王 舉，竇忠霞，王永強，姜洪偉，袁宏偉

1內蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，呼和浩特 0100172內蒙古醫(yī)科大學病理解剖教研室(診斷室)，呼和浩特 010010

中心體由一對中心粒和其周圍物質組成，是動物細胞內有絲分裂期最主要的微管組織中心，參與紡錘體組裝、纖毛形成和染色體遷移等重要生物學過程[1]。中心粒復制屬于半保留復制，以母中心粒為模板形成子中心粒，如子中心粒不能形成，最終影響胚胎發(fā)育[2]。如果中心體過度復制，形成多個子中心粒，導致染色體分離異常，出現(xiàn)非整倍體，誘發(fā)腫瘤。中心粒復制相關蛋白STIL在此過程中發(fā)揮重要作用[3]。STIL從人類急性淋巴細胞白血病相關染色體重排中克隆而來[4]，與鼠、斑馬魚胚胎及神經系統(tǒng)發(fā)育有關[5- 7]。此外，STIL誘導細胞進入有絲分裂期，加快細胞周期轉換，促進細胞增殖。有報道STIL在肺癌、胰腺癌組織中呈高表達，高表達個體易發(fā)生轉移且預后不良[8- 10]。前期研究顯示，與癌旁相比，胃癌組織STIL表達顯著增高，STIL敲減后，SGC- 7901細胞增殖能力下降，凋亡增加，表明STIL促進胃癌發(fā)生發(fā)展，但具體機制尚不清楚[11]。本研究采用基因芯片聯(lián)合生物信息學分析STIL敲減后基因表達譜的變化，篩選差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)，并對DEGs進行基因注釋(gene ontology，GO)、京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集、轉錄因子調控網絡和蛋白互作網絡等分析，初步闡明STIL促進胃癌發(fā)生發(fā)展的潛在分子機制。

材料和方法

材料人胃癌細胞株SGC- 7901購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購于美國Gibco公司；用于下調STIL的慢病毒RNAi(Lenti-KD)購于上海吉凱基因公司；總RNA提取試劑盒(HP Total RNA Kit)購于美國Omega Bio-Tek公司；第一鏈生成試劑盒(All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit)和實時定量逆轉錄試劑盒(All-in-OneTMqPCR Mix)購于美國GeneCopoeia公司；STIL和GAPDH引物由上海吉凱基因公司合成；生物素標記試劑盒(GeneChip 3’IVT Expression Kit)、雜交洗滌染色試劑盒(GeneChip hybridization Wash and Stain Kit)以及全人類基因組表達陣列(PrimeView Human Gene Expression Array)購于美國Affymetrix公司。

細胞培養(yǎng)及轉染SGC- 7901胃癌細胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞按2×105/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后按說明書進行轉染。實驗組加入靶向STIL的RNA慢病毒干擾質粒Lv-ShSTIL，對照組加入亂碼序列病毒質粒Lv-ShCon。

RNA提取、轉錄及探針制備繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各處理組細胞，采用RNA試劑盒提取細胞總RNA，以Oligo(dT)為引物，采用反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，再以此鏈為模板，采用實時定量PCR試劑盒生成雙鏈cDNA，STIL上游引物：5’-CCCAACGCCAACTGGAGATTT- 3’，下游引物：5’-AGTCGGATGGTCTTCTCAGTC- 3’，擴增片段87 bp。 GAPDH上游引物：5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA- 3’，下游引物：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA- 3’，擴增片段121 bp。PCR反應體系為：95℃，預變性10 min，95℃，30 s；52℃，45 s；72℃，45 s，40個循環(huán)。再以cDNA為模板，采用因芯片表達試劑盒通過體外反轉獲得帶生物素標記的核酸探針，將其純化、片段化后用于后續(xù)雜交實驗。

