陳剛，李子寅，邵彪＊

（1.南通市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇南通 226011；2.蘇州蔻美新材料有限公司，江蘇蘇州 215163）

生物傳感器是檢測(cè)領(lǐng)域中一種重要的工具，它通過(guò)將生物識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換元件結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物成分的分析和監(jiān)測(cè)，具有選擇性好、無(wú)需試劑、操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)使用及在線分析等優(yōu)點(diǎn)[1]。近年來(lái)，各種基于不同原理的生物傳感器被開發(fā)并用于醫(yī)療診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品檢驗(yàn)等領(lǐng)域[2]，其中，一種利用免疫原理和表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）相結(jié)合的技術(shù)受到了廣泛的關(guān)注[3-5]。SPR利用了金屬薄膜的表面等離子體共振效應(yīng)，通過(guò)在晶片表面修飾生物分子識(shí)別膜，當(dāng)待測(cè)樣品流過(guò)芯片表面時(shí)，樣品中的目標(biāo)分子與生物分子識(shí)別膜的相互作用會(huì)引起金膜表面折射率變化，從而引起SPR角的變化，通過(guò)檢測(cè)SPR角度變化，可以獲得被分析物的濃度、親和力、動(dòng)力學(xué)常數(shù)和特異性等信息[6]。

基于抗體-抗原免疫反應(yīng)的SPR晶片由于其較高的特異性和測(cè)量精度，具有良好的發(fā)展前景[7-9]。然而，SPR的應(yīng)用依賴于晶片在高度復(fù)雜介質(zhì)中的穩(wěn)定性。例如，在附著抗體的表面上，金表面極易與血清蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合,這種分子與表面的非特異性結(jié)合會(huì)影響目標(biāo)分析物的信號(hào)[10]。因此，為了獲得相對(duì)穩(wěn)定和靈敏的測(cè)量結(jié)果，一些研究使用生物相容性聚合物對(duì)SPR晶片進(jìn)行修飾，并證明通過(guò)生物相容性的修飾可減少SPR用于尿液、血液和血清中目標(biāo)分子分析的非特異性結(jié)合[11-14]。

本研究使用了一種2-甲基丙烯酸羥乙酯、2-甲基丙烯酰氧乙基氧羰基對(duì)苯疊氮、多乙二醇甲基丙烯酸酯基對(duì)硝基苯酚甲酯共聚物（PHMP）作為SPR傳感器涂層，該涂層在為抗體提供結(jié)合位點(diǎn)的同時(shí)減少了SPR晶片表面的非特異性結(jié)合，從而有助于SPR晶片在復(fù)雜生物質(zhì)環(huán)境中實(shí)現(xiàn)較高靈敏度和精確度的分析。

1 材料與方法

1.1 材料

2-甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA）、氯化亞砜、對(duì)疊氮苯甲酸、對(duì)硝基苯酚氯甲酯（NPC）、3-巰基丙酸乙酯，購(gòu)自Sigma Aldrich；多乙二醇甲基丙烯酸酯，購(gòu)自NOF有限公司。三乙胺（TEA）為89℃蒸餾精制后使用，其余溶劑試劑均為分析純且無(wú)需進(jìn)一步純化。

1.2 2-甲基丙烯酰氧乙基氧羰基對(duì)苯疊氮（MPAz）的合成

將亞硫酰氯（37 g，0.10 mol）和對(duì)疊氮苯甲酸（12 g，0.080 mol）加入到苯（74 g，0.90 mol）中并在80℃加熱4 h。過(guò)濾后，減壓蒸餾除去苯和亞硫酰氯，將得到的對(duì)疊氮苯甲酰氯溶解在石油醚（60 g）中并過(guò)濾除去未反應(yīng)的對(duì)疊氮苯甲酸。減壓蒸餾除去石油醚以獲得對(duì)疊氮苯甲酰氯。將對(duì)疊氮苯甲酰氯（9.0 g，0.050 mol）、氯仿（90 mL）加入300 mL三頸圓底燒瓶，在0℃下逐滴加入HEMA（0.050 mol）和TEA（0.050 mol）并在室溫下攪拌反應(yīng)12 h。使用含有氯化氫（0.050 mol）的水洗除去未反應(yīng)的HEMA和TEA，含有MPAz的氯仿溶液經(jīng)無(wú)水硫酸鎂脫水后過(guò)濾，并減壓蒸餾除去氯仿，得到黃色油狀液體MPAz。

1.3 多乙二醇甲基丙烯酸酯基對(duì)硝基苯酚甲酯（PEMN）單體的合成

將NPC（20.2 g，0.10 mol）、氯仿（180 mL）加入500 mL三頸圓底燒瓶，在0℃下逐滴加入多乙二醇甲基丙烯酸酯（乙二醇聚合度為10，65.1 g，0.10 mol）和TEA（0.10 mol）并在室溫下攪拌反應(yīng)12 h，使用含有氯化氫（0.050 mol）的水洗除去未反應(yīng)的多乙二醇甲基丙烯酸酯和TEA，使用乙醚沉淀得到黃色油狀液體PEMN。

1.4 聚合物PHMP的合成

聚合物PHMP可通過(guò)常規(guī)的自由基聚合反應(yīng)獲得，聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。將HEMA、MPAz、PEMN單體溶解在乙醇中，加入引發(fā)劑AIBN，聚合反應(yīng)在65 ℃進(jìn)行12 h。聚合物通過(guò)加入到過(guò)量的乙醚和氯仿（3/1體積）中沉淀純化。聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過(guò)1HNMR確定，聚合物的分子量通過(guò)凝膠滲透色譜法（GPC）測(cè)量，含有10 mmol/L溴化鋰的甲醇和水的混合物（7/3體積）用作洗脫劑。

