王 兵,杜 兵,王代琴,覃 海,韋鵬威,姚 楊,萬(wàn) 珊,王 濤,吳建偉

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院 生物技術(shù)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)藥生物技術(shù)工程研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 微生物免疫科，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025；5.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

超級(jí)耐藥菌的出現(xiàn)，使人們愈發(fā)意識(shí)到病原菌抗生素耐藥問(wèn)題的嚴(yán)重性，傳統(tǒng)抗生素現(xiàn)已不能滿足耐藥病原菌臨床治療的需求[1-4]?？咕氖墙陙?lái)新興的新型抗菌劑，關(guān)于其對(duì)病原菌的研究也有諸多報(bào)道[5-7]。Li等[8]發(fā)現(xiàn)眼鏡王蛇蛇毒抗菌肽OH-CATH30對(duì)臨床耐藥銅綠假單胞菌引起的角膜炎具有很好的治療效果。Wei等[9]發(fā)現(xiàn)了一種既具有強(qiáng)抗菌能力又可抑制炎癥反應(yīng)的新型抗菌肽Cathelicidin-P Y。 Chromek等[10]發(fā)現(xiàn)cathelicidin型抗菌肽LL37可以保護(hù)尿路防止被大腸桿菌侵入感染?？咕挠捎诳蛇M(jìn)行多靶點(diǎn)作用，不易產(chǎn)生耐藥性，因而已成為新型抗菌劑藥物候選者和研究的熱點(diǎn)[7,11-12]。

家蠅(housefly,Muscadomestica)又名蒼蠅，能夠在臟而復(fù)雜的環(huán)境中生存，很大程度上是依賴其強(qiáng)大的免疫系統(tǒng)[13-15]。而抗菌肽則是其免疫系統(tǒng)中非常重要的一類物質(zhì)，在其天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。防御素則是抗菌肽中被研究的較多的一種[12,16]。Phormicin 是早在1989年于綠蠅(Phormiaterranovae)中被首先發(fā)現(xiàn)的，被稱為綠蠅防御素的抗菌肽，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了2個(gè)成員Phormicin A、B，但二者只相差一個(gè)氨基酸，且只對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制效果[17-18]。大腸桿菌是在臨床造成尿路感染的一種常見(jiàn)菌[10]。

筆者及所在課題組已經(jīng)克隆了家蠅防御素家族Phormicin A、B基因，將去掉信號(hào)肽的部分分別構(gòu)建于原核表達(dá)載體pET28a上，之后采用原核表達(dá)法獲得了二者蛋白。本研究以家蠅防御素家族PhormicinA、B抗菌肽為研究對(duì)象，探究其原核表達(dá)蛋白對(duì)大腸桿菌的作用效果，并繪制了時(shí)間抑菌曲線，以期為抗臨床大腸桿菌抗感染藥物的研發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株E.coliDH5α克隆菌株、E.coliBL21(DE3)表達(dá)菌株，北京索萊寶有限公司；E.coli標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922)，由貴州醫(yī)科大學(xué)微生物教研室王濤老師提供；質(zhì)粒pET-28a(+)，北京安諾倫生物科技有限公司；質(zhì)粒pMD19-T，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 酶與主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶，美國(guó)NEB公司；質(zhì)粒小抽試劑盒、DNA回收試劑盒， 杭州AXYGEN愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；Ni-NTA His.Bind蛋白純化試劑盒、其他相關(guān)耗材，德國(guó)Merck公司；Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白電泳試劑盒，北京索萊寶有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因片段的擴(kuò)增及質(zhì)粒構(gòu)建

以家蠅cDNA為模板，采用PCR法擴(kuò)增，利用分子生物學(xué)方法，并將不含信號(hào)肽的部分片段插入到pET28a載體上構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒,所用引物有Phormicin A 28 F：C￣T￣A￣G￣C￣T￣A￣G￣C￣T￣C￣T￣C￣C￣T￣G￣C￣C￣C￣C￣C￣A￣A￣A￣G￣A￣G￣G￣A￣A￣G; Phormicin A 28 R：C￣C￣G￣C￣T￣C￣G￣A￣G￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣G￣C￣A￣A￣A￣C￣A￣C￣A￣A￣A￣C￣A￣C￣C￣C; Phormicin B 28 F：C￣T￣A￣G￣C￣T￣A￣G￣C￣T￣T￣G￣C￣C￣C￣G￣C￣A￣G￣A￣G￣G￣A￣A￣G￣C￣C￣A￣A￣C; Phormicin B 28 R：C￣C￣G￣C￣T￣C￣G￣A￣G￣A￣T￣T￣A￣C￣G￣G￣C￣A￣A￣A￣C￣A￣C￣A￣T￣A￣C￣A￣G￣C￣C￣C￣T￣G￣C。

