張顯純 王 琳 楊 帆

心肌梗死患者缺血-再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)后出現(xiàn)的心肌細(xì)胞凋亡是引起心肌損傷的主要機(jī)制之一，線粒體凋亡途徑的激活可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)是調(diào)節(jié)缺氧或損傷下細(xì)胞凋亡的重要通路[1-2]。白藜蘆醇是一種天然存在的多酚物質(zhì)，近年來發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有抑制心肌細(xì)胞凋亡和減少缺血后心肌細(xì)胞損傷的作用[3]。但是，關(guān)于其保護(hù)心肌細(xì)胞機(jī)制的研究較少，最新的臨床研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合白藜蘆醇可提高對心肌梗死的治療效果[4]。本研究旨在分析白藜蘆醇通過抑制心肌梗死大鼠細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為白藜蘆醇應(yīng)用于急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、儀器和材料

選用45只成年SD大鼠(南京金陵醫(yī)院)，雄性，220～250 g。ELISA試劑盒和TUNEL凋亡試劑盒(武漢華美公司)。Model 680型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、細(xì)胞死亡調(diào)解子(Bcl-2 interacting mediator of cell death，BIM)、Bcl-2相關(guān)蛋白X(Bcl-2-associated X protein，BAX)、半胱天冬酶3(Caspase3)和半胱天冬酶9(Caspase9)引物由蘇州Genewiz公司設(shè)計(jì)和合成。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa和SYBR Prellix Ex TaqTM實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司。anti-PI3K，anti-Akt，anti-p-PI3K，anti-p-Akt以及相關(guān)二抗均購自美國Abcam公司。聚偏二氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國Bio-Rad公司)。

1.2 建模及干預(yù)方法

將45只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和白藜蘆醇組，每組15只。

(1)心肌梗死大鼠模型建立方法為:將大鼠使用4%的水合氯醛麻醉，氣管插管(潮氣量20 ml/kg，呼吸頻率50次/min)并連接心電圖，隨后迅速打開胸腔暴露心臟，使用6/0線在左心耳下約2 mm處的冠狀動脈前降支結(jié)扎，顯示心電圖QRS波增寬為結(jié)扎成功，45 min后取出絲線再灌注120 min，至心電圖QRS波恢復(fù)，關(guān)閉并縫合。

(2)對照組大鼠僅打開胸腔，在冠狀動脈前降支結(jié)扎前1 min舌靜脈注射生理鹽水。

(3)白藜蘆醇組大鼠在冠狀動脈前降支結(jié)扎前1 min經(jīng)舌靜脈注射白藜蘆醇，劑量為20 mg/kg。術(shù)后采集小鼠靜脈血以及心臟組織進(jìn)行后續(xù)的研究。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法

通過檢測大鼠心肌酶指標(biāo)判斷心肌細(xì)胞損傷情況。將血液靜置后離心，以2000 r/min離心10 min，使用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測大鼠血清樣本中肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB)水平。根據(jù)說明書加入酶標(biāo)記試劑和顯色劑，并通過加入終止溶液終止反應(yīng)。

1.3.2 細(xì)胞凋亡與聚合酶鏈反應(yīng)

(1)細(xì)胞凋亡。通過TUNEL凋亡試劑盒檢測凋亡率，按照試劑盒說明書操作并在熒光顯微鏡下觀察。

(2)實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative realtime-polymerase chain reaction，qRT-PCR)。qRTPCR法用于檢測心肌組織中信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)水平，組織裂解后收集總mRNA，在95 ℃下激活DNA聚合酶5 min進(jìn)行PCR，進(jìn)行40個循環(huán)的95 ℃、10 s和60 ℃、30 s兩步PCR，最終延伸75 ℃下10 min，保持在4 ℃，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)部參照物，使用比較循環(huán)閾值法(2-ΔΔCT)分析RNA水平。

1.3.3 免疫印跡(Western blot)法

取對數(shù)生長期的bcl-2細(xì)胞，按2×106個細(xì)胞/培養(yǎng)皿接種bcl-2細(xì)胞。加入含終濃度為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L異土木香內(nèi)酯的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h，離心收集細(xì)胞，使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌細(xì)胞后，加入上樣緩沖液100 μl，劇烈振蕩后冰浴下超聲波處理1 min。100 ℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，以12000 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白濃度。取50 μg蛋白在SDS-PAGE電泳下分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉于室溫下?lián)u動封閉膜2 h。棄封閉液，用1×TBS-T洗膜3次，每次15 min。膜在抗p53多克隆抗體(1∶500)和抗Bax多克隆抗體(1∶700)稀釋液中室溫過夜孵育，1×TBS-T洗膜15 min，共3次后，在二抗稀釋液(抗鼠1∶5000)中孵育40 min。再次洗膜后加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑，反應(yīng)1 min，用X光片曝光1～10 min后顯影。

在液氮的保護(hù)下裂解組織，離心(12000 r/min，15 min)后收集上清液，使用10%的SDS-PAGE凝膠用于電泳，電泳后使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗，室溫振蕩2 h，后在4 ℃孵育過夜，加入二抗。使用GAPDH作為內(nèi)部參照物。

1.4 觀察指標(biāo)

(1)ELISA檢測大鼠血清樣本后，使用酶標(biāo)儀檢測并計(jì)算大鼠血清cTnT和CK-MB水平濃度。

(2)Western blot檢測PI3K、p-PI3K、AKT以及p-AKT蛋白的水平，并計(jì)算p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的值，分析PI3K和AKT蛋白磷酸化水平。

(3)TUNEL凋亡試劑盒檢測凋亡率，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核顏色偏白并且呈聚集狀態(tài)。