圖1 PHMP的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.5 光誘導(dǎo)枝接在金表面制備聚合物涂層

本研究使用鍍金二氧化硅襯底（在二氧化硅表面濺射10 nm鉻和100 nm金）用于聚合物涂層的表征。使用氧等離子體處理10min清潔表面，將基底浸入EMP的乙醇溶液（20 mmol/L）中8 h，使用乙醇和去離子水沖洗除去過(guò)量的EMP。將含有0.5%質(zhì)量百分比的PHMP乙醇溶液滴加在基底表面，通過(guò)1 min的紫外線照射（254 nm，80 mW/cm2）制備聚合物涂層。用乙醇和去離子水交替沖除去未枝接的聚合物。

1.6 在聚合物涂層表面結(jié)合抗體

將抗促甲狀腺激素（anti-TSH）鼠免疫球蛋白（IgG）濃度為20 μg/mL的PBS（pH=8.4，濃度為0.1 mol/L）滴加在聚合物涂層修飾的表面，在25 ℃保持10 h后PBS（pH=7.0，濃度為0.1 mol/L）和去離子水交替沖洗表面。表面元素組成分析通過(guò)X光電子能譜（XPS，聚焦單色鎂KαX光源）進(jìn)行。

1.7 SPR晶片的制備及表征

按1.5、1.6的步驟處理鍍金SPR晶片并結(jié)合抗體。為了驗(yàn)證聚合物涂層對(duì)非特異性結(jié)合的抑制作用，分別使用未經(jīng)處理和處理后的SPR晶片，以0.5 mL/min的流速注入含10 mg/mL的牛血清蛋白（BSA）溶液，監(jiān)控SPR角度的變化。特異性結(jié)合的驗(yàn)證則使用修飾過(guò)的晶片，將含有500 ng/mL TSH的牛血清蛋白（BSA，10 mg/mL）溶液以0.5 mL/min的流速注入，并以不含TSH的BSA溶液作為對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物合成

聚合物PHMP可通過(guò)自由基聚合合成，合成結(jié)果總結(jié)在表1中。聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)由1HNMR譜圖中化學(xué)位移為3.7 ppm（與羥基相鄰的亞甲基）、7.0 ppm（與疊氮相鄰的苯環(huán)）、8.9 ppm（與硝基相鄰的苯環(huán)）的峰確定。

表1 PHMP的合成結(jié)果

2.2 XPS表征

如圖2所示，晶片表面的元素組成信息由XPS提供。N1s的峰在未經(jīng)處理的晶片表面不存在，而在聚合物修飾后的表面則在400.1eV和406.7eV處有兩個(gè)峰，分別來(lái)自于疊氮反應(yīng)后生成的酰胺和PEMN中的硝基。而在搭載有抗體的晶片表面，N1s的峰出現(xiàn)在401.1eV處，來(lái)自于抗體中的酰胺。這一結(jié)果證實(shí)了可通過(guò)光反應(yīng)枝接和活性酯的胺解依次將聚合物和抗體結(jié)合在金襯底表面。

圖2 晶片表面的XPS圖譜（N1s）

2.3 聚合物涂層對(duì)非特異性結(jié)合的抑制作用

為了在復(fù)雜生物質(zhì)環(huán)境中使用SPR傳感器，必須減少來(lái)自血液或體液中生物分子非特異性結(jié)合的信號(hào)。未經(jīng)處理的SPR傳感器在復(fù)雜生物質(zhì)環(huán)境中很容易由于生物分子的非特異性結(jié)合而失效。在本實(shí)驗(yàn)中，BSA溶液流過(guò)未經(jīng)處理的SPR傳感器時(shí)，非特異性結(jié)合引起的SPR角度變化約為0.217°（圖3A），該信號(hào)為抗體-抗原結(jié)合信號(hào)的10～20倍，致使目標(biāo)分子的信號(hào)難以從待測(cè)物中區(qū)分。而BSA溶液流過(guò)表面修飾過(guò)的SPR傳感器時(shí)，非特異性結(jié)合引起的SPR角度變化約為0.035°（圖3B），證明聚合物涂層有效減少了來(lái)自BSA的非特異性結(jié)合。

圖3 BSA注入SPR晶片引起的SPR角變化

2.4 抗體與TSH的特異性結(jié)合

當(dāng)TSH和BSA混合溶液注入SPR晶片時(shí)，TSH與抗體的特異性結(jié)合和BSA的非特異性結(jié)合共同引起SPR角的變化。在扣減非特異性結(jié)合的信號(hào)后，得到的TSH信號(hào)如圖4所示，可見(jiàn)500 ng/mL的TSH引起的SPR角變化為0.0147°，SPR晶片的性能因數(shù)（Performance Factor，PF）可以用特異性結(jié)合角度變化與非特異性結(jié)合角度變化的比值來(lái)衡量，在此實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)涂層修飾的SPR晶片的性能因數(shù)為0.42。

圖4 TSH+BSA注入有涂層的SPR晶片引起的SPR角變化（已扣減非特異結(jié)合的信號(hào)）

3 結(jié)論

本研究合成了一種親水性聚合物PHMP并將其通過(guò)光反應(yīng)枝接的方法用于SPR晶片表面修飾。實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過(guò)修飾的鍍金SPR晶片能夠減少蛋白質(zhì)與晶片表面的非特異性結(jié)合。本研究進(jìn)一步將修飾后的SPR晶片搭載TSH抗體并用于模擬體液中TSH的檢測(cè)，經(jīng)實(shí)測(cè)，該方法得到的SPR晶片性能因數(shù)為0.42。