1.2.2 目的蛋白的原核表達(dá)及檢測(cè)

將構(gòu)建好的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取單克隆37 ℃搖菌并保種。將菌種接入無(wú)菌LB培養(yǎng)基中，放入37 ℃、200 r/min 恒溫?fù)u床培養(yǎng)2.5 h，酶標(biāo)儀測(cè)OD600。當(dāng)OD600介于0.3～0.5時(shí)，取出菌液并冷卻到4 ℃后實(shí)驗(yàn)組加入誘導(dǎo)劑IPTG，使誘導(dǎo)劑的最終0.4～0.6 mmol/L。加好IPTG后，繼續(xù)放入22 ℃、160 r/min恒溫?fù)u床繼續(xù)培養(yǎng)6～12 h。棄上清后離心(本文中如無(wú)特殊說(shuō)明，離心均采用12 000 r/min)收集菌體，高壓均質(zhì)儀破碎后PBS緩沖液重懸備用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，再次離心，分為上清和沉淀。若目的蛋白在沉淀中，則加入8 mol/L尿素促溶解后放入透析袋。梯度透析法對(duì)目的蛋白進(jìn)行透析和重折疊[19-20]。將折疊后目的蛋白粗懸液用濾膜過(guò)濾除雜。通過(guò)Ni-NTA His.Bind蛋白純化試劑盒純化制備目的蛋白。分別加入蛋白上樣緩沖液后煮沸制備蛋白電泳樣品。Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白電泳試劑盒制備小分子膠(16.5%分離膠，10%夾層膠，4%濃縮膠)后，上樣、電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，冰醋酸脫色后，檢測(cè)目的蛋白表達(dá)及純化情況。為進(jìn)一步確定蛋白濃度，可用Nanodrop 2000設(shè)備和BCA試劑盒共同測(cè)定蛋白樣品濃度。

1.2.3 微量液體稀釋法測(cè)定抗菌肽原核表達(dá)蛋白的最小抑菌濃度(MIC)

提前1 d將大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株劃線于LB平板上，挑取單克隆菌體接種搖菌12 h左右。將搖好的菌液用生理鹽水稀釋至0.5的麥?zhǔn)媳葷釢舛?約為1×108個(gè)/mL，以比濁卡和比濁管來(lái)配置和稀釋。取1640RPMI無(wú)血清培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基100 uL于無(wú)菌96孔板中，按相應(yīng)比例計(jì)算好的樣品濃度，分別加入卡那、咪唑和目的蛋白懸液后，接入相應(yīng)的菌種，總體積200 uL。37℃、120 r/min培養(yǎng)3～6 h或根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要培養(yǎng)到相應(yīng)的時(shí)間。酶標(biāo)儀測(cè)定96孔板每孔的OD600值，并將96孔板拍照。根據(jù)孔板顏色變化，可以計(jì)算出其MIC值。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，避免誤檢，將相應(yīng)孔的混合物吹打均勻后涂布平板，培養(yǎng)12～16 h后，進(jìn)一步觀察是否有菌生長(zhǎng)及菌落生長(zhǎng)密度。根據(jù)二者結(jié)果，綜合測(cè)定其MIC值。

1.2.4 原核表達(dá)蛋白對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株時(shí)間生長(zhǎng)曲線的繪制

從接種到加藥和目的蛋白過(guò)程同上1.2.3。同時(shí)做多個(gè)平行組，到達(dá)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后，酶標(biāo)儀測(cè)定0、1、2、3、4、5、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30 h的OD600值。最后，統(tǒng)一統(tǒng)計(jì)并分析數(shù)據(jù)作圖。通過(guò)比較OD值的大小，繪制時(shí)間生長(zhǎng)曲線，來(lái)分析目的蛋白對(duì)于大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株生長(zhǎng)的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 家蠅防御素家族Phormicin A、B基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

