邱素艷，趙復生，Shih WeiChuan

（1.江西省農業(yè)科學院農產品質量安全與標準研究所，南昌330200；2.中國科學院微電子研究所光電研發(fā)中心，北京100029；3.University of Houston,Department of Electrical and Computer Engineering,Houston,TX 77204,USA）

Au、Ag等金屬納米結構中的自由電子在入射光的激發(fā)作用下易表現出集體振動[1]，促使金屬周圍電場得到明顯增強，同時Au或Ag表面自由電子因集體振動而離開原子核，從而引起表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR） 和局域表面等離子體共振效應 （Localized surface plasmon resonance，LSPR）[2-4].且表面共振強度和頻率與金屬納米結構的尺寸和形態(tài)有著密切關系.而Au或Ag納米結構表面結合一些分子時，在激光的激發(fā)下，它們的拉曼散射信號強度由于其電子躍遷和分子振動的耦合作用，也會極大地得到增強，這種現象通常稱為表面增強拉曼散射效應（Surface enhanced Raman scattering，SERS）[5-8].

納米多孔金盤由于其獨特海綿狀結構，且擁有大量韌帶、孔徑結構和盤狀結構導致了高密度的等離子體共振熱點，進而誘導納米多孔金盤周圍電場明顯增強，使其具有極強的等離子體共振效應[9-11].因此，海綿狀納米多孔金盤（Spongy nanoporous disks，SNPD）是等離子體共振傳感器的理想選擇之一.基于SNPD的諸多優(yōu)勢，Shih課題組[12]設計了一種高靈敏SERS傳感器用于監(jiān)測DNA序列之間的雜交過程.他們將一端修飾有染料Cy3的發(fā)卡式DNA結合在SNPD表面.當加入與頸環(huán)部分互補的目標DNA時，其發(fā)卡式結構展開，致使修飾Cy3的一端遠離SNPD表面，使其SERS信號因距離的增加而逐漸減小，從而達到監(jiān)測DNA雜交過程的目的.在理想狀態(tài)下，該方法能監(jiān)測到單個DNA序列的雜交.同時，該課題組還提出了一種表面增強熒光傳感技術用于識別癌癥生物條形碼，其靈敏度低至2.4 zeptomole[13].然而這些技術都建立在復雜的染料標記基礎上，增加了該類技術的操作成本和繁瑣性.但上述研究結果仍然表明了SNPD具有優(yōu)異的表面等離子體共振效應，為高靈敏識別DNA獨特的二級結構提供了可能性.

端粒DNA主要由重復串聯的富G DNA序列折疊形成，例如（TTAGGG）n，易折疊成 G-四鏈體[14-16].G-四鏈體被認為在哺乳動物基因組中轉錄調節(jié)、DNA復制和基因組穩(wěn)定性等方面都起著至關重要的作用.然而目前很多識別G-四鏈體的方法局限在熒光技術方面[17-18].Bhasikuttan等基于G-四鏈體易與孔雀石綠分子形成復合物的特性，提出了一種簡單的G-四鏈體熒光識別方法[19].由于G-四鏈體與孔雀石綠分子特有的相互作用并沒有在單鏈DNA（ssDNA）和雙鏈 DNA（dsDNA）中發(fā)現，因此該方法能夠用于識別G-四鏈體結構.然而該方法的最低識別濃度為2.0 μmol/L，靈敏度不足.因此，本研究基于SNPD提出一種新的SERS傳感器，用于G-四鏈體的高靈敏識別，且無需經過復雜的標記過程.

1 實驗方法

1.1 SNPD的制備

選取厚度為75 nm的Au/Ag合金薄膜為基底，采用勻速流動注射器在其表面覆蓋一層聚苯乙烯納米顆粒（直徑為460 nm），形成單分子層.通過氧氣電漿對其表面進行刻蝕2 min，其壓力和功率分別設置為4 Pa和100 W.然后將上述刻蝕好的Au/Ag合金薄膜置入氬氣電漿中繼續(xù)刻蝕12 min，其壓力和功率分別是0.27 Pa和100 W，刻蝕結束后將得到表面含有納米盤狀結構的Au/Ag合金薄膜，將其置于氯仿溶液中超聲1 min，以除去表面殘留的聚苯乙烯納米顆粒.最后，將含有納米盤狀結構的Au/Ag合金薄膜浸沒在70%左右的濃硝酸中1 min，以溶解合金薄膜中的Ag成分，形成多孔的海綿狀結構SNPD，采用二次水沖洗3次，以除去表面反應產物和過多的硝酸.并采用鉆石刀將上述SNPD切割成大小為4 mm×5 mm備用.

