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小花棘豆Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因的Southern blot檢測分析

2020-01-06 07:29珠麗盧萍席領(lǐng)軍高峰李玉玲姜凱
生物化工 2019年6期
關(guān)鍵詞:泳道內(nèi)生探針

珠麗,盧萍,席領(lǐng)軍,高峰,李玉玲,姜凱

(內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010022)

小花棘豆(Oxytropis glabra DC.)是豆科棘豆屬多年生草本植物,許多植株內(nèi)含生物堿苦馬豆素(swainsonine,SW),國際上將含SW的棘豆屬(Oxytropis)、黃芪屬(Astragalus)等有毒植物統(tǒng)稱為瘋草,而SW是引起動物瘋草病的唯一毒素[1]。SW陽離子半椅式構(gòu)象與甘露糖陽離子構(gòu)象類似,可與甘露糖苷競爭性結(jié)合抑制α-甘露糖苷酶Ⅰ和高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性[2],造成細胞功能紊亂,使牲畜出現(xiàn)中毒癥狀,嚴重時致死。通過對小花棘豆的研究發(fā)現(xiàn),凡能夠分離或檢測到Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌的植株均含SW,且體外培養(yǎng)該內(nèi)生真菌合成了SW,從而提出小花棘豆的SW毒性由該內(nèi)生真菌引起。

瘋草內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因(saccharopine reductase gene,sac)編碼酵母氨酸還原酶[3-4]催化賴氨酸轉(zhuǎn)化為酵母氨酸后,生成的α-氨基己二酸半醛是內(nèi)生真菌合成SW的一個重要前體[5]。前期實驗中克隆到A.oxytropis的sac cDNA(KJ944635)和基因(KY052048),獲得sac缺失突變體M1,發(fā)現(xiàn)酵母氨酸還原酶促進真菌SW的合成。

Southern blot由Southern[6]于1975年創(chuàng)建,是分析基因結(jié)構(gòu)和檢測特定DNA片段的經(jīng)典技術(shù),可檢測外源目的基因是否已轉(zhuǎn)入并整合到生物染色DNA上,同時可對外源片段拷貝數(shù)進行分析。Southern blot中使用的標記探針有放射性同位素和非放射性兩類,其中放射性探針靈敏度較高,但半衰期短,且有放射性輻射;非放射性標記又分為生物素標記和地高辛標記,非同位素標記探針可避免放射性危害,且由于生物體內(nèi)沒有地高辛,可更好地消除內(nèi)源背景,應(yīng)用效果更好[7]。

Southern blot操作程序繁瑣,對基因組DNA的提取、純化、酶切等均有較高要求,要獲得理想雜交結(jié)果需反復(fù)摸索,雖可使用相關(guān)試劑盒,但需根據(jù)具體情況優(yōu)化雜交方案。本研究利用PCR制備地高辛(DIG)標記探針,并對Southern blot方法進行了探索和優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌種

供試菌種:小花棘豆A.oxytropis內(nèi)生真菌野生株OW7.8和sac缺失突變株M1由本實驗室提供。

1.1.2 主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒,購自Axygen;真菌基因DNA 提取試劑盒、核酸共沉劑、限制性酶、6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker,購自Takara;核酸染料購自Bio TAQ;DIG標記試劑盒、Hyb高效雜交液,購自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技;氨芐青霉素、潮霉素 B,購自sigma;其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺ZHJH-1109 型,上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn);真菌培養(yǎng)箱MGC-350BP-2型,上海一恒科技有限公司生產(chǎn);冷凍離心機3-18K/D-37520 型,德國 SIGMA生產(chǎn);超微量測濃儀Q5000型,美國 Quawell生產(chǎn);PCR 擴增儀050-810Tgradient48 型,德國Biometra-grandien生產(chǎn);全自動高壓滅菌鍋HVE-50 型,日本 HIRAYAMA生產(chǎn);電泳儀BG-Power 600型,北京百晶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);凝膠成像系統(tǒng)BG-gds AUTO,北京百晶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);超聲波清洗器PS-20,潔康超聲波設(shè)備有限公司生產(chǎn);Hybridization oven OV4000,德國耶拿分析儀器公司生產(chǎn);隔水培養(yǎng)箱GH6000,天津泰斯特儀器生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 PCR法制備DIG標記探針

根據(jù)內(nèi)生真菌sac中間序列設(shè)計特異性引物DSF/DSR和SEMF/SEMR,以pTOPO-sac1(含內(nèi)生真菌sac)為模板制備野生型探針。PCR反應(yīng)體系為:pTOPO-sac11.0 μg,10×PCR Buffer 2.0 μL,DigdUTP 1.0 μL,rTaq酶1.0 μL,上下游引物各1.0 μL(10 μmol/L),ddH2O補足至20 μL。引物DSF/DSR的PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s; 57 ℃30 s;72 ℃ 1 min,30次循環(huán);72 ℃ 10 min。引物SEMF/SEMR的PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,(95 ℃30s,62 ℃ 30s,72 ℃ 30s)×30,72 ℃ 10 min。