參照NCBI基因庫(kù)中家蠅Phormicin A、B的序列信息(基因序列號(hào)為L(zhǎng)OC101887709-8、LOC101888043-5)來(lái)設(shè)計(jì)引物，采用PCR法從家蠅cDNA中擴(kuò)增目的片段，測(cè)得序列后，利用分子生物學(xué)方法將去掉信號(hào)肽的部分構(gòu)建于原核表達(dá)載體pET28a上。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，再次用引物篩克隆(圖1)測(cè)序后并保存菌種。

M代表標(biāo)準(zhǔn)DNA,從上至下條帶分別為2 000、1 000、750、500、250和100 bp；1、2、3、4泳道為PCR擴(kuò)增的目的片段，約為270 bp;-代表陰性對(duì)照?qǐng)D1 PCR篩選單克隆菌種DNA電泳Fig.1 The DNA agrose map of Phormicin A and B prokaryotic expression monoclone bacteria seeds by PCR screen method

此外，對(duì)家蠅Phormicin A、B基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)分析，并采用N-J法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。由圖1和2可知：家蠅Phormicin 屬于防御素家族，因翻譯成中文是綠蠅肽，家蠅綠蠅肽，不太通順，因此選用英文原稱表述。最后構(gòu)建了二者去掉信號(hào)肽之后蛋白對(duì)應(yīng)序列的原核表達(dá)載體，為下一步原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。

圖2 家蠅Phormicin A、B氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹Fig.2 The multisequence alignment map and phylogenetic tree of housefly Phormicin A and B

2.2 家蠅Phormicin A、B蛋白的原核表達(dá)及親和純化

采用IPTG誘導(dǎo)法，表達(dá)并純化了家蠅Phormicin A、B的原核表達(dá)蛋白。然后通過(guò)Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白電泳，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。由圖3可知：家蠅Phormicin A蛋白在上清和沉淀中都有表達(dá)，而B蛋白則在上清中表達(dá)稍多，沉淀中也有少量表達(dá)。二者在去掉信號(hào)肽后剩余70和69個(gè)氨基酸，但構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28a中時(shí)，在片段的N段和C端都帶上了His標(biāo)簽，還有載體上部分表達(dá)的氨基酸，綜合來(lái)說(shuō)約有90個(gè)氨基酸，因此根據(jù)估算，蛋白大小約為(9～10)×103。IPTG小規(guī)模誘導(dǎo)后進(jìn)行小分子蛋白電泳實(shí)驗(yàn)。由圖3還可知：成功誘導(dǎo)了家蠅Phormicin A、B蛋白的原核表達(dá)。另外，在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)用的是大腸桿菌DH5α克隆菌株，原核表達(dá)用的是大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌株，還有后面實(shí)驗(yàn)用的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，三者為大腸桿菌不同的株系，因?yàn)榘l(fā)揮作用及用途不同而分別命名。此3株大腸桿菌為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中比較常用的菌株。

C代表control 未誘導(dǎo)對(duì)照組；S代表上清樣品；P代表沉淀樣品；M代表Mark圖3 Tricine-SDS-PAGE檢測(cè) Phormicin A、B原核表達(dá)蛋白Fig.3 The Tricine-SDS-PAGE map of prokaryotic expression Phormicin A and B protein

在成功進(jìn)行二者目的蛋白的原核表達(dá)后，采用Ni-NTA His.Bind蛋白純化試劑盒純化制備目的蛋白。大規(guī)模誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)家蠅Phormicin A、B蛋白在沉淀中遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于在上清中的表達(dá)，這可能暗示著其對(duì)宿主大腸桿菌的生長(zhǎng)可能有影響，而大部分都以包涵體的形式被包裹起來(lái)。于是采用尿素溶解，透析袋梯度透析復(fù)性法，制備二者的蛋白懸液[19-21]。

