C端切割后暴露的-COOH與自由存在的N端-NH3進(jìn)行連接并發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，使線性化的多肽底物成為一個(gè)環(huán)肽,本研究在底物Kalata B1的兩端分別加上融合蛋白MBP和6*His-GST，因AEP環(huán)化酶作用在位于底物多肽C端的氨基酸N和G之間，因此當(dāng)AEP環(huán)化酶與融合底物作用后，通過比較融合蛋白的大小變化即可判斷AEP環(huán)化酶是否可以在這種形式的融合蛋白質(zhì)中起作用.

將移除融合標(biāo)簽MBP后純化得到的AEP環(huán)化酶在激活緩沖液中于37 ℃，pH 4.5的條件下反應(yīng)5 h，在激活反應(yīng)過程結(jié)束后，將已經(jīng)激活的AEP環(huán)化酶和底物融合蛋白按照摩爾比1∶5在反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，于37 ℃水浴鍋中做不同時(shí)間切割反應(yīng)： 4、12和24 h，并在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)底物融合蛋白切割情況.如圖6所示，AEP環(huán)化酶對(duì)Kalata B1的C末端有切割作用，根據(jù)Image J定量計(jì)算顯示，在反應(yīng)4 h時(shí)AEP環(huán)化酶可切割16.5%的底物蛋白，在反應(yīng)12 h時(shí)AEP環(huán)化酶可切割44%的底物蛋白，在反應(yīng)24 h時(shí)AEP環(huán)化酶可切割66.2%的底物蛋白.AEP環(huán)化酶底物融合蛋白的大小為74 kD，在與AEP環(huán)化酶反應(yīng)后，底物融合蛋白會(huì)被切割為大小分別為46.3 kD的MBP-N端Kalata B1，和28.1 kD的GST-C端Kalata B1.由于環(huán)化結(jié)構(gòu)域的線性狀態(tài)大小為3.2 kD，因分子量太小，無法在SDS-PAGE上看到蛋白質(zhì)條帶.

3 討論

天冬酰胺內(nèi)切酶(AEP)是一種半胱氨酸蛋白酶，在植物中分布廣泛，現(xiàn)在已經(jīng)證明了天冬酰胺內(nèi)切酶是天然的環(huán)化酶，AEP在低pH條件下移除N-末端和C-末端前結(jié)構(gòu)域而被加工成其成熟形式[18]，其催化形成的環(huán)化肽是來源于植物的可環(huán)化多肽，在結(jié)構(gòu)上除了它們的環(huán)狀主鏈外，還具有由其6個(gè)保守的半胱氨酸殘基形成的3個(gè)二硫鍵的半胱氨酸結(jié)，這種結(jié)構(gòu)特征的組合使得它們異常穩(wěn)定，因此可作為藥物設(shè)計(jì)應(yīng)用的潛在支架或蛋白質(zhì)工程框架.

OaAEP1b是從產(chǎn)生環(huán)化肽的植物白花蛇舌草的基因組中鑒定出的AEP同種型，與其他天冬酰胺內(nèi)切酶(AEP)具有相似的結(jié)構(gòu)折疊.本研究通過在大腸桿菌中利用不同的融合標(biāo)簽促進(jìn)AEP環(huán)化酶的可溶性表達(dá)，之后通過移除融合標(biāo)簽得到表達(dá)量較高的AEP環(huán)化酶，其表達(dá)量為(3.6±0.05) mg/L，高于原先文獻(xiàn)報(bào)道的1.8 mg/L；對(duì)于AEP環(huán)化酶的活性驗(yàn)證，AEP環(huán)化酶的活化過程應(yīng)該分為兩個(gè)部分，先切割后環(huán)化，本研究證明了其可對(duì)kalata B1前體蛋白的C末端進(jìn)行切割，在之后的實(shí)驗(yàn)中將通過構(gòu)建一種串聯(lián)底物來驗(yàn)證環(huán)化活性，由于SUMO蛋白質(zhì)大小為11.0 kD，除了能夠較好地在SDS-PAGE中觀察到并且具備環(huán)化的可能性，選取SUMO作為環(huán)化底物，在其兩端分別加上較長(zhǎng)的linker和AEP環(huán)化酶的識(shí)別序列，并在C端的較長(zhǎng)的linker和AEP環(huán)化酶的識(shí)別序列之間加入TEV蛋白酶的底物序列，在與AEP環(huán)化酶作用后利用TEV蛋白酶對(duì)反應(yīng)后底物進(jìn)行切割，根據(jù)切割后底物大小的變化或者條帶數(shù)量來鑒定是否環(huán)化，并定量分析從而確定環(huán)化效率.在進(jìn)一步確定AEP環(huán)化酶的環(huán)化活性后，利用AEP環(huán)化酶對(duì)人工設(shè)計(jì)的活性肽進(jìn)行環(huán)化，對(duì)于提高其穩(wěn)定性和延長(zhǎng)其半衰期具有極其重要的應(yīng)用意義.