根據(jù)pCB1003(含hph)質(zhì)粒上的hph序列設(shè)計特異性引物HGF/YGR,以質(zhì)粒為模板制備突變型探針。PCR反應(yīng)體系除模板其余與上面體系相同。PCR反應(yīng)條件與DSF/DSR的相同。引物序列見表1。

在做標記反應(yīng)的同時,做一個相同體系非標記PCR。反應(yīng)結(jié)束后取標記和非標記PCR的擴增產(chǎn)物進行電泳檢測(1%瓊脂糖),剩余探針保存于-20 ℃,用于后續(xù)實驗。

表1 PCR引物序列

1.2.2 基因組DNA提取、酶切與轉(zhuǎn)膜

(1)真菌基因組DNA提取

將OW7.8和M1接種于PDA培養(yǎng)基上,M1培養(yǎng)基含潮霉素B(終濃度為50 μg/mL),接種后置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。

刮取50 mg菌絲體放入預(yù)冷研缽中,加液氮迅速研磨至粉末,后置離心管中,加500 μL 4×CTAB提取液(含1% β-巰基乙醇)、4 μL RNase(100 mg /mL)充分搖勻,65 ℃水浴保溫40 min,再加等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)混勻,4 ℃12000r/min離心5 min。在上清液中加2.5倍體積預(yù)冷無水乙醇,4℃12000r/min離心15 min,棄上清液。70%乙醇離心洗滌兩次,4℃12000r/min離心5 min,棄上清液,80℃烘10 min,加100μL ddH2O,37 ℃水浴1 min,測定DNA濃度及OD值,取5μL進行電泳檢測。

(2)基因組DNA限制酶切反應(yīng)

選擇限制性內(nèi)切酶Eco RⅤ、Pst Ⅰ、Pci Ⅰ、PvuⅡ進行酶切反應(yīng),總體積50 μL,反應(yīng)體系見表2和表3?;蚪MDNA終濃度調(diào)至20 ng,于37 ℃酶切12 h,視情況延長反應(yīng)時間至完全酶切,65 ℃保溫10 min,停止反應(yīng)。使用核酸共沉劑進行酶切產(chǎn)物的純化和濃縮,用瓊脂糖凝膠電泳檢測(0.8%)。

表2 OW7.8基因組DNA酶切反應(yīng)體系

(3)轉(zhuǎn)膜和固定

向上毛細管轉(zhuǎn)移20 h以上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用凝膠成像系統(tǒng)檢測效果。取膜,切右上角標示方向。將尼龍膜浸入6×SSC溶液中5 min,80 ℃烘烤2 h,進行膜固定,固定后用于雜交。

表3 突變株株基因組DNA酶切反應(yīng)體系

1.2.3 Southern blot

加Hyb高效雜交液50 ℃預(yù)雜交3 h(15 r/min)以封閉非特異性位點。標記好的探針(25 ng/mL)沸水浴10 min后立即冰浴10 min備用。倒掉預(yù)雜交液,加入50 ℃ 5 mL Hyb高效雜交液及變性地高辛標記探針(1~3 μL/膜,5~20 ng探針/mL Hyg雜交液)混勻,50 ℃雜交過夜。

取出尼龍膜50 ℃水浴震蕩洗滌,室溫封阻尼龍膜30 min、結(jié)合抗體30 min、洗抗體兩次(15 min/次),加300μL NBT/BCIP顯色底物于37 ℃培養(yǎng)箱中避光顯色20 h后,短時間暴露于光下用50 mL ddH2O洗膜5 min,停止顯色,拍照記錄[8-12]。

2 結(jié)果

2.1 PCR法制備地高辛(DIG)標記探針

內(nèi)生真菌sac探針電泳結(jié)果如圖1所示,泳道1為非標記sac PCR反應(yīng)產(chǎn)物,泳道2為DIG標記的sac探針,其電泳條帶約709 bp,與預(yù)期結(jié)果相同。hph探針電泳結(jié)果如圖2所示,泳道1為DIG標記的hph探針,泳道2為同樣條件下的非標記PCR反應(yīng)產(chǎn)物,電泳條帶約879 bp,與預(yù)期結(jié)果相同。標記反應(yīng)PCR產(chǎn)物中帶非同位素的配體(生物素、地高辛等),其電泳遷移率慢于非標記PCR產(chǎn)物。

圖1 OW7.8探針DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 M1探針DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 OW7.8及M1基因組DNA限制性酶切與轉(zhuǎn)膜

