郭 鈞 劉 鋮 周 舉 倪 昱 羅 睿 江 寧 隋加紅

(1 清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，北京市 100016，電子郵箱：yxbjb0052@163.com；2 中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心南院區(qū)骨科，北京市 100039)

骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，常發(fā)生于長骨干骺端和膝蓋，多發(fā)于青少年，骨肉瘤惡性程度高，早期易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[1]。隨著手術(shù)結(jié)合新輔助或輔助化療方案的應(yīng)用，骨肉瘤5年生存率維持在60%～80%，但局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后較差，5年生存率不足30%[2-3]，因此，尋找到可靠的評估預(yù)后的指標，對指導(dǎo)治療方案的制訂和預(yù)測療效具有重要意義。X線、CT、正電子發(fā)射斷層掃描、磁共振成像等影像學(xué)檢查，是診斷骨肉瘤和評估其治療效果的重要方式，但由于價格昂貴，一般用于疾病的確診，不用于疾病早期的篩查。AKP是骨肉瘤已知的血清標志物，但在青少年尤其是兒童中，血清AKP水平普遍升高，且器官損傷后也影響其水平，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果[4]，因此，尋找高靈敏度、特異性和微創(chuàng)的骨肉瘤生物標記物，對指導(dǎo)骨肉瘤的治療具有重要價值[5]。近年來，有研究顯示，微小RNA表達異常是導(dǎo)致惡性腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素，活躍的腫瘤細胞可分泌微小RNA入血，分析患者血液循環(huán)中微小RNA水平為癌癥篩查或監(jiān)測提供了新的方式[6]。目前，對于骨肉瘤，尚無一致的循環(huán)微小RNA標志物。本研究通過檢測骨肉瘤患者血清微小RNA-25-3P的表達水平，初步探討其對骨肉瘤診斷和預(yù)后評估的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月至2016年11月在中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心南院區(qū)及清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的74例骨肉瘤患者作為研究組，納入標準：(1)病理組織學(xué)檢查確診為骨肉瘤；(2)發(fā)病部位為四肢，首次診斷，既往未行過放療、化療等抗腫瘤治療；(3)患者對研究知情并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并其他部位惡性腫瘤者；(2)合并嚴重心、肝、腎功能障礙者；(3)妊娠期、哺乳期女性；(4)合并自體免疫性疾病或接受糖皮質(zhì)激素治療者。選取同期在我院接受健康查體的57例健康者作為對照組。兩組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究通過醫(yī)院倫理審查批準，患者對本研究知情并簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料比較

1.2 主要儀器和試劑 PCR基因擴增儀購自西安天隆科技有限公司(型號：DTC 3G plus)，熒光定量PCR儀購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司(型號：SLAN-96P)，-80℃冰箱購自青島海爾公司(型號：DW-86L388J)，臺式高速離心機購自上海珂淮儀器有限公司(型號：Eppendorf 5427R)。PrimeScript RT reagent kit購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(批號：RR037A)，TaqMan? MicroRNA Assays購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(批號：4365409)，LightCycler?480 Probes Master購自瑞士羅氏公司(批號：04 707 494 001)，InvitrogenTMTRIzolTMLS 試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司(批號：10296010)。

