楊 威，嚴(yán)立石，劉 航，胡翠英，扶教龍，鞠 鑫，李良智

(蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009)

木質(zhì)纖維素作為一種廣泛存在的生物質(zhì)資源，現(xiàn)階段并沒有得到充分的利用。將木質(zhì)纖維素酶解轉(zhuǎn)化為生物燃料等，不僅可避免廢棄生物質(zhì)帶來的環(huán)境污染問題，還可在一定程度上緩解化石燃料短缺的能源危機(jī)。目前，將木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化已成為國內(nèi)外的研究熱點[1]。

采用纖維素酶進(jìn)行酶解轉(zhuǎn)化，是實現(xiàn)纖維素資源綜合利用的有效途徑之一，國內(nèi)外學(xué)者就如何提高纖維素酶解過程的效率開展了大量的研究[2-3]。近年來，因為離子液體(IL)具有良好的纖維素溶解能力、熔點低、不揮發(fā)、可設(shè)計和可回收等特點，采用ILs預(yù)處理木質(zhì)纖維素生物質(zhì)已經(jīng)受到了廣泛關(guān)注[4-5]。為簡化纖維素酶解糖化的過程，在生物相容性的IL-水介質(zhì)中對纖維素進(jìn)行原位酶解的“一鍋法”更加受到國內(nèi)外研究者的青睞[6]。然而，多數(shù)ILs會不同程度抑制纖維素酶的活性，即便再生纖維素材料中殘留的IL也可能會抑制纖維素酶解效率[7]。為此，許多研究者試圖篩選耐高濃度IL的纖維素酶[8-10]，如Xu等[9]發(fā)現(xiàn)了1株在250 g/L甲基膦酸二甲咪唑([Dmim][(OCH3)2PO2])中能保持61%活性的纖維素酶生產(chǎn)菌草酸青霉,He等[8]利用菌株Galactomycessp.CCZU11-1培養(yǎng)出在200 g/L 1,3-二甲基咪唑磷酸二甲酯([Mmim]DMP)中能保持62.1%糖化率的纖維素酶。即便如此，纖維素酶在ILs中仍然容易失活。目前，有研究表明，部分非離子表面活性劑如聚乙二醇(PEG)和聚氧乙烯脫水山梨酯醇(Tween)對纖維素酶的穩(wěn)定性有一定的提升作用[11-13]，如Yang等[12]發(fā)現(xiàn)，Tween 80在高轉(zhuǎn)速下(180 r/min)對纖維素酶的穩(wěn)定性提高主要是由于減少酶-底物相互作用導(dǎo)致的吸附纖維素酶的失活。此外，王珊等[14]發(fā)現(xiàn)陽離子表面活性劑1-十六烷基吡啶氯鹽對純纖維素酶解有促進(jìn)作用，使最大反應(yīng)速率提高了58.22%。Goshadrou等[15]利用表面活性劑協(xié)同 1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽([EMIM]OAc)預(yù)處理纖維素顯著提高了纖維素酶在反應(yīng)體系中的酶活，使木質(zhì)纖維素的水解率提高至91%。顯然，在IL體系中添加表面活性劑對纖維素酶穩(wěn)定性的提升已經(jīng)是一種可行的策略，但對于相關(guān)機(jī)制還缺乏深入研究。

本課題組前期從土壤中篩選出一株產(chǎn)纖維素酶菌株類芽孢桿菌sp.LLZ1，并初步闡述了所產(chǎn)纖維素酶在[Emim]DEP中的失活規(guī)律[2,16]。本文研究中，筆者擬進(jìn)一步系統(tǒng)地探究在IL([Emim]DEP)中，表面活性劑對纖維素酶活性的影響規(guī)律，分析酶活以及動力學(xué)變化和規(guī)律，利用DLS、熒光光譜以及CD來深入探究表面活性劑與纖維素酶的相互作用，以期揭示酶活變化的具體機(jī)制。同時，在優(yōu)化的條件下，研究以甘蔗渣纖維素為底物的原位酶解進(jìn)程，為生物質(zhì)資源的綜合利用提供理論依據(jù)和應(yīng)用技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

[Emim]DEP(純度99%)，上海成捷化學(xué)有限公司；吐溫80(Tween 80)、 司班20(Span 20)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；聚乙二醇4000(PEG 4000)，上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)，碧云天生物技術(shù)公司；十二烷基二甲基甜菜堿(BS 12)，上海麥克林生化科技有限公司；微晶纖維素(MCC)等其他分析純試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。甘蔗渣購買自江蘇蘇州某集市，經(jīng)過處理獲得甘蔗渣纖維素BC，純度約為90%[17]。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶的制備