將提取的OW7.8和M1基因組DNA(終濃度為20.75±7.64 μg)用Eco RⅤ、Pst Ⅰ、Pci Ⅰ和Pvu Ⅱ限制酶進行切割,酶切產(chǎn)物濃度為202.6±13.8 ng/μL,OD 260/OD 280在1.88~2.01,電泳結(jié)果如圖3所示。其中泳道1為野生株基因組DNA,泳道2、3為用限制酶Eco RⅤ、Pst Ⅰ酶切OW7.8基因組DNA后產(chǎn)物,由圖可見酶切后泳道呈彌散狀,無明顯條帶,說明酶切效果較好。泳道4、5為使用限制酶為Pci Ⅰ、Pvu Ⅱ酶切M1基因組DNA后的產(chǎn)物,結(jié)果顯示泳道4酶切反應(yīng)不完全,泳道5酶切反應(yīng)完全。分別將OW7.8基因組用限制酶Eco RⅤ再進行酶切,將M1基因組用限制酶PciⅠ再進行酶切,結(jié)果如圖4,可看到酶切反應(yīng)進行徹底。轉(zhuǎn)膜后觀察凝膠結(jié)果如圖5,凝膠上沒有任何殘留DNA,說明酶切產(chǎn)物已全部移至尼龍膜。

圖3 基因組DNA酶切產(chǎn)物

圖4 基因組DNA酶切產(chǎn)物

圖5 轉(zhuǎn)膜后的凝膠

2.3 Southern blot

由內(nèi)生真菌sac特異性探針與M1基因組DNA和OW7.8基因組DNA酶切產(chǎn)物進行Southern blot試驗,結(jié)果如圖6所示。泳道1表示sac探針與Pvu Ⅱ切割M1基因組DNA雜交,雜交結(jié)果呈陰性,表明M1中sac已被敲除;泳道2和3分別用Eco RⅤ和Pst Ⅰ切割OW7.8基因組DNA進行雜交,雜交結(jié)果呈陽性,說明野生株有sac,且基因的拷貝數(shù)為1。

由hph特異性探針與M1基因組DNA和OW7.8基因組DNA酶切產(chǎn)物進行Southern blot試驗,結(jié)果如圖7所示。泳道1表示hph探針與Pvu Ⅱ切割M1基因組DNA雜交,發(fā)現(xiàn)M1雜交結(jié)果呈陽性,說明標記基因hph成功整合到M1基因組中;泳道2和泳道3分別用hph特異性探針與Eco RⅤ和Pst Ⅰ切割的OW7.8基因組DNA雜交,結(jié)果呈陰性,OW7.8基因組中無hph,M1中sac已被敲除,且標記基因hph已整合到基因組上。

圖6 野生型探針雜交

圖7 突變型探針雜交

3 討論與結(jié)論

Southern blot過程較繁瑣,需注意細節(jié)頗多,本研究用PCR法制備DIG標記探針時設(shè)計了6對特異性引物,經(jīng)優(yōu)化選擇出兩對特異性高且擴增產(chǎn)物長度適宜的引物,發(fā)現(xiàn)若擴增產(chǎn)物低于300 bp,則DIG摻入較少,而探針過長則DIG摻入過多,導(dǎo)致非特異性雜交。張明琴等[8]用900 bp探針進行雜交,雜交信號較強。另外,在探針標記前要優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,包括引物、退火溫度、延伸時間、模板量等,減少非特異性擴增,從而降低雜交背景值,避免出現(xiàn)假陽性。

Southern blot對基因組DNA的質(zhì)量要求高,本研究在CTAB法基礎(chǔ)上進行了改進[9],菌絲研磨要充分快速(2 min內(nèi)),避免降解;渦旋振蕩使菌絲與裂解液混勻,使DNA充分釋放。對裂解時間也進行了探索,發(fā)現(xiàn)40 min利于基因組DNA釋放。

實驗中在45~65 ℃范圍內(nèi)設(shè)置了5個溫度,發(fā)現(xiàn)50 ℃時雜交效果最好。雜交膜的選擇也相當(dāng)重要,試驗發(fā)現(xiàn)使用尼龍膜比硝酸素纖維膜的雜交信號強。雜交液純度也會影響雜交結(jié)果,分別用過濾前后的雜交液進行雜交,發(fā)現(xiàn)過濾后的雜交背景低、無假陽性、雜交信號較強,而未過濾雜交液則背景值高、無雜交信號。雜交膜用TE漂洗2次后封存,膜干燥或久置后,信號將會有所減弱或褪色,但經(jīng)TE潤濕后仍然會重現(xiàn)原有的雜交信號[10]。

Hyb高效雜交液適合在帶正電荷尼龍膜上進行Southern和Northern雜交分析,其獨特配方和操作規(guī)程僅需雜交6~12 h,而常規(guī)雜交則需要12~24 h。另外,Hyb高效雜交液能明顯降低背景,使Southern膜上單拷貝基因和Northern膜上低拷貝RNA得以檢出,也適于各類cDNA表達芯片雜交和探針標記。

設(shè)計DIG標記探針,利用Southern blot技術(shù)檢測了小花棘豆內(nèi)生真菌OW7.8和M1菌株,結(jié)果表明OW7.8中有sac中間序列,而在M1中被hph替換,說明sac已被敲除。sac基因以單拷貝形式存在于OW7.8基因組中。

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