基因表達譜芯片雜交、掃描和分析采用基因芯片雜交染色試劑盒對核酸探針與基因表達譜芯片進行雜交16 h，用昂飛流體工作站450進行洗脫和染色，基因芯片掃描儀 3000 7G掃描生成圖像。芯片掃描圖像采用微陣列5.0軟件進行數(shù)字化處理和分析。

實時定量PCR結合后續(xù)GO和KEGG分析結果，篩選顯著富集于某通路的DEGs，采用實時定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)驗證。具體方法同RNA提取、轉錄，PCR反應40個循環(huán)后，使用自動PCR儀檢測。采用2-△△Ct相對定量法計算ShSTIL、ShCon組各基因mRNA的相對表達水平。

生物信息學分析采用R“l(fā)imma”包分析全基因組表達譜芯片檢測結果，篩選DEGs，R“pheatmap”包繪制DEGs表達熱圖。GO分析利用DAVID 6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)，KEGG富集分析采用R“clusterProfiler”包，R“ggplot2”包繪制柱狀圖，并采用Cytoscape軟件繪圖對KEGG通路及富集基因進行可視化。同樣，將DEGs輸入David網站，輸出轉錄因子及調控基因文件，利用Cytoscape軟件繪制轉錄因子調控基因網絡圖。此外，挑選顯著富集于KEGG通路的DEGs用于后續(xù)蛋白互作分析。為構建蛋白互作網絡圖，于BioGRID網站(https：//thebiogrid.org/)查詢STIL互作蛋白并下載，聯(lián)合KEGG篩選的DEGs、上游轉錄因子，輸入String網站(https：//string-db.org/)進行分析，下載蛋白互作關系文件，采用Cytoscape軟件繪制以STIL為中心的蛋白互作網絡圖。

結 果

RNA質控結果總RNA經超微量分光光度計NanoDrop 2000檢測，吸光度160/280比值在1.7～2.2；總RNA經凝膠電泳檢測，RNA完整數(shù)≥7.0，28s/18s>0.7，說明樣品合格，無RNA降解。兩樣品總RNA 28s/l8s峰值面積比值>7，說明RNA質量較好，符合基因芯片雜交檢驗的要求。

差異表達基因篩選結果人類全基因組表達芯片包含36 000個探針，將各處理組RNA探針與該芯片雜交，分析STIL敲減前后胃癌細胞基因表達譜的變化。結果顯示與對照組相比，STIL基因沉默導致417個基因表達下降，87個基因表達上升(P<0.05，差異倍數(shù)>1或<-1)。選擇差異最顯著的20個DEGs，繪制基因表達熱圖(圖1)。

ShSTIL：靶向STIL的短發(fā)夾RNA；ShCon：靶向亂碼序列的短發(fā)夾RNA；DEGs：差異表達基因；紅色代表高表達，藍色代表低表達

ShSTIL：short hairpin RNA targeting STIL；ShCon：short hairpin RNA of negative control；DEGs：differentially expressed genes；red and blue colors represent high- and low-expression level，respectively

圖1ShSTIL和ShCon處理組前20個DEGs熱圖

Fig1The heatmap of the top 20 DEGs between ShSTIL- and ShCon-treated groups

qRT-PCR驗證基因芯片檢測結果利用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)在線整合分析軟件，對DEGs進行上游調控分析，轉化生長因子-β被預測為強烈抑制，該基因可能調控30個DEGs(SERP1、GNB4、OLR1、SRI、RAB31、SLC35A5、GLCE、CCT6A、CD46、TUBA1A、IGFBP3、MSMO1、MBNL2、BCL2L11、PTGS2、DSG2、MRFAP1L1、AHNAK、LOXL2、SMAD2、SNTB2、FBN1、CD44、ARL4A、ITGAV、PTPRK、KDELR2、PODXL、F2R、TPM1)。針對這些基因，分別設計引物，分別以Lv-ShSTIL和Lv-ShCon處理SGC- 7901細胞，提取RNA，采用qRT-PCR法檢測各處理組DEGs的表達水平，證實26個DEGs表達與基因芯片檢測結果相似，準確率達86.67%(圖2)。