類芽孢桿菌sp.LLZ1由本課題組前期研究篩得[16]。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO43、NH4NO30.8、MgSO4·7H20 0.5、CaCl20.5，酵母浸粉1、蛋白胨1、MCC 5。菌種在搖瓶培養(yǎng)條件(30 ℃、200 r/min)下培養(yǎng)5 d。

將培養(yǎng)物在6 000g下離心5 min并使用0.22 μm濾膜過濾。過濾所得上清液作為粗品纖維素酶，4 ℃保存待用。粗酶液測定濾紙酶活為0.60 U/mL。

1.2.2 表面活性劑對纖維素酶活性的影響

取粗酶液，測定在50 g/L[Emim]DEP體系中，不同類型表面活性劑對纖維素酶酶活的影響。分別選擇非離子表面活性劑Tween 80、Span 20、PEG 4000，陽離子表面活性劑CTAB,陰離子表面活性劑SDS和兩性離子表面活性劑BS 12。

濾紙酶活測定條件：溫度40 ℃，pH 6.0(0.1 mol/L醋酸緩沖液)，水浴振蕩頻率為100 r/min，底物為50 mg濾紙，表面活性劑添加濃度為1 g/L。以不加表面活性劑的為樣品對照組，每組平行測定3次。

葡萄糖生成量的測定使用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法進(jìn)行。將反應(yīng)后的混合溶液6 000 r/min離心5 min，取上清液加入DNS試劑，然后沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫，稀釋后在540 nm處測定溶液吸光度。根據(jù)已經(jīng)做好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算反應(yīng)液的產(chǎn)糖量。

1.2.3 表面活性劑對纖維素酶zeta電位的影響

使用粗酶液，加入50 g/L[Emim]DEP，并加入1 g/L的表面活性劑，混合后40 ℃混合反應(yīng)1 h后，測纖維素酶的zeta電位。zeta電位測定光源為氦氖氣體激光(λ=633 nm)，探測角為90°，測樣溫度恒定為25 ℃，每組樣平行測定3次。

1.2.4 表面活性劑對纖維素酶熒光光譜的影響

使用熒光光度計，固定激發(fā)波長280 nm，激發(fā)狹縫15 nm，發(fā)色狹縫15 nm，激發(fā)光譜采用間隔0.2 nm，反射光譜采用間隔1 nm，響應(yīng)時間0.1 s，室溫下掃描300～400 nm，測定表面活性劑對纖維素酶熒光光譜的影響。

測定體系：以粗酶液配制溶液，50 g/L的[Emim]DEP，1 g/L的表面活性劑，40 ℃混合反應(yīng)1 h。

1.2.5 表面活性劑對纖維素酶二級結(jié)構(gòu)的影響

配制好的粗酶液溶液(由于IL在220 nm處有很強(qiáng)的吸收，混合反應(yīng)后將其透析出去進(jìn)行檢測)，利用圓二色光譜儀測定表面活性劑對纖維素酶二級結(jié)構(gòu)的影響。圓二色光譜儀采用波長為190～250 nm的掃描范圍，檢測池大小為10 mm，掃描3次。在室溫下測量，圖譜經(jīng)過儀器本底消除和溶劑空白差減，利用軟件對纖維素酶的二級結(jié)構(gòu)含量進(jìn)行分析。

1.2.6 表面活性劑對酶動力學(xué)的影響

酶促反應(yīng)方程式(米氏方程)，是一個顯示酶促反應(yīng)起始速率(V)和底物濃度(P)關(guān)系的速度方程，具體見式(1)。

V=VmaxP/(Km+P)

(1)

式中:P為底物濃度；V為起始速率；Vmax為最大反應(yīng)速率；Km值為米氏常數(shù)。

測定添加Tween 80、Span 20、PEG 4000和BS 12的酶解反應(yīng)的起始速率，作出Lineweaver-Burk圖，求出酶動力學(xué)特征參數(shù)，得到酶動力學(xué)方程。纖維素酶解反應(yīng)條件：溫度40 ℃，pH 6.0，水浴振蕩頻率150 r/min，底物質(zhì)量濃度10～70 g/L。以不加表面活性劑為樣品對照組，每組平行測定3次，計時取樣，測定反應(yīng)速度的變化。

