白 芳，李映紅，吳正治，黃飛娟,3

(1.深圳大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 深圳 518035；2.深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所，廣東 深圳 518020；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510080)

烏骨雞(Black-Bone Silky Fowl,GallusgallusdomesticusBrisson)，是一種具有藥用價(jià)值的雞種。研究證明，烏骨雞對(duì)各類(lèi)虛癥，如氣虛、血虛、脾虛、腎虛和心虛等均有良好療效[1-3]。烏骨雞活性肽，即烏骨雞肌肉蛋白通過(guò)一定優(yōu)化工藝酶促水解后獲得的具有較小分子量范圍的多肽產(chǎn)物，分子量集中在3 000以下，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、更易吸收[4-5]。烏骨雞多肽內(nèi)部普遍存在功能區(qū)，這些功能區(qū)的研究對(duì)于烏骨雞活性肽臨床價(jià)值的充分利用尤其重要。然而，烏骨雞活性肽的分離純化是研究其應(yīng)用價(jià)值的基礎(chǔ)。

目前用于烏骨雞多肽的分離技術(shù)最為常見(jiàn)的有凝膠過(guò)濾色譜法和反相液相色譜法，常用的分離體系為甲醇和乙腈體系等[6-9]。根據(jù)多肽混合物進(jìn)入分析級(jí)反相色譜柱時(shí)表現(xiàn)的極性和進(jìn)入凝膠色譜柱時(shí)分子量的不同進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)的分離純化[10]。反相色譜柱分離純化效果一般較凝膠色譜柱好，但不能表現(xiàn)出多肽分子量通過(guò)色譜柱的前后次序；乙腈比甲醇分離效果好，但其價(jià)格昂貴[11]。在多肽的分離純化中，一般將凝膠過(guò)濾色譜法和反相液相色譜法結(jié)合使用[12-13]。然而，根據(jù)這兩種不同原理，選擇不同流動(dòng)相及其他參數(shù)等的各自分離條件及分離效果如何，并沒(méi)有統(tǒng)一性。

為解決上述多肽分離純化的共性問(wèn)題，同時(shí)提供藥用價(jià)值突出的烏骨雞多肽的最佳分離條件，本研究中，筆者主要針對(duì)目前常用酶解工藝流程制備烏骨雞活性肽，即木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)烏骨雞肌肉蛋白進(jìn)行充分酶解后，采用高效液相色譜(配置PDA全波長(zhǎng)檢測(cè)器)(HPLC-PDA)法對(duì)C18反相色譜柱(0.1%三氟乙酸或磷酸鈉/甲醇/水體系)及TSKgel凝膠色譜柱(0.1%三氟乙酸/乙腈/水體系)的多肽分離條件分別進(jìn)行優(yōu)化，從流動(dòng)相、物料比、流速、進(jìn)樣量、波長(zhǎng)等方面進(jìn)行探究，以出峰數(shù)為主，結(jié)合分離度、峰形、基線、信號(hào)等考察其分離效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

食品級(jí)木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，廣州裕立寶科技有限公司；BCA蛋白檢測(cè)分析試劑盒，美國(guó)Thermo公司；三氟乙酸、甲醇及乙腈為色譜純，美國(guó)Sigma公司；NaOH及Na3PO4為國(guó)產(chǎn)分析純，廣東光華科技股份有限公司。

1.2 主要儀器

膠體磨，南通澳德精密機(jī)械公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；島津LC20 AD型高效液相色譜儀(配置PDA全波長(zhǎng)檢測(cè)器)、C18色譜柱Inertsil SOD-SP(5 μm,150 mm×4.6 mm)及凝膠色譜柱TSKgel G2000 SWxl (5 μm,300 mm×7.8 mm)，日本島津公司。

1.3 烏骨雞活性肽制備

選取江西省泰和烏骨雞，體質(zhì)量1.5 kg左右，雌雄各半(各10只)。復(fù)合酶解法制備烏骨雞活性肽[14]。烏骨雞肌肉蒸煮后，絞碎再加入膠體磨進(jìn)一步磨碎，加入木瓜蛋白酶(4 000 U/g)和風(fēng)味蛋白酶(2 000 U/g)進(jìn)行酶解，其中酶解溫度為55 ℃，酶解時(shí)間為3.5 h，沸水高溫保持20 min進(jìn)行滅酶，4 000 r/min離心15 min，分去上層油脂和下層沉淀物，取中層液，即為烏骨雞活性肽溶液。按照BCA蛋白檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量，結(jié)果為1.597 mg/mL。

1.4 反相液相色譜法優(yōu)化烏骨雞活性肽分離條件

選擇C18反相液相色譜法常用分離體系[15]：0.1%三氟乙酸或pH 6.0磷酸鹽/甲醇/水體系，對(duì)烏骨雞活性肽進(jìn)行流動(dòng)相物質(zhì)配比、流速、進(jìn)樣量及波長(zhǎng)的選擇。首先，設(shè)置流動(dòng)相體系為0.1%三氟乙酸/甲醇/水體系，甲醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)為20%、10%、8%、6%，對(duì)應(yīng)流速依次為0.8、0.5、0.3和0.2 mL/min，同時(shí)選擇進(jìn)樣量10 μL、柱溫30 ℃、進(jìn)樣室溫度4 ℃、測(cè)試時(shí)間30 min進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。然后，流動(dòng)相0.1%三氟乙酸/6%甲醇/水體系中更換三氟乙酸為磷酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié)磷酸鹽緩沖液pH 至 6.0，進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。此時(shí)，進(jìn)樣量分別設(shè)為5、10、50 μL，流速為0.2 mL/min，其他條件如上。