接下來(lái)采用Ni-NTA His.Bind蛋白純化試劑盒純化制備目的蛋白。在純化上柱子前，先用過(guò)濾器將雜質(zhì)進(jìn)行初步排除，否則親和純化柱容易被堵。純化的基本原理是通過(guò)活化的親和樹脂柱將帶有His標(biāo)簽的目的蛋白吸附到樹脂上，然后用洗脫緩沖液進(jìn)行沖洗，將非特異結(jié)合的多余雜蛋白洗脫下來(lái)。最后用合適濃度和體積的咪唑?qū)⒛康牡鞍紫疵撓聛?lái)，收集起來(lái)。因?yàn)镠is組蛋白含有咪唑基團(tuán)，咪唑洗脫時(shí)，是與樹脂發(fā)生親和置換反應(yīng)，此方法也是在蛋白表達(dá)純化中，用的較多的一種。除此之前，還有谷胱甘肽疏基轉(zhuǎn)移酶GST標(biāo)簽，麥芽糖蛋白標(biāo)簽等的標(biāo)簽和蛋白純化方法。但是，GST標(biāo)簽等大概約27×103相對(duì)較大，如果要做后續(xù)的活性功能實(shí)驗(yàn)，還需要用特定的酶將標(biāo)簽切除，然后通過(guò)超濾離心等方法再收集目的蛋白。這樣目的蛋白相對(duì)損失較多，得率不高，程序復(fù)雜一些，成本相對(duì)高一些，但大部分都是可溶性表達(dá)，有利于活性檢測(cè)。如果不切除標(biāo)簽，可能對(duì)目的蛋白活性有干擾，而Phormicin A、B蛋白相對(duì)又較小，因此，綜合考慮用His標(biāo)簽，用Ni-NTA His.Bind法純化目的蛋白。

2.3 家蠅Phormicin A、B原核表達(dá)蛋白作用于大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的活性分析

在制得目的蛋白懸液后，采用微量液體稀釋法，來(lái)檢測(cè)目的蛋白對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株生長(zhǎng)的影響。由圖4可知：家蠅Phormicin A、B對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)具有一定的抑制效果。圖4(a)是微量液體稀釋法測(cè)得的結(jié)果，由圖4(a)可知：前面4～5孔相對(duì)清澈，表明菌體生長(zhǎng)較少或者不長(zhǎng)菌，到最后4～5孔發(fā)現(xiàn)相對(duì)渾濁，表明已經(jīng)長(zhǎng)了很多菌。從第1～10孔是按照表1表格中的濃度依次倍比稀釋過(guò)來(lái)，濃度逐漸降低。為了更進(jìn)一步測(cè)量，又用酶標(biāo)儀測(cè)量了每個(gè)孔OD600，圖4(b)。由圖4和表1可知：從第6孔往后，OD明顯增大，表明菌體明顯增多。而前面1～5孔則OD相對(duì)較小，說(shuō)明加的藥物組相對(duì)自然生長(zhǎng)組是抑菌活性，但是由于是在3 h左右就測(cè)了，OD過(guò)小，不能夠很好的說(shuō)明問(wèn)題，存在一定的誤差。于是，又將一些孔通過(guò)平板涂布法，進(jìn)一步確定具有抑菌效果最低濃度孔?？菫榈?孔,最小抑菌濃度(MIC)是4 mmol/L；咪唑?yàn)榈?孔，MIC為15.63 mmol/L； A蛋白是第3孔，MIC為20 mmol/L；B蛋白是第4孔，MIC為7.5 mmol/L。由于Phormicin A、B原核表達(dá)蛋白是用咪唑洗脫下來(lái)的，是蛋白與咪唑的混合物，從分析表格中濃度發(fā)現(xiàn)：A、B蛋白中咪唑濃度12.5和6.25 mmol/L要小于咪唑本身的最小抑菌濃度15.63 mmol/L。

圖4 Phormicin A、B、咪唑、Kna+對(duì)大腸桿菌影響的MIC檢測(cè)Fig.4 Inhibition activity analysis of Phormicin A and B,imidazole,Kna+ to E. coli by MIC method

樣品ρ(孔)/(mmol·L-1)12345678910Kna25612864321684210.5咪唑50025012562.531.2515.637.813.911.950.98A蛋白8040201052.51.250.6250.3120.156含有咪唑502512.56.253.1251.5630.7810.3910.1950.098B蛋白6030157.53.751.8750.9380.4690.2340.117含有咪唑502512.56.253.1251.5630.7810.3910.1950.098

2.4 家蠅Phormicin A、B蛋白作用大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的時(shí)間生長(zhǎng)曲線