1.3 循環(huán)微小RNA-25-3P表達水平的檢測 抽取兩組研究對象清晨空腹靜脈血2 mL，其中研究組在接受術(shù)前輔助化療之前采集標本。使用乙二胺四乙酸二鈉進行抗凝，室溫下靜置1 h，3 500 r/min離心5 min，吸取上層血清置于干燥潔凈EP管中，-80℃低溫保存，使用Invitrogen TRIzolTMLS試劑盒提取總RNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用PrimeScript RT reagent kit將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。20 μL反應(yīng)體系包括4.0 μL總RNA、2.0 μL 微小RNA-39反轉(zhuǎn)錄引物、10 μL反轉(zhuǎn)錄緩沖液、1 μL反轉(zhuǎn)錄酶和3 μL焦碳酸二乙酯水；反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s。以miR-39作為內(nèi)參進行PCR實驗。微小RNA-25-3p上游引物：5′-CAUUGCACUUGUCUCGGGGUCUGAAG-3′，下游引物：3′-GAGCAACGUGAACAGAGACAGACU-5′；內(nèi)參微小RNA-39上游引物：5′-AGUGGCCCACAUUUAGUCGAAC-3′，下游引物：3′-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-5′。引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。10 μL定量PCR反應(yīng)體系包括LightCycler? 480 Probes Master(2×)5 μL、TaqMan? MicroRNA Assays(20×)0.5 μL、cDNA 1 μL、Nuclease-free H2O 3.5 μL；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s共40循環(huán)，40℃ 10 s冷卻。所有樣品設(shè)置3個副孔，反應(yīng)結(jié)束后獲得溶解曲線及循環(huán)閾值，取其平均Ct值，采用2-△△Ct計算目的基因相對表達量。

1.4 治療方法 74例患者中，最終接受保肢手術(shù)43例，截肢手術(shù)31例。所有患者手術(shù)前后均接受輔助化療，術(shù)前化療主要藥物有氨甲蝶呤、阿霉素、順鉑、環(huán)磷酰胺，術(shù)后根據(jù)患者情況調(diào)整用藥，化療時間為6～12個月?；颊叱鲈汉螅ㄟ^微信、QQ、電話、復(fù)查等方式進行定期隨訪。以研究對象入組時間為觀察起始時間，患者因原發(fā)疾病死亡為終點事件，研究結(jié)束時患者存活、死于其他原因或研究期間失訪為截尾事件。

1.5 臨床資料的收集 記錄患者的一般資料及臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、Enneking外科分期、是否合并病理性骨折、手術(shù)方式、輔助化療次數(shù)、遠處轉(zhuǎn)移情況等。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評估循環(huán)微小RNA-25-3P診斷骨肉瘤的效能；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線及計算生存率；采用log-rank檢驗進行單因素分析，將P<0.1的變量納入多因素分析，采用Cox風(fēng)險回歸模型進行多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對象循環(huán)微小RNA-25-3P表達水平及其對骨肉瘤的診斷價值 研究組血清微小RNA-25-3P相對表達水平為1.29±0.62，低于對照組的4.46±1.37(t=-16.227，P<0.001)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清微小RNA-25-3P相對表達水平診斷骨肉瘤的最佳截斷值為2.56，其靈敏度、特異性分別為0.905、0.982，曲線下面積為0.977(P<0.001，95% CI：0.956～0.998)，見圖1。

圖1 循環(huán)微小RNA-25-3P相對表達水平診斷骨肉瘤的ROC曲線

2.2 74例骨肉瘤患者預(yù)后情況 末次隨訪截止時間為2018年11月30日，74例骨肉瘤患者均完成隨訪，隨訪率100%，隨訪時間5～80個月，中位隨訪時間39個月，患者1年、3年生存率分別為83.51%和43.98%，見圖2。

圖2 74例骨肉瘤患者總生存曲線

2.3 影響骨肉瘤患者預(yù)后的單因素和多因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，不同年齡組、性別、腫瘤大小、Enneking外科分期、輔助化療次數(shù)、遠處轉(zhuǎn)移情況、循環(huán)微小RNA-25-3P表達水平的患者之間，生存曲線比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.1)，見表2。以單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的變量為自變量，以術(shù)后生存情況為因變量，進行多因素Cox回歸模型分析，變量賦值見表3。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，輔助化療次數(shù)、遠處轉(zhuǎn)移情況、循環(huán)微小RNA-25-3P表達水平是骨肉瘤患者生存的獨立影響因素(均P<0.05)，其中未遠處轉(zhuǎn)移及循環(huán)微小RNA-25-3P相對表達水平≥1.56為骨肉瘤患者術(shù)后生存的保護因素，輔助化療次數(shù)<6次為其生存的危險因素，見表4。

