方雪瑤 胡龍華 杭亞平 胡曉彥 俞鳳 陳艷慧 鐘橋石

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330006)

銅綠假單胞菌是臨床常見(jiàn)條件致病菌之一，常引起免疫低下患者的各種急慢性感染。研究表明，III型分泌系統(tǒng)(type III secretion system, T3SS)在銅綠假單胞菌的感染及致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]，其中效應(yīng)蛋白ExoS和ExoU為主的毒力蛋白表達(dá)可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的凋亡，加重炎癥程度，最終導(dǎo)致感染難以控制[2-3]。本文將重點(diǎn)探討T3SS毒力基因exoS和exoU在銅綠假單胞菌中表達(dá)差異與細(xì)菌耐藥性之間的關(guān)系，以期為臨床選擇合適的抗感染治療方案及預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2017年1月—2017年12月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院患者送檢的72株臨床標(biāo)本，其中痰液標(biāo)本40株，血液標(biāo)本10株，膿液標(biāo)本6株，尿液標(biāo)本4株，傷口分泌物標(biāo)本4株，穿刺液標(biāo)本3株，引流液標(biāo)本3株，膽汁標(biāo)本2株，均嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)的標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)收標(biāo)本，剔除重復(fù)及不合格標(biāo)本。陽(yáng)性質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，購(gòu)自溫州康泰生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn)

采用Vitek2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀(Mérieux公司)進(jìn)行菌株鑒定；藥敏試驗(yàn)根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(The Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)2017版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀藥敏結(jié)果。

1.2.2 提取菌株DNA

煮沸法；接種單菌落于LB平板，37℃培養(yǎng)24h，1.5mL EP管內(nèi)加300μL無(wú)菌雙蒸水，用接種環(huán)取純分離的細(xì)菌半環(huán)到一環(huán)，加入EP管，混勻，100℃煮沸10min，12000r/min離心10min，分離上清即為細(xì)菌總DNA，置于-20℃冰箱備用 。

1.2.3 PCR法檢測(cè)

T3SS特征片段popB基因及毒力基因exoS、exoU。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[4-5]，引物由上海生工生物工程公司合成，DNA聚合酶、DNA marker均于北京天根生化公司訂購(gòu)(引物序列見(jiàn)表1)。PCR 條件設(shè)置：95℃ 10min；95℃ 30s、60℃ 30s和72℃ 30s共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物取2μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后用凝膠成像儀觀察結(jié)果，PCR產(chǎn)物送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序后在Blast中比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以 SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T3SS毒力基因檢測(cè)

檢測(cè)72株臨床分離的銅綠假單胞菌株毒力基因，發(fā)現(xiàn)T3SS標(biāo)志性片段popB的陽(yáng)性株為68株，陽(yáng)性率為94.44%(68/72)；攜帶銅綠假單胞菌分為exoS+/exoU-、exoS-/exoU+、exoS+/exoU+和exoS-/exoU- 4種類(lèi)型組合，檢出率分別為56.94%(41/72)、26.39%(19/72)、4.17%(3/72)和12.50%(9/72)。其中3株細(xì)菌(4.17%)同時(shí)攜帶exoS和exoU毒力基因，9株細(xì)菌(12.50%)exoS和exoU均未檢出exoS、exoU毒力基因(包含4株T3SS陰性的銅綠假單胞菌)。

2.2 exoS和exoU基因的分布特征

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR Primer sequences

分離的72株銅綠假單胞菌標(biāo)本來(lái)源以痰液(占55.56%)、血液(占13.89%)及膿液(占8.33%)標(biāo)本為主(剔除重復(fù)菌株)。各種類(lèi)型標(biāo)本中均以exoS+/exoU-基因組合檢出率最高，在痰液、血液和膿液中檢出率分別為57.50%(23/40)、70.00%(7/10)和66.67%(4/6)，詳見(jiàn)表2。

表2 銅綠假單胞菌popB基因及毒力基因exoS和exoU的分布特征Tab.2 Distribution characteristics of popB, exoS and exoU in Pseudomonas aeruginosa

2.3 exoS和exoU基因與耐藥性

攜帶exoU基因銅綠假單胞菌顯示出對(duì)亞胺培南、氨曲南、氨基糖苷類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物較高耐藥率，其中對(duì)亞胺培南、氨基糖苷類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的耐藥率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；攜帶exoU基因的總菌株為22株，其對(duì)亞胺培南、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、左氧氟沙星及環(huán)丙沙星的耐藥率分別為45.45%、45.45%、50.00%、50.00%、40.91%和40.91%；攜帶exoS基因的總菌株為44株，其對(duì)以上藥物的耐藥率分別為4.55%、6.82%、4.55%、18.18%、11.36%和18.18%；攜帶exoS基因銅綠假單胞菌對(duì)氨曲南較高的耐藥性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，詳見(jiàn)表3。