1.2 G-四鏈體的識別

巰基功能化的端粒DNA （堿基序列為：5’-HS-（CH2）6-TTT TTT TTT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GG-3’）加入至10 mmol/L PBS緩沖液中（pH 為 7.38，且含有 50 mmol/L KCl），加熱至 90 °C，并保持10 min.然后慢慢冷卻至37°C，并培育1.0 h，形成G-四鏈體結構.隨后，將2.0 μL的10 mmol/L tris（2-carboxyethyl）phosphine（TCEP）加 入 至 上 述G-四鏈體溶液中，在室溫條件下保持1.0 h以活化巰基基團.接著將洗凈的4 mm×5 mm SNPD浸沒于上述溶液中，加入 MG（2.0 μmol/L）溶液，反應 30 min后，形成G-四鏈體/MG復合物修飾的SNPD.最后，將上述修飾好的SNPD采用去離子水沖洗其表面，并轉移至0.3 mmol/L MCH溶液中3 h，用于除去MG分子的表面非特異性吸附.

1.3 拉曼測試

圖1 SNPD形貌示意Fig.1 SEM of SNPD and diagram of BT decorated

拉曼測試采用組裝的線性掃描拉曼顯微系統[20]，采用60X物鏡（NA=1.2），激光激發(fā)波長為785 nm，激光聚焦在樣品上的線長度為133 μm，寬度為1.0 μm.曝光時間為10 s.所有的SERS光譜都需基線校正[21].

2 結果與討論

2.1 SNPD表面形貌特征

采用SEM對SNPD的表面形貌進行表征，如圖1所示.

從圖1中可以觀察到SNPD呈現半有序的盤狀結構，且金盤尺寸大小均一，其直徑是360 nm左右（如圖1（a）），其直徑大小主要是由Au/Ag合金表面覆蓋的聚苯乙烯納米顆粒尺寸控制，且隨著聚苯乙烯納米顆粒尺寸的增大而增大.每個金盤均含有高密度的孔徑結構和韌帶結構，孔徑大小為15 nm左右，高度為75 nm左右（如圖1（b））.上述SNPD的半有序盤狀結構，高密度孔徑結構和韌帶結構均能為表面增強拉曼散射提供大量增強熱點和比表面積，也為外來分子提供大量結合位點.SNPD被認為是一種較為理想的SERS傳感基底.

為了更好地計算SNPD的表面增強拉曼散射因子（Enhancement factor，EF），首先將結構簡單的巰基苯（Benzenethiol,BT）組裝在SNPD表面，組裝時間為 30 min，形成單分子層（如圖 1（c）所示），然后依次采用乙醇和二次水清洗SNPD表面，以除去過多的BT，最后測試 BT 的 SERS 光譜（如圖 1（d）所示）.從圖1（d）中明顯觀察到單個SNPD表面上BT的拉曼

ISERS和Ineat分別為SNPD表面的SERS強度和正常拉曼強度；NSERS和Nneat分別為貢獻于SNPD表面SERS強度分子數和貢獻于正常拉曼強度的分子個數.

2.2 G-四鏈體SERS傳感原理

將上述所制備的SNPD作為SERS傳感基底，用于G-四鏈體的高靈敏檢測，其構建示意圖如圖2所示.首先巰基修飾的富G端粒酶DNA序列固定在SNPD表面，隨著K+的加入，該富G DNA序列將折疊成G-四鏈體結構，其能與MG分子產生π-π共軛作用和靜電作用，從而將MG分子捕獲到SNPD表面，因此在SNPD表面大量共振熱點的增強作用下，MG分子能產生強SERS信號.為了減小MG分子的表面非特異性吸附的影響，將MCH分子加入至該傳感體系，其能通過Au-S鍵結合在SNPD表面，占據MG分子的表面非特異性結合位點，以達到除去非特異性吸附的目的.

圖2 基于SNPD的G-四鏈體SERS傳感技術示意Fig.2 Scheme of the SERS sensing for G-quadruplexes detection based on SNPD