表2 影響骨肉瘤患者術(shù)后生存的單因素分析

注：*通過繪制ROC曲線，以循環(huán)微小RNA-25-3P水平預(yù)測患者3年生存的截斷值作為循環(huán)微小RNA-25-3P的分界值。

表3 多因素分析自變量賦值表

表4 影響骨肉瘤患者術(shù)后生存的多因素分析

3 討 論

微小RNA是一種不編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，在維持調(diào)節(jié)細胞功能中具有必不可少的作用。近年來，有研究表明，微小RNA與細胞的增殖、分化、凋亡等密切相關(guān)，其發(fā)生異?？蓪?dǎo)致基因缺失、突變、基因調(diào)控的異常，進而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。與信使RNA或小核RNA相比，循環(huán)中微小RNA在血液和細胞培養(yǎng)基中具有良好的穩(wěn)定性，在惡性腫瘤患者外周血中穩(wěn)定表達[8]。目前，在乳腺癌[9]、肺癌[10]、胃癌[11]、肝癌[12]、腎癌[13]、膀胱癌[14]及其他多種癌癥患者中，均發(fā)現(xiàn)循環(huán)微小RNA的差異表達，這為腫瘤生物學(xué)特性研究和治療干預(yù)的監(jiān)測提供了新的思路。

目前，已經(jīng)有研究結(jié)果顯示，骨肉瘤患者血液中微小RNA表達異常，其外周血中單個核細胞的微小RNA-21水平[3]、血漿微小RNA-181b水平[15]、循環(huán)微小RNA-34b水平[16]均升高。但多數(shù)研究主要關(guān)注骨肉瘤患者血液中微小RNA的表達水平，而非循環(huán)中的微小RNA表達水平是否能客觀反映腫瘤組織中微小RNA表達情況的存在爭議。Pigati等[17]指出，循環(huán)微小RNA雖被評估為乳腺癌或其他癌癥的生物標志物，但當細胞選擇性釋放或保留微小RNA時，循環(huán)微小RNA水平可受到影響，從而會對診斷結(jié)論產(chǎn)生干擾。Chan等[18]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者的腫瘤組織中有20種微小RNA異常表達，在血清中僅有7種微小RNA表達上調(diào)。因此，循環(huán)微小RNA水平并不能完全反映腫瘤微小RNA的表達情況，需要進一步篩選骨肉瘤的循環(huán)微小RNA。

牛敏等[19]研究發(fā)現(xiàn)，血清中微小RNA-25的表達下調(diào)與骨肉瘤的肺部轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，可作為預(yù)測骨肉瘤肺部轉(zhuǎn)移的指標。Li等[20]發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤患者血清循環(huán)微小RNA-25-3P水平明顯低于健康對照組，其可作為診斷和預(yù)測骨肉瘤的生物學(xué)標志物。本研究在該研究的基礎(chǔ)上進一步通過平衡各種臨床因素，分析循環(huán)微小RNA-25-3P與骨肉瘤預(yù)后相關(guān)性。結(jié)果顯示，骨肉瘤患者血清循環(huán)微小RNA-25-3P相對表達水平低于對照組(P<0.05)，且血清微小RNA-25-3P相對水平為2.56時診斷骨肉瘤的曲線下面積達0.977(P<0.05)，提示其對骨肉瘤具有較高的診斷價值，這與Li等[20]的研究結(jié)果相似。進一步采用多因素Cox回歸模型分析骨肉瘤患者預(yù)后的影響因素，結(jié)果顯示，血清微小RNA-25-3P水平是影響骨肉瘤患者生存情況的因素之一，血清微小RNA-25-3P相對表達水平≥1.56的骨肉瘤患者術(shù)后死亡風(fēng)險降低。

綜上所述，循環(huán)微小RNA-25-3P水平對骨肉瘤的診斷和預(yù)后評估均有一定臨床價值，有望成為診斷骨肉瘤和評估基預(yù)后新的標志物，但所得研究結(jié)果值得進一步研究探討。