楊陽(yáng)，李祥松，郭倩

（1.大同大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009；2.北京索萊寶科技有限公司，北京 101102）

刺梨是我國(guó)貴州省等地的特產(chǎn)薔薇科植物，其果實(shí)成熟后散發(fā)出濃烈的香味，外形多數(shù)為橢圓球狀，表面長(zhǎng)有很多類似仙人掌外殼的小刺，故被稱為“刺梨”[1]。刺梨富含多維生素P（蘆?。┖蚐OD（超氧化物歧化酶），含量遠(yuǎn)超其它水果，是世界上已知水果中含量最高的品種[2]。蘆丁又稱蕓香苷、維生素P，屬于維生素類藥，有研究證明蘆丁是提高心腦血管疾病治療效果的關(guān)鍵[3]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)堿提取、酸沉淀法提取刺梨中的蘆丁，有效測(cè)定其蘆丁含量，并選用3種菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，為刺梨的應(yīng)用、蘆丁新資源的開(kāi)發(fā)以及抗菌藥物的研發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：刺梨干果（產(chǎn)地：貴州），蘆丁對(duì)照品（江西佰草源生物科技有限公司），飽和石灰水、濃鹽酸12 mol/L、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（分析純）、乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）均來(lái)自鑫順源科貿(mào)有限公司。水（重蒸水）、瓊脂、蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉均來(lái)自北京索萊寶科技有限公司。大腸埃希氏菌（ATCC8739）（青島綠谷有限公司）、金黃色葡萄球菌（CMCC26003）（招遠(yuǎn)拓普生物工程有限公司）、枯草芽孢桿菌（CMCC63501）（招遠(yuǎn)拓普生物工程有限公司）。

儀器：UV725紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司），100SD超聲波清洗器（深圳市超潔科技實(shí)業(yè)有限公司），SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵（長(zhǎng)沙明杰儀器有限公司），TopPette移液槍(濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司)，DH-600AS電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市恒諾利興科技公司），JM-B電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司），YXQ-30SII高壓滅菌鍋（上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁的提取與精制

實(shí)驗(yàn)采用堿提取、酸沉淀法提取與精制蘆丁。稱取刺梨3g，在乳缽中研磨至粉末狀，放于100 mL燒杯中，加入30 mL飽和石灰水（以棉花過(guò)濾至澄清），調(diào)節(jié)pH至7～8，期間不斷攪拌，加熱煮沸15 min，趁熱以棉花過(guò)濾（過(guò)濾前應(yīng)將棉花用水充分潤(rùn)濕，趕出其中的氣泡）。向殘余物中添加飽和石灰水至pH為7～8，在煮沸條件下攪拌10 min，趁熱過(guò)濾，防止Ca(OH)2析出使液體變渾濁。將兩次得到的濾液混合、放冷。向冷卻后的濾液中緩慢添加濃鹽酸，并用玻璃棒攪拌，調(diào)節(jié)pH至3～4，放置24h以上后倒出上清液，將剩下的溶液殘?jiān)闉V，并用蒸餾水將其pH洗至5～6。此法操作簡(jiǎn)單，適合工業(yè)大量生產(chǎn)，但實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要控制好pH，防止因提取過(guò)程中蘆丁溶解不足或再次溶解，影響蘆丁的提取率[4]。

對(duì)粗提取物進(jìn)行二次提取，加入30 mL的重蒸水進(jìn)行加熱，加入飽和石灰水使得pH調(diào)節(jié)至8～9，使蘆丁充分溶解，趁熱過(guò)濾，防止Ca(OH)2析出使液體變渾濁。使濾液自然冷卻，向?yàn)V液中加鹽酸調(diào)節(jié)pH至4～5后靜置，抽濾沉淀，再用蒸餾水將其pH洗至5～6。

1.2.2 蘆丁含量測(cè)定

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

稱取蘆丁對(duì)照品20 mg，用60%的乙醇溶液超聲處理使其溶解，配制成濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)液的制備

如表1所示，配置5個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和1個(gè)空白溶液。添加試劑后，用30%乙醇溶液定容至25 mL，混合均勻，靜置6 min，用紫外分光光度計(jì)在510nm處測(cè)定吸光度值。

表1 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.2.2.3 樣品測(cè)定

移液管量取濃度為0.2 mg/mL（標(biāo)示濃度）的蘆丁提取液5.0mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法同樣置于25 mL容量瓶中，依次添加試劑，最后在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。蘆丁含量的計(jì)算方法為：