2.3 G-四鏈體與MG之間的相互作用

SNPD表面的消光光譜被測試用于研究其表面修飾狀態(tài)及G-四鏈體與MG之間的相互作用.從圖3中可以看出，當SNPD浸沒在G-四鏈體/MG混合溶液中后，其表面吸收波長發(fā)生了明顯的紅移現象，從825 nm紅移至858 nm，紅移波長為32 nm，且在632 nm處出現了一個新的較為明顯的吸收峰（如圖 3（b））.且該波長與 MG 的吸收波長一致[22]，因此632 nm被歸屬于SNPD表面的MG分子吸收峰.上述結果表明G-四鏈體通過-SH與SNPD表面Au相互作用，被結合在了SNPD表面，同時MG也被成功光譜強度在1 075 cm-1處遠大于其正常拉曼光譜強度.通過式（1）可計算出其在1 075 cm-1處的表面增強拉曼散射因子為7.4×108：捕獲至SNPD表面.但是由于MG結合在SNPD表面除了通過G-四鏈體的特異性捕獲外，可能還存在非特異性吸附.因此，本研究采用MCH分子除去非特異性吸附.將上述修飾有G-四鏈體和MG的SNPD轉移至MCH溶液中3 h后，632 nm處的吸收峰強度呈現顯著下降，并伴隨著另一個吸收峰從858 nm紅移至863 nm（如圖3（c））.導致這種現象的主要原因是MCH分子替換了原本結合在SNPD表面上的MG非特異性吸附位點.因此，該結果進一步證實了先前MG可能在SNPD表面存在非特異性的推測，但其能夠被MCH分子替換，從而能夠有效降低MG的非特異性吸附.

2.4 選擇性

圖4顯示了不同DNA修飾SNPD浸沒在MG溶液后，其表面SERS信號的變化.如圖4所示，當ssDNA修飾SNPD和dsDNA修飾SNPD浸沒在MG溶液時，僅在1 100 cm-1處觀察到1個較強的SERS峰信號，該峰來自于MCH分子的Raman振動峰，其余 SERS 峰信號均非常弱（如圖 4（a）和 4（b））.然而，當G-四鏈體修飾SNPD浸沒在MG溶液時，除了在1 100 cm-1處觀察到MCH分子的SERS信號外，也能明顯觀察到其它的SERS信號，且信號強度遠高于ssDNA修飾SNPD和dsDNA修飾SNPD（如圖4（c））.每個新出現的SERS信號歸屬如表1所列，發(fā)現其它的SERS信號均來自于SNPD表面捕獲的MG分子，且峰位置與文獻[23-26]報道一致.上述結果表明G-四鏈體能夠高效捕獲MG分子，而ssDNA與dsDNA對MG分子的捕獲能力較差.因此，這種SERS傳感體系能夠被拓展用于識別G-四鏈體結構.

2.5 靈敏度

通過考察不同G-四鏈體濃度的SERS信號變化來闡明該技術的靈敏度.如圖5所示，在100 pmol/L～100 nmol/L范圍內，SERS信號強度隨著G-四鏈體濃度的增加而迅速增大，當濃度大于100 nmol/L時，SERS強度呈現緩慢增加，并趨于平衡.這主要歸因于隨著G-四鏈體濃度的增加，捕獲的MG分子數量越多，從而引起MG的SERS信號增大.當SNPD表面G-四鏈體結合位點均被MG分子占據時，此時SERS信號最大，并保持平衡.以SERS信號高于噪音信號3倍為限（S/N＝3），發(fā)現該SERS傳感器能識別到最低G-四鏈體濃度為100 pmol/L，遠低于其它相關文獻報道的熒光方法[27-28]，表明該方法對G-四鏈體檢測顯示出高靈敏性.

圖3 SNPD在不同修飾階段的消光光譜Fig.3 Extinction spectra of NPG disks at different modification steps

表1 MG分子的SERS光譜中Raman位移及其強度和歸屬Table 1 The Raman shifts,relative intensity,and band assignments for the SERS spectra of MG

圖4 不同DNA修飾SNPD的SERS光譜（在此所有的DNA濃度均為1.0 μmol/L）Fig.4 SERS spectra of different DNA modified NPG disks

圖5 該傳感技術對不同G-四鏈體DNA濃度的識別Fig.5 Dependence of G-quadruplexes concentrations on the sensing system:the SERS spectra

3 結 論

1）基于Au/Ag合金薄膜制備了一種海綿狀多孔納米金盤材料.該納米金盤高度約為75 nm，直徑約為360 nm，其內部孔徑大小約為15 nm.

2）將海綿狀多孔納米金盤作為SERS傳感基底，建立了一種高靈敏檢測G-四鏈體的SERS傳感器，其檢測限低至100 pmol/L，且具有良好的選擇性，能從ssDNA和dsDNA中識別出G-四鏈體結構.

3）引起上述SERS傳感技術高靈敏和高選擇性的原因主要歸為兩方面：一是SNPD表面的高密度韌帶和孔徑結構為SERS傳感器提供了大量共振增強熱點；二是G-四鏈體能夠高效捕獲MG分子至SNPD表面，而ssDNA和dsDNA并未發(fā)現明顯捕獲MG分子的能力.