萬佳慧,王孝錦,姜世君，2,王秀麗，3,崔榮軍

(1.牡丹江醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，黑龍江 牡丹江 157000；2.大慶醫(yī)學高等?？茖W校檢驗教研室，黑龍江 大慶 163312；3.齊齊哈爾市第七醫(yī)院檢驗科，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

菱形體蛋白(rhomboid-like protein，RHBDL)是生物界廣泛存在的一種保守性膜內蛋白質，最早在果蠅中被發(fā)現，并以其基因突變的幼蟲而命名，在果蠅發(fā)育和生長過程中具有重要作用。隨后，在細菌和酵母中也闡明了這種蛋白質的作用。近年來，對于菱形體蛋白的認識主要集中在果蠅和頂復器門原蟲中，為疫苗候選基因的研究提供了理論依據[1]。隨著研究的深入，在哺乳動物中也已確定有多種菱形體蛋白，分布在主要的細胞器中，分別具有不同的生物酶活性。本綜述介紹了菱形體蛋白對其底物的特異性結合、對底物的加工修飾、在信號轉導過程中的作用及與人類疾病的關系。

1 菱形體蛋白的分類、分布和主要生物學功能

菱形體蛋白根據發(fā)現的先后和分子特點，可分為RHBDL1、RHBDL2、RHBDL3、RHBDL4及早老素相關菱形樣蛋白(presenilinassociatiated rhomboid like protein，PARL)、非活躍的菱形體蛋白(inactive Rhomboid，iRhom)、菱形域包含蛋白(rhomboid domain containing，Rhbdd)等。

菱形體蛋白1表達于高爾基體，與果蠅rhomboid-1有相似的信號通路[2]；RHBDL2是在細胞質中發(fā)現的，作為跨膜絲氨酸蛋白酶，在細胞信號轉導中起關鍵性的作用；RHBDL3是典型的胞內蛋白；RHBDL4最初被認為是一種線粒體蛋白，隨后通過亞細胞分離和熒光顯微鏡分析確定了RHBDL4存在于內質網中[3]；PARL是線粒體菱形體蛋白酶，其定位于線粒體膜上[4]。iRhom有兩個亞型，分別是iRhom1和iRhom2；Rhbdd3是屬于一類含有菱形體結構域的蛋白家族，在調節(jié)自身免疫過程中有著重要作用[5]。

作為細胞內的蛋白酶，菱形體蛋白家族成員通過識別不同的底物，發(fā)揮著特異的生物學作用。RHBDL2的底物有Spitz(果蠅)、Gurken(果蠅)、血栓調節(jié)蛋白(Thrombomodulin)、Ephrion-B2和Ephrion-B3、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和ErbB-1；RHBDL4/RHBDD1的底物有BIK1、TSAP6、PreTCR、TCR、MPZ-L170R、opsin-degron、多囊蛋白-1(polycystin-1)、runcations；PARL的底物有OPAI、Omi/HtrA2、PINK1、磷酸甘油酸變位酶5 (phosphoglyceratemutase family member 5，PGAM5)；iRhom的底物有ADAM17[5-6]；RHBDL1和RHBDL3的底物尚不明確。在所有的菱形體蛋白中，研究相對比較清楚的是RHBDL2。

2 RHBDL2的生物學作用及與人類疾病的關系

RHBDL2是菱形體蛋白家族成員之一，廣泛分布于原核生物和真核生物。研究表明RHBDL2能夠激活哺乳動物的表皮生長因子受體；裂解膜內的EphrinB3、C型凝集素家族14成員A(C-type lection family 14 menber A，CLEC14A)；參與血栓調節(jié)蛋白的釋放；調節(jié)內皮細胞的活性；裂解某些膜結合的底物而釋放可溶性的生長因子；促進皮膚傷口愈合；其高表達可能會誘發(fā)腫瘤。

2.1 RHBDL2激活效應蛋白大多數表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)的配體可以水解釋放蛋白激酶，調控多種信號的表達，產生不同的生物學效應。研究表明，EGF是哺乳動物菱形體蛋白RHBDL2的底物。在EGF的跨膜結構區(qū)域外，RHBDL2對其進行裂解，從而促進其激活，這直接證明了EGFR信號轉導中有哺乳動物菱形體蛋白RHBDL2的參與[7]。EGFR途徑在動物的生長發(fā)育中也有著重要的作用，高度的活躍表達可以誘導癌癥的發(fā)生。RHBDL2可以通過刺激EGF激活EGFR信號，這可能和其致癌機制有關。RHBDL2在體外EGFR信號表達中是否起到關鍵作用，對其進行抑制作用是否可在癌癥中提供新的治療途徑，是值得探究的新課題。

CLEC14A是單通道的跨膜糖蛋白，在腫瘤的內皮細胞中高表達。它可通過蛋白質的相互作用，促進和調節(jié)血管內皮細胞生成。Noy PJ[8]發(fā)現RHBDL2可以裂解CLEC14A，并且確定了RHBDL2裂解CLEC14A的蛋白位置。內源性裂解CLEC14A的缺失可以增加2倍的內皮細胞遷移率，促進血管內皮細胞的生成。RHBDL2對CLEC14A的裂解和調節(jié)，表明了RHBDL2能夠調節(jié)蛋白質的分子結構，促進可溶性因子的釋放，對內皮細胞的生成具有調控作用。