(4)觀察白藜蘆醇對線粒體凋亡相關(guān)蛋白，包括Bcl-2、BIM、BAX、Caspase3和Caspase9的mRNA水平的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS19軟件對所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，通過單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)組間差異，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠心肌酶水平比較

模型組大鼠血清cTnT和CK-MB水平與對照組相比顯著升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=34.587，t=24.987；P＜0.05)；白藜蘆醇組大鼠血清cTnT 和CK-MB水平顯著低于模型組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.129，t=14.971；P＜0.05)，見表1。

表1 三組cTnT 和CK-MB水平比較

2.2 三組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較

模型組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=38.971，P＜0.05)；白藜蘆醇組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.687，P＜0.05)，見表2和圖1。

表2 三組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較

圖1 TUNEL法檢測三組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況(×50)

2.3 白藜蘆醇對p-PI3K/Akt通路的影響

建模后大鼠心肌細(xì)胞中的p-PI3K/PI3K通路被顯著抑制，模型組與對照組相比和白藜蘆醇組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.927，t=16.541；P＜0.05)，而白藜蘆醇可顯著促進(jìn)p-PAk/Akt通路活化，模型組與對照組比較和白藜蘆醇組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.314，t=24.876；P＜0.05)，見表3和圖2。

表3 白藜蘆醇對大鼠心肌組織中PI3K/Akt通路的影響

表4 白藜蘆醇對線粒體凋亡相關(guān)基因mRNA水平的影響

圖2 Western blot檢測各組大鼠心肌組織中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

2.4 白藜蘆醇對線粒體凋亡相關(guān)基因mRNA水平的影響

建模后大鼠心肌細(xì)胞BIM、BAX、Caspase9以及Caspase3的mRNA水平上調(diào)，而Bcl-2mRNA水平下調(diào)，白藜蘆醇可顯著抑制BIM、BAX、Caspase9及Caspase3基因表達(dá)，并促進(jìn)Bcl-2基因表達(dá)，見表4。

3 討論

AMI是指由于冠狀動脈急性缺血引起的心肌梗死，具有發(fā)病急、進(jìn)展快等特點(diǎn)，具有極高的病死率，且預(yù)后差異大，對患者生活和生命造成極大威脅[5]。心肌梗死是最常見的急性心臟損傷的原因之一，雖然近年來對心肌梗死的治療有所改善，然而心肌梗死后血液再灌注導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞的缺血性死亡的情況仍難以緩解，因此減少I/R對心肌細(xì)胞的損傷在臨床治療心肌梗死和提高預(yù)后中具有重要意義[6]。

白藜蘆醇具有多種生化和生理作用，包括抗血小板、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡和抗炎作用，并具有保護(hù)心肌細(xì)胞改善心臟功能的作用[7]。為進(jìn)一步分析白藜蘆醇對心肌I/R大鼠的影響，本研究建立了大鼠I/R模型，建模后大鼠血清中cTnT和CK-MB水平顯著升高，提示建模后心肌細(xì)胞受到損傷，cTnT和CK-MB外流至外周血中，而白藜蘆醇具有保護(hù)I/R后心肌細(xì)胞損傷的作用。進(jìn)一步的分析顯示建模后大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，而白藜蘆醇干預(yù)后可顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡。國內(nèi)有研究顯示，白藜蘆醇可保護(hù)I/R后的心臟損傷[8]。林巖等[9]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以抑制腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡，提示在體內(nèi)或體外，白藜蘆醇可以減少I/R后心肌細(xì)胞損傷抑制細(xì)胞凋亡的作用。

為進(jìn)一步分析白藜蘆醇抑制I/R后心肌細(xì)胞凋亡減輕心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制，本研究分析了其對PI3K/Akt通路和線粒體凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平。PI3K/Akt是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要通路，已有研究顯示，在心肌細(xì)胞缺血或I/R后，PI3K/Akt通路被抑制，而線粒體凋亡可通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)，參與I/R后心肌細(xì)胞凋亡[10-11]。本研究結(jié)果顯示，建模后心肌細(xì)胞中的PI3K/Akt通路被顯著抑制，而白藜蘆醇可顯著促進(jìn)PI3K/Akt通路活化，白藜蘆醇可顯著抑制BIM、BAX、Caspase9及Caspase3基因表達(dá)并促進(jìn)Bcl-2基因表達(dá)。Pei等[12]研究結(jié)果顯示，提高PI3K/Akt通路具有保護(hù)心肌細(xì)胞損傷的作用。Colleen等[13]研究認(rèn)為，PI3K/Akt途徑是黃酮保護(hù)心肌細(xì)胞I/R損傷所必需的通路。Zhang等[14]報(bào)道，白藜蘆醇具有上調(diào)PI3K/Akt途徑的作用，Wu等[15]的研究也得到了相似的結(jié)果。黃新宇等[16]報(bào)道，白藜蘆醇可通過上調(diào)Nrf2/ARE通路抑制心肌細(xì)胞I/R后炎性和氧化應(yīng)激損傷。此外，也有研究顯示，白藜蘆醇還可通過其他方式保護(hù)心肌細(xì)胞[17]。提示白藜蘆醇可能通過促進(jìn)PI3K和Akt磷酸化抑制線粒體凋亡途徑，但是關(guān)于白藜蘆醇保護(hù)I/R的其他機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

白藜蘆醇通過激活PI3K/Akt通路抑制心肌梗死大鼠細(xì)胞線粒體凋亡，并減少I/R引起的心肌細(xì)胞損傷。然而，關(guān)于白藜蘆醇治療心肌梗死及I/R的效果和具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。