1.5 凝膠過(guò)濾色譜法優(yōu)化烏骨雞活性肽分離條件

TSKgel凝膠過(guò)濾色譜法進(jìn)行烏骨雞活性肽的分離[16]，首先選擇甲醇/水體系進(jìn)行分離優(yōu)化，但優(yōu)化效果不理想，更換為0.1%三氟乙酸/乙腈/水體系進(jìn)行分離優(yōu)化。采用0.1%三氟乙酸/15%乙腈/水均勻無(wú)梯度洗脫，進(jìn)樣量設(shè)為10 μL、流速0.5 mL/min、柱溫30 ℃、進(jìn)樣室溫度4 ℃、測(cè)試時(shí)間30 min進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。然后，采用0.1%三氟乙酸/(15%～65%)或(10%～25%)乙腈/水體系均勻上升梯度洗脫30 min，同時(shí)設(shè)置不同流速或不同進(jìn)樣量進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒重復(fù)檢測(cè)3次，外標(biāo)法進(jìn)行樣品蛋白的定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 反相液相色譜法分離烏骨雞活性肽的優(yōu)化結(jié)果分析

2.1.1 反相液相色譜法最佳優(yōu)化結(jié)果

圖1 C18反相液相色譜法優(yōu)化烏骨雞活性肽的分離條件Fig.1 Optimizing isolation condition of peptides by C18 reversed-phase chromatography

三氟乙酸及磷酸鹽作為緩沖液時(shí)，反相液相色譜法分離烏骨雞活性肽的最佳分離情況如圖1所示。由圖1可知：在分離小分子多肽時(shí)，反相液相色譜法的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果為C18柱-0.1%三氟乙酸或pH 6.0磷酸鹽/6%甲醇/水體系-流速0.2 mL/min-進(jìn)樣量5或10 μL-波長(zhǎng)254 nm(10 μL)或220(5 μL)。此處，若結(jié)合分離度進(jìn)行選擇時(shí)，應(yīng)選擇C18柱-pH 6.0磷酸鹽/6%甲醇/水體系-流速0.2 mL/min -進(jìn)樣量5 μL -波長(zhǎng)220 nm，此時(shí)出峰距離相對(duì)較大，分離度和峰形均較好。

2.1.2 反相液相色譜法優(yōu)化過(guò)程分析

本實(shí)驗(yàn)中，筆者主要考察C18色譜柱、緩沖液、甲醇、流速、進(jìn)樣量和波長(zhǎng)等指標(biāo)對(duì)烏骨雞多肽分離效果的影響。在常用流動(dòng)相0.1%三氟乙酸/甲醇/水體系中固定其他條件，變換甲醇濃度和流速大小，優(yōu)化過(guò)程如表1所示。由表1可知：隨著甲醇含量降低，流速降低，出峰數(shù)增加；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)6%、流速0.2 mL/min時(shí)，分離效果最好。當(dāng)把三氟乙酸換為磷酸鹽(6%甲醇/水中加入4% 0.02 mol/L NaH2(PO4)3溶液，H3PO4調(diào)節(jié)pH至6.0)時(shí)，流速0.2 mL/min，當(dāng)三氟乙酸或磷酸鹽作為緩沖液時(shí)，出峰數(shù)基本一致，但三氟乙酸作為緩沖液時(shí)分離峰相對(duì)集中。進(jìn)樣量為50 μL時(shí)，220 nm處吸收較強(qiáng)，254 nm處分離效果較好；進(jìn)樣量為5 μL時(shí)，220 nm處分離效果較好，254 nm處吸收弱。190 nm處均無(wú)吸收，在280 nm處總體出峰數(shù)不如254 nm處的效果。

表1 反相液相色譜法分離烏骨雞活性肽的優(yōu)化過(guò)程

2.1.3 反相液相色譜法優(yōu)化烏骨雞活性肽分離條件的應(yīng)用

通常對(duì)一次分離中分辨率不好的親水性多肽混合物進(jìn)行二次分離，可以得到多個(gè)新肽，同時(shí)放大到制備級(jí)HPLC中，結(jié)合質(zhì)譜共同引導(dǎo)實(shí)現(xiàn)多肽的全自動(dòng)化分離和收集[13]。由于C18反相色譜柱的柱效高，TSKgel凝膠色譜柱可以用來(lái)確定分離物分子量分布，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中通常將優(yōu)化的分析級(jí)反相色譜法和凝膠色譜法相互結(jié)合使用[17]。本實(shí)驗(yàn)中，C18反相液相色譜法采用甲醇/水體系進(jìn)行優(yōu)化分析，需要更為精細(xì)的優(yōu)化時(shí)，可將其梯度洗脫體系或乙腈體系作為流動(dòng)相代替其進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