3 討論

T3SS是銅綠假單胞菌為適應(yīng)外界環(huán)境、保護(hù)自身生存進(jìn)化而形成[6]，其能通過(guò)分泌exoS、exoU、exoT和exoY等效應(yīng)蛋白發(fā)揮毒性作用；其中exoU是一種具有磷脂酶和腺苷酸環(huán)化酶活性的細(xì)胞毒素，可以導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞膜損傷以及快速的壞死，是T3SS危害最大、最具破壞性的效應(yīng)蛋白[7-8]；exoS則具有腺苷二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性，可抑制宿主細(xì)胞吞噬作用、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等作用，其毒力效應(yīng)僅次于exoU[9]。因此以效應(yīng)蛋白exoS和exoU為主的毒力蛋白表達(dá)，可直接影響感染患者的病情進(jìn)展及預(yù)后。本研究通過(guò)檢測(cè)T3SS毒力基因exoS和exoU的表達(dá)情況，分析毒力基因與常用抗菌藥物耐藥性的關(guān)系，以期為感染此類(lèi)細(xì)菌患者的治療及預(yù)后評(píng)估提供可靠依據(jù)。

表3 攜帶毒力基因exoS、exoU銅綠假單胞菌與抗菌藥物耐藥性Tab.3 Correlation between virulence genes exoS, exoU and antibiotic resistance of Pseudomonas aeruginosa

研究表明，幾乎所有從臨床或環(huán)境中分離的銅綠假單胞菌株都能檢測(cè)到T3SS，但不同來(lái)源的標(biāo)本常存在不同基因型組合[5]。本研究分離的72株銅綠假單胞菌中，T3SS分泌系統(tǒng)的攜帶率高達(dá)94.44%，其中exoS+/exoU-、exoS-/exoU+、exoS+/exoU+和exoS-/exoU-這4種基因型檢出率分別為56.94%、26.39%、4.17%和12.50%。由于患者地域、患病類(lèi)型、標(biāo)本來(lái)源等的不同，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的exoS、exoU基因型檢出率存在較大差異[10]。本研究所收集的各類(lèi)型標(biāo)本中均以exoS+/exoU-組合型檢出率最高，顯示銅綠假單胞菌表達(dá)毒力基因無(wú)明顯感染部位差異。國(guó)外研究顯示，exoU毒力基因所發(fā)揮的致死性細(xì)胞毒性可引起組織吞噬細(xì)胞損傷，這不僅使銅綠假單胞菌在病灶中持續(xù)存在，而且還會(huì)促進(jìn)其他條件致病菌的雙重感染，導(dǎo)致患者感染加重和預(yù)后不良[11]。

細(xì)菌毒力基因常與其耐藥性的產(chǎn)生具有一定相關(guān)性，本研究發(fā)現(xiàn)攜帶exoU基因銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南和氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的耐藥率(均＞40%)顯著高于exoS基因(均＜20%)，與Wong-Beringer等[12]的研究結(jié)果一致，但目前對(duì)其耐藥機(jī)制尚不完全清楚；還發(fā)現(xiàn)，攜帶exoU基因銅綠假單胞菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物的耐藥率顯著高于exoS基因，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。值得注意的是，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道攜帶exoU基因銅綠假單胞菌與氨基糖苷類(lèi)耐藥性具有正相關(guān)性，這可能是由于各地區(qū)抗菌藥物的使用習(xí)慣不同致使臨床致病菌所面臨的抗菌藥物選擇壓力不同，導(dǎo)致致病菌耐藥基因發(fā)生相應(yīng)適應(yīng)性的變異，具體耐藥機(jī)制需要進(jìn)一步探討研究。此外，藥敏結(jié)果顯示攜帶exoS和exoU毒力基因銅綠假單胞菌對(duì)頭孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦的耐藥率均較低(＜20%)，表明此類(lèi)藥物可以作為本地區(qū)銅綠假單胞菌感染經(jīng)驗(yàn)治療優(yōu)先考慮藥物。

銅綠假單胞菌對(duì)多種抗生素天然耐藥，易形成生物膜，并且常多種耐藥機(jī)制共存，導(dǎo)致臨床治療無(wú)藥可選。其中氨基糖苷類(lèi)和喹諾酮類(lèi)藥物常用于治療碳青霉烯類(lèi)耐藥的銅綠假單胞菌，然而我們發(fā)現(xiàn)攜帶exoU基因銅綠假單胞菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的耐藥性更高，使得臨床治療面臨更大的挑戰(zhàn)。因此進(jìn)一步對(duì)銅綠假單胞菌T3SS致病性的研究及有關(guān)新穎抑制劑的開(kāi)發(fā)具有重要意義，國(guó)內(nèi)外現(xiàn)階段在其抑制劑的研發(fā)上已取得較大進(jìn)展，但對(duì)其真正作用靶點(diǎn)的確定仍為難題。本研究揭示銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)exoS和exoU毒力基因在抗菌藥物中表達(dá)差異性，將為臨床治療感染此類(lèi)細(xì)菌患者提供可靠依據(jù)。