1.2.7 原位酶解甘蔗渣纖維素

使用[Emim]DEP對甘蔗渣纖維素進(jìn)行預(yù)處理，在80 ℃下反應(yīng)1 h后加入pH為6.0的醋酸緩沖液，使[Emim]DEP和纖維素降溫并加入粗酶液和表面活性劑Tween 80，最后反應(yīng)體系中纖維素質(zhì)量濃度為1 g/L，[Emim]DEP質(zhì)量濃度為50 g/L，表面活性質(zhì)量濃度為1 g/L。在40 ℃水浴搖床中反應(yīng)并計時取樣測定。以不加[Emim]DEP進(jìn)行預(yù)處理和不加表面活性劑Tween 80的為對照組，具體計算見式(2)。

轉(zhuǎn)化率=(0.9×m(葡萄糖)×100%)/m(纖維素)

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 表面活性劑對在[Emim]DEP體系中纖維素酶活性的影響

由于纖維素的難溶性，ILs作為一類性能優(yōu)越的溶劑經(jīng)常在纖維素酶的預(yù)處理中被選用。但是纖維素酶在IL-水介質(zhì)中不穩(wěn)定易失活的問題一直存在。根據(jù)筆者所在課題組Hu等[16]的研究，在50 g/L[Emim]DEP體系中，分別選取6種不同表面活性劑以1 g/L的質(zhì)量濃度加入酶解反應(yīng)體系，探究其對纖維素酶活的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 表面活性劑對[Emim]DEP中纖維素酶穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effects of diverse surfactants on cellulase activities in [Emim]DEP solutions

由圖1可以看出：4種類型的表面活性劑中，陰離子表面活性劑SDS，陽離子表面活性劑CTAB均對纖維素酶的酶活具有抑制作用?？赡苁且驗镾DS和CTAB在水溶液中對纖維素酶產(chǎn)生了較大的靜電斥力而導(dǎo)致了較強(qiáng)的失活[18]。而非離子表面活性劑Tween 80、PEG 4000和Span 20以及兩性離子表面活性劑BS 12均對酶活性有一定程度的提高，酶活性提高的順序(從大到小)為Tween 80(19%)、Span 20(13%)、PEG 4000(12%)、BS 12(5%)。

2.2 表面活性劑對DLS、熒光光譜、CD的影響

2.2.1 表面活性劑對纖維素酶zeta電位的影響

以1 g/L表面活性劑與粗酶液以及50 g/L[Emim]DEP混合反應(yīng)1 h后，測定纖維素酶的zeta電位分布，結(jié)果如圖2所示。

圖2 表面活性劑對[Emim]DEP中 纖維素酶zeta電位的影響Fig.2 Effects of surfactants on zeta potential distributions of cellulase in [Emim]DEP solutions

由圖2可知，非離子表面活性劑對纖維素酶的zeta電位即纖維素酶的三級結(jié)構(gòu)影響較小，而陰、陽離子表面活性劑對纖維素酶的三級結(jié)構(gòu)具有較大的影響。IL-纖維素酶體系的zeta為-9.51 mV，Tween 80-IL-纖維素酶、PEG 4000-IL-纖維素酶、Span 20-IL-纖維素酶、SDS-IL-纖維素酶、CTAB-IL-纖維素酶和BS 12-IL-纖維素酶的zeta電位分別為-9.92、-14.9、-40.4、-19.2、10和-11.8 mV。加入陰離子表面活性劑SDS后，纖維素酶的zeta電位往負(fù)電荷區(qū)域移動幅度較大，這是由于SDS帶有電離度較大的磺酸基團(tuán)，使陰離子表面活性劑吸附到纖維素酶表面，從而導(dǎo)致纖維素酶結(jié)構(gòu)的改變。而陽離子表面活性劑CTAB的加入，使纖維素酶的zeta電位往正電荷方向移動，同樣的也導(dǎo)致了纖維素酶結(jié)構(gòu)的改變。非離子表面活性劑Tween 80、PEG 4000對纖維酶電位的影響均較小(除了Span 20，可能是Span 20為親油性表面活性劑，使纖維素酶的zeta電位測定結(jié)果不穩(wěn)定)，可能是部分表面活性劑在水溶液中不以離子形式存在，通過氫鍵與纖維素酶作用，而這種氫鍵作用對纖維素酶的影響較小[19]。兩性表面活性劑BS 12對纖維素酶的zeta電位影響也較小。

2.2.2 表面活性劑對纖維素酶熒光光譜的影響

質(zhì)量濃度為1 g/L的表面活性劑與粗酶液以及50 g/L[Emim]DEP混合反應(yīng)1 h后，在280 nm波長下測定纖維素酶的熒光光譜，結(jié)果如圖3所示。

圖3 表面活性劑對纖維素酶熒光光譜的影響Fig.3 Effects of surfactants on fluorescence spectrum of cellulase in [Emim]DEP solutions

由圖3可知，在280 nm波長下，得到的主要是蛋白內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸的光譜圖[20]。在不同表面活性劑的影響下，纖維素酶的熒光強(qiáng)度和最大發(fā)射波長均不同。IL-纖維素酶體系中纖維素酶的最大發(fā)射波長在349 nm，而Tween 80-IL-纖維素酶、PEG 4000-IL-纖維素酶、Span 20-IL-纖維素酶、SDS-IL-纖維素酶、CTAB-IL-纖維素酶和BS 12-IL-纖維素酶體系中，纖維素酶最大發(fā)射波長分別為353、350、351、343、334和352 nm。

在纖維素酶體系中加入陰離子表面活性劑SDS和陽離子表面活性劑CTAB，其最大波長發(fā)生了藍(lán)移，說明在SDS和CTAB的影響下，非極性的色氨酸更傾向于分布在纖維素酶的疏水部位，導(dǎo)致纖維素酶的原有結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而抑制了纖維素酶的活性。在SDS和CTAB的作用下，纖維素酶的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，這可能是由于其與纖維素酶之間的靜電引力的存在，導(dǎo)致了纖維素酶分子結(jié)構(gòu)展開，分子內(nèi)部的色氨酸、酪氨酸等發(fā)色基團(tuán)更多地暴露在溶液中。

在纖維素酶中加入非離子表面活性劑Tween 80、PEG4000、Span 20和兩性離子表面活性劑BS 12后，其最大波長均發(fā)生了紅移，說明在幾種表面活性劑的影響下，色氨酸所處的微環(huán)境極性增加，酶的構(gòu)象發(fā)生輕微改變。且這幾種表面活性劑均對纖維素酶酶活有不同程度的促進(jìn)作用。該結(jié)果與Zhang等[21]報道的在經(jīng)酶保護(hù)劑處理后的胰蛋白酶的最大發(fā)射峰大部分發(fā)生紅移結(jié)果類似。

在Tween 80和PEG 4000作用下，纖維素酶的熒光強(qiáng)度基本不發(fā)生改變，可能的原因是這兩種表面活性劑在水溶液中不以離子形式存在，通過氫鍵與纖維素酶作用，而這種氫鍵作用對纖維素酶的影響較小。加入Span 20后，纖維素酶的熒光強(qiáng)度輕微減弱，說明纖維素酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生了輕微的改變。而在加入BS 12后，纖維酶的熒光強(qiáng)度輕微增強(qiáng)，可能是由于在水溶液中兩性離子表面活性劑以離子形式存在，使纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)輕微展開。

2.2.3 表面活性劑對纖維素酶二級結(jié)構(gòu)的影響

用圓二色譜分析添加表面活性劑對纖維素酶二級結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 表面活性劑對纖維素酶圓二色譜的影響Fig.4 Effects of surfactants on circular dichroism of cellulase in [Emim]DEP solutions

由圖4可以看出，α-螺旋和β-折疊的2個標(biāo)志條帶在208和225 nm處[22]。使用非離子表面活性劑Tween 80、PEG 4000和Span 20的纖維素酶的CD條帶略微有所加強(qiáng)。而CTAB的添加使得纖維素酶的CD條帶明顯增強(qiáng)。SDS和BS 12的添加則使纖維素酶的CD條帶強(qiáng)度明顯減弱。

根據(jù)圖4對纖維素酶二級結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步計算結(jié)果見表1。由表1可以看出，經(jīng)Tween 80、Span 20和PEG 4000處理后，纖維素酶的α-螺旋分別增加了0.58%、1.99%和1.05%。而添加SDS則使纖維素酶的α-螺旋減少了4.02%，β-折疊增加了4.8%，表明纖維素酶二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大改變，因而酶活受到了抑制。與之相反的是，添加陽離子表面活性劑CTAB，α-螺旋增加了3.39%，β-折疊減少了1.64%，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，因此在酶活檢測中可以看到CTAB使酶活受到抑制。加入兩性離子表面活性劑BS-12使纖維素酶的α-螺旋減少1.27%，而β-折疊增加了5.59%，然而BS 12對纖維素酶活有著少量的促進(jìn)作用，可能的原因是纖維素酶的酶活主要與α-螺旋的改變有關(guān)，與β-折疊的含量關(guān)聯(lián)很小。

表1 表面活性劑對纖維素酶二級結(jié)構(gòu)的影響

2.3 表面活性劑對纖維素酶動力學(xué)的影響

由于Tween 80、PEG 4000、Span 20和BS 12能在[Emim]DEP體系中提高纖維素酶的穩(wěn)定性，所以選取這3種表面活性劑測定對纖維素酶動力學(xué)的影響，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，結(jié)果如圖5所示。由圖5計算得到米氏方程特征參數(shù)，結(jié)果見表2。

圖5 表面活性劑對酶促反應(yīng)動力學(xué)的影響Fig.5 Effects of surfactants on enzyme kinetics

由圖5和表2可知：4種表面活性劑對酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速率(Vmax)略有提升；在對Km的影響方面，不同表面活性劑的影響程度順序(從小到大)：Tween 80 (17.42)、PEG 4000(18.46)、Span 20(19.07)、BS 12 (19.83)、50 g/L[Emim]DEP(22.00)。表面活性劑對酶促反應(yīng)的影響主要體現(xiàn)在Km的改變上。根據(jù)Hu等[2]的研究，纖維素酶在低濃度的IL中表現(xiàn)為可逆抑制，Vmax略有下降而Km上升，表現(xiàn)出了底物親和度的減弱。不同種類表面活性劑的添加，使纖維素酶的Km有不同程度的減少，即纖維素酶與底物的親和力增加?？赡艿脑蚴窍啾扔贗L而言，表面活性劑更容易與纖維素酶進(jìn)行結(jié)合從而減少IL對纖維素酶結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的不利影響，因此提高纖維素酶在IL體系中的穩(wěn)定性，減少纖維素酶在IL體系中的失活程度[23]。

表2 表面活性劑對酶動力學(xué)的影響

2.4 原位酶解甘蔗渣纖維素BC的時間進(jìn)程

使用50 g/L[Emim]DEP協(xié)同1 g/L Tween 80原位酶解甘蔗渣纖維素BC，考察表面活性劑對纖維素轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 表面活性劑對甘蔗渣纖維素BC原位糖化的影響Fig.6 Effects of surfactants on in situ glycation of BC

由圖6可知：在最初的12 h內(nèi)，50 g/L [Emim]DEP預(yù)處理甘蔗渣纖維素后加入Tween 80進(jìn)行原位酶解，生成的葡萄糖量為0.30 g/L，約為未處理組的2.3倍(0.13 g/L)。108 h后轉(zhuǎn)化基本完成，50 g/L[Emim]DEP預(yù)處理組和預(yù)處理后加入Tween 80 組的轉(zhuǎn)化率分別為73.8%和83%，未處理組為52%。結(jié)果表明：[Emim]DEP預(yù)處理對甘蔗渣纖維素水解糖化有效增強(qiáng)，同時添加Tween 80的轉(zhuǎn)化率相對于預(yù)處理組提高了9.2%。

3 結(jié)論

非離子表面活性劑Tween 80、Span 20、PEG 4000和兩性表面活性劑BS 12對纖維素酶在[Emim]DEP體系中的穩(wěn)定性均具有提升作用，Tween 80將纖維素酶相對活性提高了19%。DLS、熒光光譜和CD分析結(jié)果表明，陰離子表面活性劑SDS和陽離子表面活性劑CTAB分別以不同形式使纖維素酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使纖維素酶失活。

而非離子表面活性劑對纖維素酶的結(jié)構(gòu)影響較小，僅表現(xiàn)為α-螺旋和β-折疊上的輕微改變 。纖維素酶動力學(xué)表明，Tween 80、Span 20、PEG 4000和BS 12不同程度減小了纖維素酶與底物的Km，提高了與底物MCC的親和度。將Tween 80添加到IL-纖維素酶原位酶解體系中，甘蔗渣纖維素BC的轉(zhuǎn)化率提高了9.2%，一定程度上提高了原料的利用率，可為纖維素酶解工藝提供技術(shù)參考。