2.2 凝膠色譜柱過(guò)濾色譜法分離烏骨雞活性肽的優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.1 凝膠過(guò)濾色譜法優(yōu)化結(jié)果

TSKgel-三氟乙酸/乙腈/水體系中，研究不同波長(zhǎng)條件下TSKgel凝膠過(guò)濾色譜法優(yōu)化烏骨雞活性肽，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：在分離小分子多肽時(shí)，凝膠過(guò)濾色譜法的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果為T(mén)SKgel柱-0.1%三氟乙酸/(10%～25%)乙腈/水體系-流速0.5 min/mL-進(jìn)樣量5 μL-波長(zhǎng)220 nm。若不考察出峰數(shù)，只考察分離度和峰形進(jìn)行選擇時(shí)，應(yīng)選擇的優(yōu)化結(jié)果為T(mén)SKgel柱-0.1%三氟乙酸/(15%～65%)乙腈/水體系-0.5 min/mL流速-進(jìn)樣量10 μL -波長(zhǎng)254 nm，此時(shí)出峰數(shù)較少，但分離度和峰形都較好。

圖2 TSKgel凝膠過(guò)濾色譜法優(yōu)化烏骨雞活性肽的分離條件Fig.2 Optimizing isolation condition of peptides by TSKgel filtration chromatography

2.2.2 凝膠過(guò)濾色譜法優(yōu)化過(guò)程分析

主要考察凝膠色譜柱、乙腈、流速、進(jìn)樣量和波長(zhǎng)等指標(biāo)對(duì)烏骨雞多肽分離效果的影響，優(yōu)化過(guò)程如表2所示。由表2可知：乙腈梯度洗脫時(shí)，分離效果最好，隨著梯度中乙腈含量降低至一定程度，出峰數(shù)增加至最大。當(dāng)變換流速時(shí)，流速為0.4或0.5 mL/min時(shí)，分離效果一致好于流速為0.3 mL/min時(shí)。當(dāng)進(jìn)樣量為5、10 μL時(shí)，波長(zhǎng)對(duì)峰形、出峰數(shù)幾乎無(wú)影響。波長(zhǎng)為190 nm時(shí)樣品均無(wú)吸收，且當(dāng)波長(zhǎng)為254和280 nm時(shí)，樣品的吸收強(qiáng)度較小。

表2 凝膠過(guò)濾色譜法分離烏骨雞活性肽的優(yōu)化過(guò)程

2.2.3 凝膠過(guò)濾色譜法優(yōu)化烏骨雞活性肽分離條件的應(yīng)用

在使用凝膠色譜柱-三氟乙酸/乙腈/水體系之前，筆者采用了價(jià)格低廉的三氟乙酸/甲醇/水體系的梯度洗脫條件分離烏骨雞活性肽，但該體系分離烏骨雞多肽效果不理想，可能是由于凝膠柱的柱效差或甲醇洗脫效果不好等因素導(dǎo)致[18]，故采用乙腈/水體系進(jìn)行分離條件優(yōu)化。另外，在采用凝膠色譜法分離時(shí)，并未使用磷酸鹽作緩沖液，是因?yàn)槿宜嶙骶彌_液時(shí)，未見(jiàn)相對(duì)集中的分離峰出現(xiàn)。根據(jù)峰的保留時(shí)間分段收集凝膠色譜法分離樣品后得到的餾分，再結(jié)合C18反相色譜法進(jìn)行餾分分離，這樣可實(shí)現(xiàn)多肽不同分子量段的深入分離、純化及分析等[17]。當(dāng)混合多肽過(guò)于復(fù)雜、目標(biāo)物質(zhì)相對(duì)豐度較低時(shí)，可先使用本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)優(yōu)化的凝膠色譜法的分離條件，然后采用甲醇或乙腈梯度洗脫體系繼續(xù)優(yōu)化C18色譜分離條件，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的純化。

3 結(jié)論

反相液相色譜法分離小分子多肽的優(yōu)化條件：C18柱-pH 6.0磷酸鹽/6%甲醇/水體系-流速0.2 mL/min-進(jìn)樣量5 μL-波長(zhǎng)220 nm。凝膠過(guò)濾色譜法分離小分子多肽的優(yōu)化條件：TSKgel柱-0.1%三氟乙酸/(10%～25%)乙腈/水體系-流速0.5 mL/min-進(jìn)樣量5 μL-波長(zhǎng)220 nm。當(dāng)使用反相液相色譜法分離小分子多肽時(shí)，隨甲醇含量及流速的降低，出峰數(shù)增加；三氟乙酸或磷酸鹽作緩沖液時(shí)出峰數(shù)幾乎一致，但分離度不同。凝膠色譜法分離小分子多肽時(shí)，乙腈梯度洗脫較無(wú)梯度洗脫分離效果好，且乙腈梯度濃度降低到一定程度后，分離效果不變。該研究為烏骨雞多肽及多肽類(lèi)天然食品的精細(xì)分離純化提供參考。