1.2.2.4 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將蘆丁待測(cè)液每間隔1 h測(cè)量一次吸光度值并記錄，共測(cè)量5次。期間要注意常溫保存，并避免陽(yáng)光直接照射

1.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)(紙片擴(kuò)散法)

1.2.3.1 抑菌藥液的制備

用無(wú)菌水將蘆丁提取物分別配制成5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL的溶液，放置備用。

1.2.3.2 接種和紙片貼放

準(zhǔn)備好固體培養(yǎng)基，分別稱取胰蛋白10g、酵母提取物5g和NaCl 10g,置于燒杯中；加入800ml蒸餾水于燒杯中，用玻璃棒攪拌，使藥品全部溶化；用1MNaOH調(diào)PH至7.2；將溶液倒入量筒中，加入15 g瓊脂粉，補(bǔ)加蒸餾水1L；高壓蒸汽滅菌20 min；待培養(yǎng)基溫度降至50℃時(shí)，在超凈臺(tái)上加入所需抗生素，搖勻；鋪板，90 mm直徑的培養(yǎng)皿約需20 ml培養(yǎng)基；待培養(yǎng)凝固（約10分鐘后），將平板倒置，4 ℃保存，使用移液槍吸取各配置好的菌懸液0.05 ml分別加入培養(yǎng)基，進(jìn)行平板涂布后，靜置待表面干燥后待用，一定要注意對(duì)涂布器進(jìn)行酒精燈滅菌，避免菌種之間感染。

用打孔器準(zhǔn)備直徑為8 mm的濾紙片，每個(gè)接種過(guò)的平板貼放5個(gè)同等大小的紙片。將紙片放入不同質(zhì)量濃度（5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L）的藥液中，使其完全浸濕，之后貼放于平板表面，做好記號(hào)，紙片與紙片、紙片與平板邊緣之間要保持20 mm以上的距離，避免影響測(cè)量結(jié)果，以無(wú)菌水浸濕的紙片為陰性對(duì)照。放好后，用鑷子輕按紙片表面，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的大小。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值得出抑菌圈大小，通過(guò)比較得出不同質(zhì)量濃度的蘆丁藥液對(duì)3種菌的抑菌效果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2003進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與數(shù)據(jù)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蘆丁的提取與精制

3 g刺梨經(jīng)提取與精制后可得粗蘆丁0.345 g、精制蘆丁0.167 g。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制如圖3所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=11.575x+0.0224（R2=0.9945），說(shuō)明其在濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 蘆丁測(cè)定結(jié)果

樣品待測(cè)液在510 nm波長(zhǎng)下吸光度為0.168，所以樣品的含量為0.0127 mg/mL，經(jīng)公式（1）計(jì)算得到精制蘆丁中蘆丁含量百分比為31.75%，因此刺梨中蘆丁含量為17.67 mg/g。

2.4 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如表2所示，5 h內(nèi)樣品的吸光度值為6.0097～6.0104，變化不大，表示樣品在5h內(nèi)保持穩(wěn)定。

表2 5h內(nèi)樣品吸光度值的變化

2.5 抑菌結(jié)果

如表3所示為蘆丁抑菌性檢測(cè)結(jié)果。3個(gè)菌種在不同質(zhì)量濃度的實(shí)驗(yàn)藥液下受到不同程度的抑菌，且隨著實(shí)驗(yàn)藥液濃度的增大，抑菌圈更為明顯，表明蘆丁具有明顯的抑菌效果，且濃度越大，抑菌效果越好。對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯，另外兩種則極其微弱。4種濃度下，金黃色葡萄球菌的抑菌圈均大于其余兩種菌，且抑菌效果為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌。

表3 實(shí)驗(yàn)藥液對(duì)各個(gè)菌種抑菌圈的大小

3 結(jié)論

采用堿提取、酸沉淀法提取刺梨中的蘆丁，取得了較好的效果。此方法具有提取率高、成本低廉、操作容易、提取純度較高以及方法可靠準(zhǔn)確等特點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)促進(jìn)該藥材的進(jìn)一步推廣具有重大意義。

蘆丁對(duì)3個(gè)菌種均具有一定的抑菌作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加，抑菌作用更為明顯。蘆丁對(duì)3種菌的抑菌大小為：金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌。