陳宇瑛 薛雨 艾林 曾其煬

(1 抗生素研究與再評(píng)價(jià)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川抗菌素工業(yè)研究所，成都大學(xué)，成都 610052；2 四川抗菌素工業(yè)研究所金華分所，金華 321000；3 浙江海森藥業(yè)股份有限公司，金華 322104)

當(dāng)前，心腦血管疾病已成為危害人類健康的頭號(hào)大敵，其病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)，而脂肪代謝素亂、高脂血癥以及高血壓等正是AS形成和病變過程的決定性因素。具有強(qiáng)效調(diào)脂作用的他汀類藥物在心腦血管疾病的預(yù)防及治療中發(fā)揮著舉足輕重的作用。

20世紀(jì)90年代以來(lái)，由于一氧化氮(NO)在醫(yī)學(xué)方面所顯示的巨大潛力而逐漸成為醫(yī)藥研究和生命科學(xué)的熱點(diǎn)和前沿之一，為新藥的發(fā)現(xiàn)開辟了一條新途徑。

NO作為信使物質(zhì)和效應(yīng)分子，在心血管、神經(jīng)及免疫等系統(tǒng)中發(fā)揮著極其重要的作用，如舒張血管平滑肌、抑制血小板黏附和聚集、抑制血管平滑肌的增生和遷移、抗炎、抗氧化等作用。21世紀(jì)以來(lái)，有關(guān)NO的研究可謂方興未艾，其發(fā)展趨勢(shì)也從單純的基礎(chǔ)研究逐漸向應(yīng)用方面轉(zhuǎn)化。從最早研究的有機(jī)硝酸酯類NO供體以來(lái)，迄今為止有數(shù)十類NO供體被研發(fā)出來(lái)，并廣泛用于各種生物學(xué)研究，按其結(jié)構(gòu)分類主要有以下幾類：有機(jī)硝酸酯類、亞硝基硫醇類、呋咱氮氧類、偶氮鎓二醇鹽類、N-芳基-N'-羥基胍類、亞硝胺類、金屬卟啉配合物類、無(wú)機(jī)亞硝酸鹽類、FK409衍生物類等[1-2]

心腦血管疾病諸如AS、心肌梗塞等常因內(nèi)皮功能的損傷，使得體內(nèi)NO的釋放量降低。采用偶聯(lián)得到NO供體型他汀類藥物有望通過引入外源性NO來(lái)彌補(bǔ)內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO的不足，從而在發(fā)揮他汀類藥物降血脂作用的同時(shí)，能夠發(fā)揮協(xié)同作用，增強(qiáng)藥理活性，起到前藥性質(zhì)的作用。

本研究選擇的FK409類NO供體，目前在國(guó)內(nèi)未見相關(guān)研究報(bào)道。該類供體是在20世紀(jì)90年代前后，由日本大阪藤澤藥業(yè)株式會(huì)社(Fujisawa harmaceutical Co Ltd.Osaka Factory in Japan)研究開發(fā)[3]。

FK409化學(xué)名為(E)-4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-己酰胺，結(jié)構(gòu)如圖1。文獻(xiàn)報(bào)道顯示[1-4]，F(xiàn)K409代謝分解的同時(shí)，通過釋放NO，在體外表現(xiàn)出良好的舒張血管、抗血小板聚集作用。FK409類似物結(jié)構(gòu)通式如圖2，其中X可為O、N、S，R1、R2和R3為取代基團(tuán)，F(xiàn)K409類似物結(jié)構(gòu)中需含有硝基、烯鍵、肟基3個(gè)參與活性物質(zhì)釋放的官能團(tuán)，通過增長(zhǎng)主鏈長(zhǎng)度、改變?nèi)〈愋投玫降囊幌盗蠪K409衍生物。

FK409類似物釋放NO的限速步驟[1,7]是硝基α位質(zhì)子被奪去，這主要取決于兩個(gè)因素：一是α-H酸性的大?。欢琴|(zhì)子旁空間位阻的大小。如具有給電子效應(yīng)的基團(tuán)如烷氧基或烴基，作為的取代R1、R2，會(huì)使硝基α-H酸性減小，可降低NO的釋放速率；用大位阻基團(tuán)如異丙基、叔丁基取代R1、R2，或者R1和R2連接成環(huán)狀，增加α-H空間位阻，從而使其不易被奪走，也可達(dá)到緩慢釋放NO的目的；以上兩方面的結(jié)構(gòu)修飾都可增長(zhǎng)FK409類似物在體內(nèi)的半衰期，從而有望延長(zhǎng)該潛在藥物的作用時(shí)間。

圖1 FK409的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of FK409

圖2 FK409類似物結(jié)構(gòu)通式Fig.2 The structure of FK409 analogues

R3取代基選擇電負(fù)性較強(qiáng)的或空間位阻較大的基團(tuán)來(lái)修飾，也一定程度對(duì)該類供體化合物釋放NO的速率具有影響，但相比R1和R2的取代對(duì)其釋放NO的影響要弱的多。R3位結(jié)構(gòu)修飾的價(jià)值在于選擇一些具有藥理活性的化合物來(lái)取代，在保證原有藥物藥效的基礎(chǔ)上，通過FK409類似物釋放NO來(lái)增強(qiáng)或輔助原有藥物的藥理活性。

他汀類藥物即羥甲基戊二酰單酰輔酶A(HMGCoA)還原酶抑制劑類藥物，能夠強(qiáng)效抑制HMGCoA還原酶的活性，降低總膽固醇和低密度脂蛋白的含量，具有調(diào)脂作用強(qiáng)、安全性高、毒副作用小的特點(diǎn)，是目前臨床應(yīng)用最廣泛、療效最好的調(diào)脂類藥物。

通過成酯或酰胺的形式將FK409類NO供體的R3端與他汀類藥物進(jìn)行拼接，可以得到一類具有前藥性質(zhì)的化合物，通過體內(nèi)酶的作用，分別代謝水解成各自成分，有望在發(fā)揮他汀類藥物調(diào)脂及非調(diào)脂藥理作用的基礎(chǔ)上，利用FK409類NO供體釋放一定量的NO來(lái)增強(qiáng)他汀類藥物的藥理活性，諸如舒張血管、抗炎、抗氧化等作用。

1 設(shè)計(jì)與合成

1.1 FK409類NO供體型他汀衍生物的設(shè)計(jì)

在上述討論的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了以下3種FK409類NO供體衍生物M、P和M'，如圖3所示，R3基團(tuán)選擇4-氯丁酰氯作為他汀與供體的連接鏈，當(dāng)X為O時(shí)，R1為甲基、R2為乙基定義為M供體；R1為正丙基、R2為乙基定義為P供體；當(dāng)X為N時(shí)，R1為甲基、R2為乙基定義為M'供體。通過R1基團(tuán)大小的不同以及X電負(fù)性的差異，來(lái)控制硝基α-H的酸性，從而考查R1基團(tuán)大小與NO釋放活性的關(guān)系。

本文選用阿托伐他汀(Ato)、匹伐他汀(Pita)及瑞舒伐他汀(Rosu)3種他汀藥物，通過與供體M、P偶聯(lián)設(shè)計(jì)以下6個(gè)目標(biāo)物。其中，目標(biāo)物M-Ato、M-Pita和M-Rosu是M供體分別與上述3種他汀藥物通過中間連接鏈4-氯丁酰氯偶聯(lián)得到的FK409類NO供體型他汀衍生物，目標(biāo)物P-Ato、P-Pita和P-Rosu是P供體分別與上述3種他汀藥物通過中間連接鏈4-氯丁酰氯偶聯(lián)得到的FK409類NO供體型他汀衍生物，各目標(biāo)物結(jié)構(gòu)如圖4所示。

1.2 FK409類NO供體型他汀衍生物的合成設(shè)計(jì)

當(dāng)X為O時(shí)，即M和P兩種NO供體型他汀目標(biāo)化合物的合成方法如圖5所示。

圖3 設(shè)計(jì)的FK409類3種NO供體衍生物Fig.3 Design three types of FK409 NO donor derivatives

圖4 設(shè)計(jì)的FK409類NO供體型他汀目標(biāo)化合物Fig.4 Design FK409 NO donor target compounds for statins

以購(gòu)買得到的兩類烯醛即(E)-2-乙基-2-丁烯醛和(E)-2-乙基-2-己烯醛為原料，按文獻(xiàn)報(bào)道方法[1,3,4,8]，在氫化鈉強(qiáng)堿作用下，將烯醛與磷酰基乙酸三乙酯通過Wittig-Horner烯化反應(yīng)合成得到烯化產(chǎn)物1；再以乙醚為溶劑，氫化鋰鋁為還原劑，還原反應(yīng)得中間體2。

中間體2在堿性條件下與中間連接鏈4-氯丁酰氯發(fā)生取代反應(yīng)得氯代物3；然后他汀類化合物以鹽的形式與氯代物3在碘化鉀催化作用下生成化合物4；最后，通過硝化-亞硝化[8-9]反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物5。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

Agilent 1100LC/MSD質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)；INOVA400高分辨超導(dǎo)核磁共振儀(Unity)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Rotavapor, R-114)；WRS-1A數(shù)字熔點(diǎn)儀(上海物理光學(xué)儀器廠)；81-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)。所用原料中間體購(gòu)自Astatech及TCI試劑公司；所用試劑購(gòu)自成都科龍化工試劑廠，均為分析純或化學(xué)純；反應(yīng)溶劑四氫呋喃和乙醚均作無(wú)水處理。

2.2 FK409類NO供體的制備

2.2.1 (E,E)-4-乙基-2,4-二烯-己酸乙酯(M1)的合成[3]

冰浴、氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向150mL的無(wú)水THF溶液中加入60%的NaH(4.80g, 120mmol)，攪拌均勻，再向里逐滴加入磷?；宜崛阴?20.16g, 90mmol)、(E)-2-乙基-2-烯-丁醛(5.00g, 51.00mmol)、20mL無(wú)水THF的混合溶液，攪拌15min后，撤出冰浴，室溫條件下攪拌4.5h。反應(yīng)液傾入冰水中，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/正己烷=1/30)得5.00g無(wú)色具有酯香味油狀物(理論量為8.58g，收率為58.30%)。

2.2.2 (E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-己醇(M2)的合成[3]

圖5 M和P類NO供體型他汀衍生物合成路線Fig.5 The synthesis route of M and P-type NO donor for statin derivatives

室溫、避光條件下，向加入氫化鋰鋁(0.74g, 19.52mmol)的無(wú)水乙醚混懸液中，逐滴加入(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-己酸乙酯(5.00g, 29.76mmol)的乙醚溶液，攪拌2h后，TLC顯示仍有原料存在，故又補(bǔ)加了約0.40g氫化鋰鋁，攪拌3h后處理。用乙酸乙酯淬滅反應(yīng)，過濾，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮得粗品，采用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/4)得2.71g無(wú)色透明油狀物。

2.2.3 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-氯-丁酸己酯(M3)的合成[3]

冰浴中，向(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-己醇(2.87g, 22.78mol)、三乙胺100mL、二氯甲烷150mL的混合液中，滴加4-氯-丁酰氯(6.80g, 48.20mmol)，冰浴攪拌4h，反應(yīng)液用二氯甲烷萃取，二氯甲烷層用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/30)，得4.30g無(wú)色透明油狀物。ESIMS(m/z)：231.7[M+H]+, C12H19ClO2(MW=230.1)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：6.18(1H,J=15.6Hz, d)；5.68～5.52(2H, m)；4.62(2H,J=6.8Hz, d)；3.60(2H,J=5.1Hz, t)；2.51(2H,J=5.8Hz, t)；2.23(2H,J=6.5Hz, q)；2.13～2.06(2H, m)；1.72(3H,J=14.8Hz, d)；0.99(3H,J=4.2Hz, t)。

2.2.4 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-氯-丁酸己酯(M)的合成[1,3-6]

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1]-4-氯-丁酸己酯(0.41g, 1.80mmol)、NaNO2(0.74g, 10.70mmol)、甲醇15mL、水10mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(1.22mL, 7mmol)，室溫?cái)嚢?0min，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/4)，得0.16g黃色油狀物。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm): 6.00(1H, s)；5.17(1H,J=6.8Hz, q)；4.77(2H, s)；3.61(2H,J=9.2Hz, t)；2.54(2H,J=11.2Hz, t)；2.23～2.08(4H, m)；1.73(3H,J=16Hz, d)；1.07(3H,J=8.7Hz, t)。

2.2.5 (E,E)-4-乙基-2,4-二烯-辛酸乙酯的(P1)合成[3]

氮?dú)獗Ｗo(hù)、冰浴條件下，向30mL的無(wú)水THF溶液中加入60%的NaH(1.20g, 30mmol)，攪拌均勻，再向里逐滴加入磷?；宜崛阴?4.48g, 20mmol)、(E)-2-乙基-2-烯-己醛(1.50g, 11.90mmol)、10mL無(wú)水THF的混合溶液，攪拌15min后，撤出冰浴，室溫條件下攪拌5h。反應(yīng)液傾入冰水中，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/30)得0.29g無(wú)色具有酯香味油狀物。ESIMS(m/z)：197.1[M+H]+, C12H20O2(MW=196.1)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.17(1H,J=16Hz, d)；5.96(1H,J=7.4Hz, t)；5.84(1H,J=16Hz, d)；4.13(2H,J=8.2Hz, q)；2.25(2H,J=9.6Hz, q)；2.16(2H,J=11.2Hz, q)；1.48～1.38(2H, m)；1.25～1.18(3H, m)；0.98～0.85(6H, m)。

2.2.6 (E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-辛醇(P2)的合成[3]

室溫條件下，向加入氫化鋰鋁(1 8.5 4 m g, 0.49mmol)的無(wú)水乙醚混懸液中，逐滴加入(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-辛酸乙酯(0.12g, 0.61mmol)，攪拌2h。用乙酸乙酯淬滅反應(yīng)，過濾，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮得粗品，硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/4)得0.07g無(wú)色透明油狀物。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：6.05(1H,J=15.6Hz, d)；5.69～5.63(1H, m)；5.36(1H,J=16Hz, t)；4.67(1H,J=16.2Hz, t)；3.99(2H,J=14.6Hz, t)；2.20～2.03(4H, m)；1.40～1.31(2H, m)；0.98～0.81(6H, m)。

2.2.7 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-氯-丁酸辛酯(P3)的合成[1,3]

冰浴、氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-辛醇(0.14g, 0.88mmol)、碳酸氫鈉(0.13g, 1.54mmol)、二氯甲烷10mL、水2mL的混合液中，滴加4-氯-丁酰氯(0.18g, 1.30mmol)，攪拌過夜后，pH檢測(cè)反應(yīng)液呈較強(qiáng)酸性，用碳酸氫鈉調(diào)反應(yīng)液至中性。反應(yīng)液用二氯甲烷萃取，二氯甲烷層用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/30的洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析，得到0.13g無(wú)色透明油狀物(理論量為0.23g，收率為55.6%)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：5.93(1H,J=15.6Hz, d)；5.72～5.64(1H, m)；5.26(1H,J=7.4Hz, t)；4.11(2H,J=7.0Hz, t)；3.60(2H,J=3.0Hz, t)；2.54～2.20(6H, m)；2.15～2.05(4H, m)；1.06～0.99(6H, m)。

2.2.8 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-氯-丁酸辛酯(P)的合成[1,3]

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1]-4-氯-丁酸辛酯(0.77g, 3.00mmol)、NaNO2(1.33g, 19.20mmol)、甲醇30mL、水20mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(2mL, 11.52mmol)，室溫?cái)嚢?0min，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥、濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/4)，得0.12g黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：357.1[M+Na]+, 373.0[M+K]+, C14H23ClN2O5(MW=334.1)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：6.03(1H, s)；5.01(1H,J=4.4Hz, t)；4.76(2H, s)；3.60(2H,J=6.2Hz, t)；2.53(2H,J=7.0Hz, t)；2.25～2.04(1H, m)；2.22～2.02(4H, m)；1.96～1.82(1H, m)；1.42～1.24(2H, m)；1.06(3H,J=5.7Hz, t)；0.98(3H,J=6.4Hz, t)。

2.3 FK409類NO供體型他汀衍生物的合成

2.3.1 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R)-7-[2-(4-氟苯基)-5-異丙基-3-苯基-4-(苯胺羰基)吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酯基}-丁酸己酯(M3-Ato)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1]-4-氯-丁酸己酯(0.21g, 0.91mmol)、阿托伐他汀鈣(1.16g, 1.00mmol)、25mL的DMF混合，加入適量催化劑KI，室溫?cái)嚢?0h，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/1)，得64.40mg油狀物。ESI-MS(m/z)：753.3[M+H]+, C45H53FN2O7(MW=752.4)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.20～7.14(9H, m)；7.06(2H,J=8.0Hz, d)；7.02～6.96(3H, m)；6.87(1H, s)；6.18(1H,J=16.0Hz, d)；5.67～5.53(2H, m)；4.62(2H,J=16.0Hz, d)；4.15～4.04(4H, m)；4.00～3.91(1H, m)；3.78～3.68(1H, m)；3.69～3.62(1H, m)；3.61～3.55(1H, m)；2.48～2.36(2H, m)；2.41(2H,J=7.2Hz, t)；2.23(2H,J=7.6Hz, q)；2.05～1.95(2H, m)；1.75～1.60(2H, m)；1.72(3H,J=6.8Hz, d)；1.59-1.42(2H, m)；1.53(6H,J=7.2Hz, d)；0.99(3H,J=7.4Hz, t)。

2.3.2 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟代苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸己酯(M3-Pita)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1]-4-氯-丁酸己酯(0.58g, 2.50mmol)、匹伐他汀鈣(2.00g, 2.27mmol)、25mL的DMF混合，加入適量催化劑KI，室溫?cái)嚢?0h，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/1)，得0.50g油狀物。ESI-MS(m/z)：616.2[M+H]+, C37H42FNO6(MW=615.3)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.95(1H,J=8.0Hz, d)；7.60～7.56 (1H, m)；7.35～7.28(2H, m)；7.24～7.13(4H, m)；6.63(1H,J=16.4Hz, d)；6.19(1H,J=15.6Hz, d)；5.68～5.53 (3H, m)；4.63(2H,J=6.4Hz, d)；4.45～4.35(1H, m)；4.19～4.06(1H, m)；4.17(2H,J=6.4Hz, t)；2.49～2.37(2H, m)；2.42(2H,J=3.2Hz, t)；2.24(2H,J=7.6Hz, q)；2.04～1.97 (2H, m)；1.72(3H,J=6.8Hz, d)；1.58～1.29 (2H, m)；1.39～1.26 (1H, m)；1.05～0.95 (4H，m)；0.99 (3H,J=7.6Hz, t)。

2.3.3 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基-N-甲磺酰胺基)-5-嘧啶]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸己酯(M3-Rosu)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1]-4-氯-丁酸己酯(1.15g, 4.90mmol)、瑞舒伐他汀鈉(5.00g, 9.93mmol)、25mL的DMF混合，加入適量催化劑KI，室溫?cái)嚢?0h，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/1)，得0.56g油狀物。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.66～7.62(2H, m)；7.09(2H,J=8.6Hz, t)；6.63(1H,J=16Hz, d)；6.19(1H,J=15.6Hz, d)；5.66～5.42(3H, m)；4.62(2H,J=6.8Hz, d)；4.46(1H, s)；4.19～4.15(3H, m)；3.75(1H, s)；3.62(1H, s)；3.57(3H, s)；3.52(3H, s)；3.38～3.34(1H, m)；2.47～2.40(2H, m)；2.42(2H,J=4.8Hz, t)；2.23(2H,J=7.6Hz, q)；2.03～1.97(2H, m)；1.72(3H,J=6.8Hz, d)；1.57～1.42(2H, m)；1.26(6H,J=6.8Hz, d)；0.99(3H,J=7.6Hz, t)。

2.3.4 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R)-7-[2-(4-氟苯基)-5-異丙基-3-苯基-4-(苯胺羰基)吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酯基}-丁酸辛酯(P3-Ato)的合成

合成方法參照“2.3.1”項(xiàng)。

2.3.5 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟代苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸辛酯(P3-Pita)的合成

合成方法參照“2.3.2”項(xiàng)。

2.3.6 [(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基-N-甲磺酰胺基)-5-嘧啶]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸辛酯(P3-Rosu)的合成

合成方法參照“2.3.3”項(xiàng)。

2.3.7 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-{(3R, 5R)-7-[2-(4-氟苯基)-5-異丙基-3-苯基-4-(苯胺羰基)吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酯基}-丁酸己酯(M-Ato)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R,5R)-7-[2-(4-氟苯基)-5-異丙基-3-苯基-4-(苯胺羰基)吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酯基}-丁酸己酯(0.66g, 0.88mmol)、NaNO2(0.36g, 5.28mmol)、甲醇15mL、水10mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(1.13mL, 6.50mmol)，室溫?cái)嚢?0min，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/1)，得104.20mg淺黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：829.9[M+H]+, C45H53FN4O10(MW=828.4)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.27～7.12(9H, m)；7.06(2H,J=8Hz, d)；7.02～6.96(3H, m)；6.87(1H, s)；6.02(1H, s)；5.15(1H,J=6.8Hz, q)；4.75(2H,J=5.2Hz, t)；4.22～4.06(4H, m)；3.98～3.92(1H, m)；3.80～3.65(2H, m)；3.56(2H,J=7.2Hz, t)；2.48～2.36(4H, m)；2.22～2.18(2H, m)；1.98～1.94(2H, m)；1.75～1.60(2H, m)；1.72(3H,J=6.8Hz, d)；1.59～1.42(2H, m)；1.53(6H,J=7.2Hz, d)；1.06(3H,J=7.6Hz, t)。

2.3.8 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟代苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸己酯(M-Pita)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R,5R,6E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟代苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸己酯(0.52g, 0.85mmol)、NaNO2(0.35g, 5.10mmol)、甲醇24mL、水9mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(0.68mL, 4.08mmol)，室溫?cái)嚢?0min，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗后，干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/1)，得62.10mg淺黃色油狀物。ESIMS(m/z)：692.2[M+H]+, C37H42FN3O9(MW=691.3)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.96(1H,J=7.6Hz, d)；7.59(1H,J=7.0Hz, t)；7.36～7.28(2H, m)；7.21～7.13(4H, m)；6.63(1H,J=16.0Hz, d)；6.03(1H, s)；5.57(1H,J=16.0Hz, 6.4Hz, dd)；5.16(1H,J=6.8Hz, q)；4.76(2H,J=5.2Hz, t)；4.40(1H, s)；4.24～4.09(4H, m)；3.82(1H, s)；3.32(1H, s)；2.50～2.24(2H, m)；2.44(2H,J=8.6Hz, t)；2.20(2H,J=1.2Hz, q)；2.05～1.98(2H, m)；1.72(3H,J=6.8Hz, d)；1.64～1.42(2H, m)；1.35～1.24(1H, m)；1.08～0.95(4H, m), 1.07(3H,J=7.2Hz, t)。

2.3.9 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基-N-甲磺酰胺基)-5-嘧啶]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸己酯(M-Rosu)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基-N-甲磺酰胺基)-5-嘧啶]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸己酯(0.40g, 0.60mmol)、NaNO2(0.50g, 7.20mmol)、甲醇24mL、水9mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(0.96mL, 5.76mmol)，室溫?cái)嚢?0min，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/1)，得84.30mg淺黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：752.8[M+H]+, C34H46FN5O11S (MW=751.3)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.63(2H,J=8.0Hz, t)；7.08(2H,J=8.6Hz, t)；6.62(1H,J=15.6Hz, d)；6.00(1H, s)；5.44(1H,J=17.3Hz, 9.2Hz, dd)；5.17～4.94(3H, m)；4.46(1H, s)；4.19(1H, s)；4.17(2H,J=9.2Hz, t)；3.56(3H, s)；3.51(3H, s)；3.39～3.32(1H, m)；2.54～2.20(6H, m)；2.15～1.95(2H, m)；1.73(3H,J=7.2Hz, d)；1.61～1.44(2H, m)；1.25(6H,J=6.4Hz, d)；1.14～1.02(3H, m)。

2.3.10 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-{(3R, 5R) -7-[2-(4-氟苯基)-5-異丙基-3-苯基-4-(苯胺羰基)吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酯基}-丁酸辛酯(P-Ato)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R, 5R)-7-[2-(4-氟苯基)-5-異丙基-3-苯基-4-(苯胺羰基)吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酯基}-丁酸辛酯(1.60g, 2.05mmol)、NaNO2(0.85g, 12.30mmol)、甲醇30mL、水20mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(1.67mL, 10mmol)，室溫?cái)嚢?0min，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/1)，得0.24g淺黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：857.9[M+H]+, C47H57FN4O10(MW=856.4)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.20～7.12(9H, m)；7.06(2H,J=8.0Hz, d)；7.02～6.97(3H, m)；6.87(1H, s)；6.05(1H, s)；5.00(1H,J=6.0Hz, q)；4.74(2H, s)；4.22～4.06(4H, m)；3.98～3.90(1H, m)；3.79～3.66(2H, m)；3.57～3.53(2H, m)；2.46～2.38(2H, m)；2.43(2H,J=8.8Hz, t)；2.29～2.16(3H, m)；1.98～1.90(2H, m)；1.92～1.82(1H, m)；1.73～1.62(2H, m)；1.59～1.42(2H, m)；1.53(6H,J=7.2Hz, d)；1.38(2H, m)；1.05(3H,J=7.6Hz, t)；0.98(3H,J=7.4Hz, t)。

2.3.11 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-{(3R, 5R, 6E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟代苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸辛酯(P-Pita)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R,5R,6E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟代苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸辛酯(1.40g, 2.18mmol)、NaNO2(0.90g, 13.06mmol)、甲醇30mL、水20mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(1.67mL, 10mmol)，室溫?cái)嚢?0min，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/1)，得0.34g淺黃色油狀物。ESIMS(m/z)：720.8[M+H]+, C39H46FN3O9(MW=719.3)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.96(1H,J=8.4Hz, d)；7.59(1H, s)；7.36～7.28(2H, m)；7.21～7.13(4H, m)；6.63(1H,J=12Hz, d)；6.06(1H, s)；5.57(1H,J=15.8Hz, 6.2Hz, dd)；5.00(1H,J=8.8Hz, q)；4.75(2H, s)；4.40(1H, s)；4.24～4.09(4H, m)；3.82(1H, s)；3.32(1H, s)；2.53～2.24(4H, m)；2.30～2.12(3H, m)；2.04～1.94(2H, m)；1.96～1.82(1H, m)；1.64～1.42(2H, m)；1.42～1.24(3H, m)；1.08～0.95(4H, m)；1.07～0.85(6H, m)。

2.3.12 (4-乙基-2-肟基-5-硝基-3-烯-1-基)-4-{(3R, 5R,6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基-N-甲磺酰胺基)-5-嘧啶]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸辛酯(P-Rosu)的合成

將[(E,E)-4-乙基-2,4-二烯-1-基]-4-{(3R,5R,6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基-N-甲磺酰胺基)-5-嘧啶]-3,5-二羥基-6-庚烯酯基}-丁酸辛酯(0.60g, 0.85mmol)、NaNO2(0.35g, 5.11mmol)、甲醇15mL、水10mL混合，向上述混合液中緩慢滴加6mol/L HCl(0.84ml, 5.00mmol)，室溫?cái)嚢?0min，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，濃縮液用硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/環(huán)己烷=1/1)，得38.60mg淺黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：780.8[M+H]+, C36H50FN5O11S (MW=779.3)。1H NMR(400MHz, CDCl3, 25℃)δ(ppm)：7.65(2H,J=8.4Hz, t)；7.09(2H,J=8.6Hz, t)；6.64(1H,J=16Hz, d)；6.03(1H, s)；5.45(1H,J=7.8Hz, d)；5.01～4.89(1H, m)；4.46(1H, s)；4.40～4.08(3H, m)；3.77～3.58(2H, m)；3.57(3H, s)；3.52(3H, s)；3.40～3.34(1H, m)；2.52～2.39(2H, m)；2.46(2H,J=13.2Hz, t)；2.43～2.41(2H, m)；2.40～2.16(2H, m)；2.05～1.98(1H, m)；1.82～1.74(1H, m)；1.61～1.44(2H, m)；1.39～1.30(2H, m)；1.26(6H,J=6.4Hz, d)；1.15～0.92(6H, m)。

3 NO釋放活性測(cè)定

目標(biāo)化合物通過亞硝酸鹽-硝酸鹽法進(jìn)行體外NO釋放活性測(cè)定。有機(jī)硝酸酯類NO供體需在含巰基化合物如L-半胱氨酸或谷胱甘肽等的參與下才能釋放NO，因其釋放NO的機(jī)制是在助釋劑的作用下通過巰基對(duì)硝酸酯基團(tuán)的N原子進(jìn)行親核進(jìn)攻，從而釋放NO[9]。與有機(jī)硝酸酯類或其他類NO供體不同，根據(jù)以上討論的FK409類供體NO釋放機(jī)制，目標(biāo)化合物的NO釋放無(wú)需在含巰基化合物的參與下進(jìn)行，僅需在弱堿性條件即可。釋放出的NO化學(xué)性質(zhì)活潑，在水溶液或富氧條件下很容易被氧化成亞硝酸鹽，再發(fā)生重氮化、偶合反應(yīng)產(chǎn)生玫瑰紅色的化合物，該偶聯(lián)產(chǎn)物在548nm波長(zhǎng)處具有特定強(qiáng)吸收峰，根據(jù)測(cè)定的紫外吸收數(shù)據(jù)，從而間接計(jì)算出目標(biāo)化合物釋放NO的量。

分別測(cè)試6 個(gè)目標(biāo)化合物，測(cè)試濃度為0.10mmol/L，將測(cè)得紫外吸收數(shù)據(jù)，通過標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程換算成NO濃度見表1。

從表1可以看出FK409類NO供體型他汀衍生物釋放NO具有一定的梯度，在1～5h內(nèi)隨時(shí)間的增長(zhǎng)，釋放NO的總量在增加。選取釋放NO量適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)物M-Rosu作圖(圖6)。

以6個(gè)目標(biāo)化合物在6h內(nèi)釋放NO的總量計(jì)算釋放百分率見表2。從表2可看出化合物M-Pita釋放NO百分率比其他衍生物要高，能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)仍具有NO釋放活性。

另外，通過以上FK409類NO供體型他汀衍生物NO釋放結(jié)果的比較，R3位置的結(jié)構(gòu)修飾對(duì)NO的釋放發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

該類NO供體型他汀衍生物雖然釋放NO百分率有差異，但在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)均具有釋放活性，這種特性對(duì)于延長(zhǎng)潛在藥物在體內(nèi)代謝的半衰期，延長(zhǎng)作用時(shí)間具有重要的研究意義。

NO釋放機(jī)制[1,8,10]：本文合成的6個(gè)目標(biāo)化合物，其NO供體部分在體內(nèi)釋放NO具有明確的機(jī)制，該類供體結(jié)構(gòu)中，因硝基的強(qiáng)吸電子誘導(dǎo)效應(yīng)而使α-H具有一定的酸性，在堿性(RS-, OH-)條件下α-H容易被奪去，生成一對(duì)互變異構(gòu)體，再經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化釋放NO(圖7)。根據(jù)以上機(jī)制，該類供體化合物設(shè)計(jì)主要是增大R1和R2位的空間位阻來(lái)控制α-H的酸性，從而延長(zhǎng)供體在體內(nèi)的半衰期，即延長(zhǎng)作用時(shí)間。FK409類似物的構(gòu)效關(guān)系決定了該類供體釋放NO具有一定可控性。

表1 不同時(shí)間內(nèi)(min)釋放的NO的濃度Tab.1 The concentration of the NO which target chemicals release in different time

圖6 化合物M-Rosu(7)釋放NO總量隨時(shí)間變化圖Fig.6 The figure that the total amount of NO released by the compound M-Rosu (7) change over time

表2 目標(biāo)化合物體外釋放NO百分率Tab.2 The percentage of NO released by the target compound in vitro

4 結(jié)論

本文選擇FK409類NO供體，設(shè)計(jì)其與他汀類降血脂藥物(阿托伐他汀、匹伐他汀和瑞舒伐他汀)進(jìn)行偶聯(lián)的6個(gè)全新的NO供體型他汀類衍生物，并成功合成得到6個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物，部分中間體及目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)經(jīng)ESI-MS、1H NMR確證。體外NO釋放活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明：目標(biāo)化合物具有良好的NO釋放活性，通過結(jié)構(gòu)修飾可使其NO釋放具有一定的可控性，為進(jìn)一步研究新型NO供體型他汀藥物提供參考。

圖7 NO釋放機(jī)制Fig.7 The mechanism of NO release