GO和KEGG富集分析結果GO細胞組成分析顯示，DEGs位于胞漿、外泌體、高爾基復合體及生物膜。KEGG分析顯示，DEGs參與P53信號通路、泛素介導的蛋白水解、干細胞多能性調控(圖3)。以顯著富集的信號通路和相應的DEGs為輸入文件，采用Cytoscape軟件繪制通路與基因關系圖，篩選通路之間的節(jié)點(DEGs)，IGF1R、GRB2和CDC42分別為hsa05205、hsa04510、hsa04550、hsa01521、hsa04144通路，hsa05205、hsa04510、hsa04550、hsa01521、hsa05206通路和hsa05130、hsa04144、hsa05205、hsa04510通路的共同節(jié)點(圖4)，相關通路描述見表1。

轉錄因子調控網絡圖為明確調控DEGs與其上游轉錄因子的關系，選擇富集于KEGG通路的DEGs，利用DAVID6.8進行轉錄因子富集分析，篩選顯著富集轉錄因子及調控基因，采用Cytoscape軟件繪制調控網絡圖。圖5描述了17個轉錄因子與DEGs的調控網絡圖，其中FOXO1調控CAV2、GALNT7、AP4E1、GRB2、SEC11A、PRKAG1、 PRKCI、ALG5、SMAD2、DCN、PMAIP1、TPM1、BCL2L11、CHMP2B、IGF1R、 IMMP2L、EI24、CCND3、CD44、ITGAV、RAB22A、JAK1、RCHY1、ACSL4、 FGF2、UBE2E2基因的表達。

STIL蛋白互作網絡圖為探討STIL誘發(fā)胃癌的分子機制，構建蛋白互作網絡圖，預測STIL直接互作蛋白及信號通路。結果顯示E3泛素連接酶STUB1、BTRC(FBXW1)、FBXW11、CUL1、SKP2、RCHY1、CDC46與周圍蛋白連線較多，在STIL調控網絡中發(fā)揮重要作用，其中STUB1、SKP2與FOXO1互作，而FOXO1是重要的轉錄因子(圖6)。

討 論

胃癌是嚴重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率居惡性腫瘤第4位(僅次于肺癌、乳腺癌和結直腸癌)，死亡率居第3位[12]。筆者前期研究顯示，STIL促進胃癌細胞增殖、抑制凋亡[11]。為進一步探索STIL誘發(fā)胃癌的分子機制，通過基因表達譜芯片聯(lián)合生物信息學分析，本研究初步證實STIL通過調控P53通路、干細胞多能性、泛素介導的蛋白水解、溶酶體等，促進胃癌發(fā)生發(fā)展。蛋白互作網絡和轉錄調控網絡分析顯示STIL可能通過與E3泛素連接酶互作，抑制其活性，促進抑癌分子FOXO1的泛素化降解，從而誘發(fā)胃癌。

與ShCon比較，aP<0.05

aP<0.05 compared with ShCon

圖2ShSTIL和ShCon處理的SGC- 7901細胞中轉化生長因子-β調控基因mRNA的表達水平

Fig2The mRNA levels of genes regulated by transforming growth factor-β in the ShSTIL- and ShCon-treated SGC- 7901 gastric cancer cell line

GO：基因本體；KEGG：京都基因和基因組百科全書；ER：內質網；PEC：致病性大腸桿菌；PSC：干細胞多能性；EGFR-TKI：表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑

GO：gene ontology；KEGG：Kyoto encyclopedia of genes and genomes；ER：endoplasmic reticulum；PEC：pathogenic escherichia coli；PSC：pluripotency of stem cells；EGFR-TKI：epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor

圖3GO(A)和KEGG(B)富集分析

Fig3The enrichment analysis of GO(A)and KEGG(B)