Lohi[2]等人確認了血栓調節(jié)蛋白是RHBDL2的一種蛋白底物，因為血栓調節(jié)蛋白上有EGF樣區(qū)域，并且被菱形體蛋白識別。RHBDL2裂解血栓調節(jié)蛋白顯示其可能在體外皮膚損傷方面具有調節(jié)作用，這種作用是通過刺激角化細胞遷移而完成的。

2.2 RHBDL2與人類疾病RHBDL2是一種進化保守、功能多樣的水解蛋白酶。它能夠調節(jié)表皮生長因子受體信號通路、內質網降解以及細胞的凋亡和增殖。RHBDL2通過特異性識別底物、控制膜內蛋白的降解而發(fā)揮一系列的細胞功能。在哺乳類動物蛋白分泌相關疾病中，RHBDL2起到了重要的作用。RHBDL2是膜內絲氨酸蛋白酶，能夠在跨膜區(qū)裂解血栓調節(jié)蛋白，激活可溶性的血栓調節(jié)蛋白，促進皮膚創(chuàng)傷愈合[9]。菱形體蛋白與人類的腫瘤的發(fā)生機制有密切聯系，通過激活或反向激活表皮生長因子信號通路調節(jié)細胞的凋亡和增殖[10]。研究表明乳腺癌細胞可以表達多種菱形體蛋白基因，盡管在正常乳房組織中有菱形體蛋白基因的表達，但某些菱形體蛋白基因的高表達，尤其是在特定的乳腺癌亞型中，可能會導致腫瘤的惡化。RHBDL2和PAPL對于乳腺癌腫瘤組織學分級有顯著意義[11]。盡管菱形體蛋白能夠被廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑二氯異香豆素所抑制，但是二氯異香豆素的半衰期和毒性作用都限制了其進一步應用[12]，使得研究RHBDL2內源性的生物活性調控具有挑戰(zhàn)性。細菌菱形體蛋白的體外藥物篩選試驗鑒定了β-lactams作為潛在先導化合物也能夠抑制RHBDL2的活性[13]，這樣在未來菱形體蛋白抑制劑作為治療藥物時會有更多的選擇。

3 RHBDL1和 RHBDL3的初步認識及其底物探究

果蠅體內Rhomboid-1蛋白是一種生長因子激活劑，1998年在探究Rhomboid-1是否能夠作為膜內蛋白酶時，對哺乳動物菱形體蛋白酶的第一個基因進行了克隆[14]。柔嫩艾美耳球蟲體內也發(fā)現了Rhomboid-1存在，Rhomboid-1蛋白水解其底物MIC蛋白是蟲體侵入宿主細胞的重要過程[1]，和果蠅基因相比較，這種未知功能的蛋白質命名為RHBDL1。目前對于RHBDL1的詳細分子結構和具體生物學作用尚不清楚。

盡管RHBDL3異位表達的底物和RHBDL2有部分共同之處,但至今沒有報告顯示RHBDL3的蛋白酶水解活性。因此，迫切需要更有效的底物識別方法來解讀RHBDL3的激活途徑。人類大腦組織芯片分析揭示 RHBDL3基因表達與年齡和機體老化有聯系，表明了菱形體蛋白活性和衰老表型有密切相關性[15]。此外，表達譜分析表明RHBDL3在胰腺發(fā)育過程中具有重要作用[16]。

4 RHBDL4的底物識別

哺乳動物的菱形體蛋白RHBDL4，也被稱為RHBDD1，可促進膜蛋白的轉運，包括從內質網到高爾基體，誘導EGFR配體TGF-α的轉運，在細胞外微泡觸發(fā)其分泌。研究表明， RHBDL4的信號轉導是依賴G蛋白偶聯受體完成的[17]。RHBDL4能夠有效地裂解細胞內的淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)，導致β-淀粉樣前體蛋白水平降低。同樣地，APP 家族成員 APLP和APLP2也是RHBDL4的底物。APP是一種廣泛表達的細胞表面蛋白，也是阿爾茨海默病發(fā)病的關鍵分子。探究RHBDL4調節(jié)APP 的過程，深刻了解APP 和菱形體蛋白的生理特點，對闡述阿爾茨海默病病理機制有重要的意義[18]。另外，RHBDL4是一個活躍的菱形體蛋白，能特異性識別并參與非典型且?guī)д姾傻哪荣|網相關降解(endoplasmic-reticulum-associated protein degradation，ERAD)。纈酪肽蛋白質(p97/VCP)和RHBDL4相互作用對于 ERAD途徑的多聚泛素化底物修飾至關重要的[19]。ERAD途徑是通過引導錯誤折疊和未結合的蛋白質從內質網到蛋白酶水解的一個重要的細胞保護機制。進化保守的菱形體家族蛋白RHBDL4位于膜內內質網，發(fā)揮泛素依賴性蛋白酶活性，調節(jié)內質網信號轉導。RHBDL4能夠裂解具有不穩(wěn)定跨膜螺旋的單跨膜和多跨膜類的膜蛋白，從而導致其典型ERAD降解。