為了更進(jìn)一步追蹤家蠅Phormicin A、B蛋白對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的影響，同時(shí)為了觀察在不同時(shí)間段內(nèi)，二者對(duì)于大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株生長(zhǎng)變化的作用，選取從第1 h，直到第30 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600表征大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的濃度。由圖5和6可知：在前3～4 h內(nèi)，藥物組OD偏小，隨著時(shí)間的推移，OD逐漸增大，差異也更明顯。根據(jù)測(cè)得的結(jié)果繪制了大腸桿菌的時(shí)間生長(zhǎng)曲線，其中黑色方形代表自然生長(zhǎng)對(duì)照組，紅色代表卡那陽(yáng)性對(duì)照組，藍(lán)色代表咪唑組，綠色代表A蛋白組，紫色代表B蛋白組。2 MIC代表殺菌濃度即MBC是最小抑菌濃度的2倍，最初基本不長(zhǎng)菌，或者只長(zhǎng)很少的菌。1 MIC即最小抑菌濃度，0.5 MIC則是最小抑菌濃度的一半，抑菌效果更差一些。

圖5 家蠅Phormicin A、咪唑、Kna+對(duì)大腸桿菌 標(biāo)準(zhǔn)株的時(shí)間生長(zhǎng)曲線Fig.5 The time growth curve of the standard E. colistrain affect by housefly Phormicin A,imidazole and Kna+

由圖5可知：A蛋白2倍，1倍，0.5倍MIC相對(duì)其他對(duì)照組(natural group)，都具有一定的抑菌效果，在10～12 h期間更為明顯，且隨著濃度的減小，抑菌效果減小。由圖6可知：B蛋白也是如此。但相對(duì)而言，B蛋白抑菌效果要稍好于A蛋白。綜合分析，雖然二者都具有一定的抑菌效果，但距離臨床應(yīng)用其效果仍然不夠理想。目前研究報(bào)道的抗菌肽多為體外合成，受合成條件和技術(shù)的限制，合成的多為40個(gè)氨基酸以內(nèi)的小分子，最多不超過(guò)100個(gè)氨基酸，而且合成的多肽往往只具有簡(jiǎn)單的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，無(wú)法獲得更高級(jí)的三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，合成的抗菌肽可能與昆蟲等生物體內(nèi)本來(lái)的構(gòu)象差別較大，很多難以達(dá)到理想的效果。根據(jù)抗菌肽研究的相關(guān)報(bào)道[22]，目前想要獲得功能活性較好的抗菌肽，往往構(gòu)建基因工程載體，找到合適的表達(dá)條件，嘗試采用更好的表達(dá)方法，實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，直接純化出來(lái)，可能具有更為理想的作用效果，這也是抗菌肽研究的一個(gè)難點(diǎn)。而采用原核表達(dá)方法，雖然可以獲得較大量的蛋白，但很多抗菌肽作為包涵體往往在沉淀中?？赡芤欢ǔ潭壬弦灿绊懥似涔δ埽荒軌蜻_(dá)到體內(nèi)構(gòu)象所具有的效果。如果從天然樣本中直接分離純化，則需要的樣本量又較大。采用昆蟲細(xì)胞或者酵母等表達(dá)系統(tǒng)，獲得的蛋白量又相對(duì)較少，成本相對(duì)較高?？傮w說(shuō)來(lái)，找到一種合適的表達(dá)或生產(chǎn)抗菌肽的方法，對(duì)于精確研究其功能具有重要的意義，也是后續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究進(jìn)一步努力的方向。

圖6 家蠅Phormicin B、咪唑、Kna+對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的時(shí)間生長(zhǎng)曲線Fig.6 The time growth curve of the standard E. colistrain affect by housefly Phormicin B,imidazole and Kna+

3 結(jié)論

采用原核表達(dá)法制備了其融合蛋白，并作用于大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株。通過(guò)微量液體稀釋法測(cè)定其最小抑菌濃度分別為20 和7.5 mmol/L，并繪制了二者作用于大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的時(shí)間生長(zhǎng)曲線。發(fā)現(xiàn)二者對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。本研究為臨床大腸桿菌感染抗菌肽類藥物的研發(fā)，提供了新的思路和一定的參考。