中心粒復制相關蛋白STIL與肺癌、胰腺癌和結直腸癌發(fā)生密切相關[8- 9，13]，筆者前期研究顯示STIL在胃癌組織中呈高表達，與細胞增殖、克隆形成、細胞周期調控及凋亡有關[11]。然而，STIL誘發(fā)腫瘤的機制存在組織特異性。Kasai等[9]研究顯示STIL在胰管上皮細胞的基底部少量表達，但在胰腺上皮內瘤變和胰腺導管腺癌中表達顯著增高。進一步研究證實KRAS促進STIL與融合抑制因子(suppressor of fused，SUFU)N端結合并抑制其活性，而SUFU是轉錄因子GLI1的負性調控因子，因此GLI1被釋放進入細胞核，調控相關基因表達。轉錄因子是一群能與基因5’端上游特定序列專一性結合，保證目的基因以特定強度、時間、空間去表達蛋白分子?；蛟诓煌M織、時間具有表達差異性，轉錄因子調控發(fā)揮重要作用。同時，轉錄因子也是信號轉導通路的靶標，也是被調控的對象。Castiel等[14]報道STIL促進檢查點蛋白CHFR的自身泛素化降解，細胞G2/M轉化時相縮短，增殖加快，誘發(fā)腫瘤。CHFR屬于E3泛素連接酶，可介導其他底物的泛素化降解，包括Aurora A、HDAC1、TOPK、PARP1和Kif22等，這些蛋白均與惡性腫瘤的發(fā)生相關。因此，Chfr是一種抑癌基因，其啟動子區(qū)域CpG島超甲基化，導致Chfr表達沉默，與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有關[15- 16]。如STIL介導CHFR發(fā)生自身泛素化降解，導致胞漿中促癌因子蓄積，誘發(fā)腫瘤。親和捕獲串聯(lián)質譜分析進一步證實，STIL通過直接互作，激活泛素特異性蛋白酶- 7(ubiquitin specific protease 7，USP7)[17]，而USP7可通過去泛素化，抑制CHFR的自身泛素化降解[18]。Wu等[19]敲減前列腺癌工具細胞STIL表達，細胞表型變化與筆者前期研究[11]相似，細胞增殖、克隆形成能力下降，凋亡增加，細胞信號抗體芯片顯示STIL可能通過絲裂原活化蛋白激酶等信號通路調控腫瘤發(fā)生發(fā)展。

紅色、綠色節(jié)點分別代表高、低表達基因，藍色節(jié)點代表通路ID；節(jié)點大小代表連通性，連通性高的基因位于調控網絡中心，即核心基因

Red and green nodes represents up- and down-regulated genes，respectively，while blue nodes represents IDs of pathways；the size of nodes represents connectivity，and the ones with higher connectivity，located in the centre of the network，are called hub genes

圖4KEGG通路及相關基因

Fig4KEGG pathways and related genes

表1 KEGG通路描述Table 1 Descriptions of KEGG pathways

紅色、綠色節(jié)點分別代表高、低表達基因，藍色節(jié)點代表轉錄因子

Red and green nodes represent up- and down-regulated genes，respectively，and blue nodes represent transcription factors

圖5轉錄因子調控靶基因網絡圖

Fig5The network of transcription factors regulating target genes

紅色、綠色、藍色節(jié)點分別代表高、低表達和無顯著變化的基因，節(jié)點大小代表連通性

Red，green，and blue nodes represent up-，down- and non-significantly altered genes，the size of nodes represents connectivity

圖6STIL為中心的蛋白互作網絡圖

Fig6Protein-protein interacting networks of STIL centred

本研究通過基因表達譜芯片串聯(lián)生物信息學分析顯示，STIL通過互作激活E3泛素連接酶SKP2、STUB1的活性，導致FOXO1發(fā)生泛素化降解。FOXO1屬于轉錄因子，進入細胞核后與抑癌基因啟動子結合，促進靶基因轉錄，負性調控消化道腫瘤的發(fā)生[20]。因此，STIL可能通過激活E3泛素連接酶，促進抑癌轉錄因子FOXO1的降解，促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。