5 PARL的生物學功能與人類疾病的相關性

PARL是一種功能未完全清楚的線粒體內膜菱形體蛋白。PARL受PDK2調控以整合線粒體質量控制(Mitochonrial quality control，MQC)和代謝，對維持線粒體完整和正常細胞功能有著至關重要的作用[20]。淋巴細胞和神經細胞凋亡抑制過程需要bcl-2家族相關蛋白——HAX1(HS1 associated proteinX-1)和PARL參與。PARL和HAX1 形成的復合物能夠募集線粒體絲氨酸蛋白酶HtrA2 /Omi，HtrA2 /Omi激活后可以誘導細胞凋亡。缺血后PARL的下調是缺血性神經元損傷的關鍵步驟，它減少HtrA2的加工并增加神經元的脆弱性[21]。PGAM5是線粒體絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，在線粒體膜電位損失時，其N末端跨膜結構域被切割。 PGAM5的線粒體膜電位損失依賴性切割是由PARL介導的[22]。PINK1和PARK2 / Parkin的突變是家族性帕金森病的主要危險因素。在PARL缺乏時，線粒體中PINK1的C末端氨基酸序列突變導致線粒體膜電位消散使線粒體受損，而誘導帕金森病。另外，帕金森病患者的部分基因測序發(fā)現PARL的N端功能域有一個新的錯義突變。該突變可能通過線粒體自噬，導致神經退行性變，引起帕金森病的發(fā)生[23]。菱形蛋白是分布廣泛和進化保守的膜內絲氨酸蛋白，它們在細菌、植物和動物細胞生長過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，哺乳動物線粒體蛋白PARL對維持線粒體結構和功能完整性具有重要的意義[24]。

6 iRhoms的調節(jié)途徑與人類疾病的相關性

iRhoms是內質網蛋白質，分為iRhom1和iRhom2兩個亞型，參與多種細胞內外的信號轉導，在多種情況下調節(jié)膜蛋白的運輸。與其他Rhomboid蛋白酶家族成員相反，iRhom缺乏蛋白酶催化活性，并且作為偽蛋白酶，結合靶蛋白EGF并抑制EGF配體向高爾基體的易位[25]。腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor α，TNFα) 轉換酶(tumor necrosis factor α conveting enzyme，TACE)屬于含鋅金屬蛋白酶家族。研究表明，iRhoms是TACE活性必需的重要調節(jié)分子。iRhom2對于TACE運輸和處理以控制造血細胞中的腫瘤壞死因子含量是至關重要的。iRhom2/TACE/Notch通路的研究，闡述了機械通氣性肺損傷的作用機制，為臨床診斷和治療機械通氣性肺損傷提供了理論依據[26]。iRhom2/TACE/TNFα通路機制還對血友病性關節(jié)炎的治療有一定的影響，iRhom2的結構域的突變可以引起食道癌[27-28]。

7 Rhbdd3的生物學功能及與人類疾病的相關性

Rhbdd3是一類含有Rhomboid結構域的蛋白家族，首先在對垂體瘤中的基因甲基化篩選中被分離和鑒定出來，早期被稱為垂體瘤凋亡基因(pituitary tumor apoptosis gene，PTAG)，定位于11號染色體，編碼385個氨基酸。研究表明Rhbdd3抑制樹突狀細胞(Dendritic Cells，DC)的活化，從而抑制由Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)觸發(fā)的白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)的產生。Rhbdd3缺陷型小鼠能夠自發(fā)形成自身免疫性疾病，其特征在于輔助性T 細胞17(T helper cell 17,Th17)亞群的豐度增加。Rhbdd3通過與調控因子NEMO 蛋白Lys302位點連接的K27位多聚泛素鏈相互作用，抑制樹突狀細胞生成IL-6，由此調控自身免疫[29]。Rhbdd3廣泛表達于免疫細胞，研究發(fā)現Rhbdd3在自然殺傷細胞中選擇性上調Toll樣受體3(Toll-like receptor 3，TLR3)，刺激后的細胞以反饋方式負向調節(jié)TLR3介導的自然殺傷細胞活化，從而抑制TLR3引發(fā)的急性肝損傷，提示Rhbdd3有可能夠作為免疫穩(wěn)態(tài)的維持者，為治療肝臟炎癥性疾病提供了一個新的機制。此外，Rhbdd3還可以通過泛素化途徑影響DNAX激活蛋白12(DNAX activation protein of 12kDa，DAP12)的降解而增加DAP12的促癌作用。

8 結語

菱形體蛋白家族成員多以絲氨酸蛋白酶的形式發(fā)揮生物學作用。通過對其底物的加工修飾，參與許多重要的細胞進程。已有的研究表明，菱形體蛋白與人類的許多疾病尤其是惡性腫瘤密切相關，有可能成為新的研究靶點。