岳筠2李鳳龍

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008；4.遵義市紅花崗區(qū)海龍鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，貴州 遵義 563099)

雞安卡拉病是由禽腺病毒Ⅰ群C種血清4型(FAdV-4)引起的以心包積液、肝臟腫大出血為主要特征的疾病，又稱心包積液-肝炎綜合癥。該病最早于1987年發(fā)生在巴基斯坦卡拉奇市附近的安卡拉地區(qū)，因此稱為安卡拉病，并很快蔓延到整個巴基斯坦地區(qū)[1，2]。此后世界上很多國家(如印度、韓國、美國等)相繼暴發(fā)此病，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。安卡拉病毒粒子無囊膜，其主要結(jié)構(gòu)蛋白有Hexon、Penton、Fiber1和Fiber2，而Fiber1和Fiber2為2種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，具有型和亞群特異抗原決定簇[4]；病毒粒子具有252殼粒，其中二十面體的頂角殼粒為12個五鄰體(penton)；五鄰體和纖突的頭節(jié)區(qū)可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，這在病毒感染細(xì)胞過程中起著非常重要的作用；二十面體上還有240個非頂角殼粒，稱為六鄰體(hexon)，其攜帶的抗原決定簇是中和抗體的靶標(biāo)[5]。FAdV-4與FAdV-8b、包涵體肝炎病毒均能引起相似的臨床癥狀，特別是肝臟的病變，在臨床診斷時極易混淆[6]。為了快速鑒別并及時制定有效的防控措施，對雞安卡拉病進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室快速準(zhǔn)確診斷十分重要。2012年該病在我國山東、河北的養(yǎng)殖雞群中出現(xiàn)[7]。2015年以來，在山東、河南、廣東等地區(qū)呈暴發(fā)性流行，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[8]。2016年底，貴州省多地也發(fā)現(xiàn)疑似病例。本研究對貴州省某養(yǎng)雞場發(fā)生的疑似安卡拉病毒感染病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷和禽腺病毒基因分型鑒定，以確定病原種類和血清型，為貴州省安卡拉病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集貴州省某規(guī)?；B(yǎng)雞場病雞肝臟作為檢測分析病料。

1.2 試劑DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑、限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xhol、DL 2 000 Marker、pMD19-T載體等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank公布的安卡拉病毒基因序列信息，設(shè)計(jì)合成Fiber1特異性引物核苷酸序列，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。序列信息見表1。

表1 引物信息

1.4 FAdV-4 PCR 檢測應(yīng)用DNA提取試劑盒對臨床病例的肝臟組織樣本進(jìn)行總DNA提取，建立PCR反應(yīng)體系25.0 μL：2-TaqPCR mastermix 12.5 μL，引物Fiber1R和Fiber1F各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，取PCR產(chǎn)物10 μL于含Goldview核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

1.5 目的基因測序及序列分析安卡拉病毒Fiber1基因PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收純化后，進(jìn)行目的基因測序，與參考毒株進(jìn)行序列分析，確定病毒流行株基因分型。參考序列見表2。

表2 FAdV-4參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測結(jié)果應(yīng)用基于安卡拉病毒Fiber1基因特異性引物對臨床病料組織樣本總DNA進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。病例肝臟組織樣本總DNA中擴(kuò)增出大小約1 296 bp特異性條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符。

圖1 PCR檢測結(jié)果M：DL 2 000 Marker；1：陽性對照；2～3：檢測樣本；4：陰性對照

2.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳純化后進(jìn)行基因測序，測序序列見圖2。PCR擴(kuò)增目的基因大小確定為1 296 bp，與預(yù)期擴(kuò)增Fiber1基因片段大小完全相符，毒株暫命名為：GZ-LPS。

圖2 目的基因測序結(jié)果

2.3 目的基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件將Fiber1基因核苷酸序列與GenBank中參考毒株進(jìn)行序列對比發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)檢測毒株與河北、江蘇、河南等國內(nèi)禽腺病毒Ⅰ群血清4型(FAdV-4)分離株同源性達(dá)99.8%以上，與國內(nèi)FAdV-11分離株HBQ11同源性僅為23.2%。與國外的禽腺病毒血清4型分離株比較顯示：與巴基斯坦分離株K31的同源性高達(dá)99.9%；與墨西哥分離株MX-SHP95、加拿大分離株ON1同源性達(dá)95.0%以上；與國內(nèi)外FAdV-2、FAdV-8、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-11的禽腺病毒核苷酸同源性為23.2%～28.9%。見圖3。

圖3 目的基因核苷酸序列同源性比較

2.4 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果應(yīng)用MegAlign軟件對FAdV-4貴州流行株GZ-LPS的Fiber1基因序列與國內(nèi)外參考毒株Fiber1基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示：本病例中的安卡拉病毒流行株GZ-LPS與國內(nèi)河北、江蘇等地FAdV-4分離株以及國外的FAdV-4分離株K31、MX-SHP9、ON1處于同一進(jìn)化分支，而與國內(nèi)外的FAdV-2、FAdV-8、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-11處于不同進(jìn)化分支。見圖4。

圖4 目的基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 討論

雞安卡拉病的診斷目前以病毒的分離培養(yǎng)與鑒定、血清學(xué)鑒定和基于特異性基因的分子生物學(xué)鑒定為主，其中病毒分離鑒定多用于病毒學(xué)研究，但存在周期長、效率低等問題，而血清學(xué)鑒定對腺病毒眾多血清型進(jìn)行區(qū)分也存在特異性不高的問題，因此基于特定基因的分子生物學(xué)鑒定方法被廣泛應(yīng)用[9，10]。禽腺病毒根據(jù)抗原性的不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，Ⅰ群禽腺病毒又分為A、B、C、D、E 5個種和12個血清型(FAdV-1-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9-11)，可見禽腺病毒種類繁多，依賴于傳統(tǒng)的血清學(xué)分型技術(shù)需要大量的特異性抗體，成本高、效率低，而依賴于基因測序與序列分析的基因分型技術(shù)在禽病毒分類中已被廣泛應(yīng)用[11～13]。貴州省對本病的報道資料較少，為實(shí)現(xiàn)病例的快速診斷與及時處置，本研究開展了基于安卡拉病毒Fiber1基因分型的分子生物學(xué)鑒定，為實(shí)現(xiàn)安卡拉病毒的快速診斷及早發(fā)現(xiàn)、早治療提供基礎(chǔ)參考依據(jù)。

4 結(jié)論

通過對貴州某養(yǎng)雞場病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷和禽腺病毒基因分型鑒定，確診為安卡拉病毒感染，分離毒株命名為“貴州株GZ-LPS”，與國內(nèi)外FAdV-4參考株基因同源性高達(dá)99.0%以上，而與其他血清型基因同源性均較低。進(jìn)化樹分析顯示該毒株與FAdV-4參考株親緣關(guān)系最近，確定為禽腺病毒Ⅰ群 C種血清4型毒株。