王思婷，薛 蕊，宋 晨，趙前程，李智博

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實驗室，遼寧大連 116023）

單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus） 又名海腸，主要分布于中國、俄羅斯、日本及朝鮮沿海地區(qū)的泥灘、巖石縫中[1-2]。單環(huán)刺螠自古就具有裸體海參的美譽(yù)[3]，含有較多的無機(jī)鹽及微量元素[4]，主要可食部位是體壁[5]，其必需氨基酸占17.79%；目前單環(huán)刺螠的研究集中于多肽、纖溶酶及養(yǎng)殖繁育方面[6-8]，對于加工方面的研究鮮有報道。

采用酶解法制得的調(diào)味料富含呈味物質(zhì)（如氨基酸、有機(jī)酸）和活性物質(zhì)（如維生素、?；撬幔?，不僅營養(yǎng)豐富，而且風(fēng)味鮮美醇厚[9]。薛宇航等人[10]酶解竹節(jié)蝦蝦頭，發(fā)現(xiàn)酶解液具有濃郁的海鮮味道，可進(jìn)一步研發(fā)為海鮮調(diào)味品。樊佳歡，師江等人[11-12]采用胰蛋白酶酶解章魚內(nèi)臟，以酶解液為基料進(jìn)一步配制復(fù)合海鮮調(diào)味料，酶解工藝優(yōu)化后，蛋白質(zhì)的酶解度高達(dá)37.81%。郭磊等人[13]對牛肝菌酶解液成分進(jìn)行分析并將其凍干制成復(fù)合調(diào)味料，結(jié)果表明，酶解液含有17種氨基酸，總量為1 895.63 mg/kg。劉海梅等人[14]對單環(huán)刺螠酶解產(chǎn)物進(jìn)行研究，結(jié)果表明，水解液中18種氨基酸種類齊全，鮮味氨基酸含量豐富，其中Glu含量最高，為218.263 mg/100 mL，其次為Gly和Ala，再次為Asp。酶解液具有濃郁的鮮美味，是良好的海鮮調(diào)味料基料。試驗以新鮮單環(huán)刺螠為原料，經(jīng)過酶解條件優(yōu)化，將酶解液噴霧干燥制作成為的單環(huán)刺螠調(diào)味料，并測定其對·OH和DPPH·的清除能力，以滿足消費(fèi)者對營養(yǎng)和健康的雙重需要，豐富單環(huán)刺螠產(chǎn)品的種類。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮單環(huán)刺螠，購買于大連興工街長興市場。

風(fēng)味酶（3萬U/g）、木瓜蛋白酶 （10萬U/g）、蛋白酶（5萬U/g）、堿性蛋白酶（20萬U/g）、胰蛋白酶（4 000 U/g），上海瑞永生物科技有限公司提供；30%過氧化氫（分析純）、水楊酸（分析純），北京化學(xué)試劑有限公司提供；FeSO4·7H2O（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；無水乙醇（分析純），新光化工試劑廠提供；二苯基苦味肼基自由基（DPPH），梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司提供。

BY-2000型噴霧干燥機(jī)，上海秉越電子儀器有限公司產(chǎn)品；JA12002型電子精密天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；DS-1型高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠產(chǎn)品；PHS-3C型精密PH計，上海雷磁儀器廠產(chǎn)品；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電氣有限公司產(chǎn)品；可調(diào)萬用電爐，山東省龍口市先科儀器公司產(chǎn)品；GI21M型離心機(jī)，上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠產(chǎn)品；FD-1型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)品；SYNERGY HI型酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 調(diào)味料制備方法的選擇

（1）酶解法。稱取一定量的單環(huán)刺螠體壁，進(jìn)行勻漿，料液比1∶20，調(diào)節(jié)pH值8.0，加入風(fēng)味酶，添加量為0.3%，并放入50℃水浴鍋中水浴，酶解3 h。酶解后將酶解液放入沸水浴滅酶5 min，冷卻后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，收集上清液。將其噴霧干燥。

（2）直接凍干。稱取100 g單環(huán)刺螠體壁，清洗之后直接凍干，凍干之后研磨成粉末。

（3） 漂燙后凍干。稱取100 g的單環(huán)刺螠體壁，在沸水中漂燙20 s后進(jìn)行凍干，凍干后將其研磨成為粉末。

（4）漂燙勻漿后凍干。稱取一定量的單環(huán)刺螠體壁，在沸水中漂燙20 s后撈出，加入3倍的水進(jìn)行勻漿，再加1倍的水煮20 min（以水開為準(zhǔn)）。過濾去渣后將其溶液噴霧干燥。

選取5名男性、5名女性，共計10名食品專業(yè)經(jīng)過培訓(xùn)的感官評價員，對處理之后的產(chǎn)品進(jìn)行感官評價，滿分為10分。

感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 單環(huán)刺螠的酶解條件優(yōu)化

（1）反應(yīng)用酶的篩選。采用中性蛋白酶、風(fēng)味酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶對單環(huán)刺螠進(jìn)行酶解。選用固定條件酶解：料液比1∶20（g∶mL），酶添加量0.3%，酶解時間3 h。選用各種酶的最適酶解溫度和pH值，以感官評價為指標(biāo)進(jìn)行酶解。

5種酶的最適溫度及pH值見表2。

表2 5種酶的最適溫度及pH值

（2）單因素試驗。酶解條件的優(yōu)化可提升蛋白質(zhì)的分解效果[15]。對選取的蛋白酶進(jìn)行酶解條件的優(yōu)化，待優(yōu)化因素為酶解時間（1，2，3，4，5 h）、酶解溫度（40，45，50，55，60℃）、酶添加量（0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%）、料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25），以感官評分為衡量指標(biāo)。

（3）正交試驗。為了獲得風(fēng)味最佳的單環(huán)刺螠調(diào)味料，對酶添加量、酶解溫度、酶解時間3個主要因素進(jìn)行考查，根據(jù)單因素試驗結(jié)果選擇因素水平，以感官評價得分為衡量指標(biāo)，利用L9（34）正交表進(jìn)行優(yōu)化試驗。

因素與水平設(shè)計見表3。

表3 因素與水平設(shè)計

1.2.3 單環(huán)刺螠調(diào)味料抗氧化能力研究

（1）·OH清除能力測定。參照BeeleyJ G[16]的方法并略做改進(jìn)。分別配制0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL質(zhì)量濃度的單環(huán)刺螠調(diào)味料溶液，取不同質(zhì)量濃度的樣液各0.5 mL，依次加入配制好的FeSO4溶液、H2O2溶液、水楊酸0.5 mL，于37℃下水浴30 min后取出搖勻，于波長510 nm處測定吸光度?！H清除率計算公式：

（2） DPPH·清除能力測定。參照Singh N等人[17]的方法并略做改進(jìn)。分別配制質(zhì)量濃度為1，2，3，4，5 mg/mL的單環(huán)刺螠調(diào)味料溶液，各質(zhì)量濃度溶液分別取1 mL，加1 mL DPPH·溶液，搖勻后于室溫下靜置30 min，于波長517 nm處測定吸光度A1。清除率計算公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 調(diào)味料制備方式的選擇

調(diào)味料制備方式對感官評價的影響見圖1。

圖1 調(diào)味料制備方式對感官評價的影響

由圖1可知，酶解法得到的調(diào)味料得分最高。酶解法可以使單環(huán)刺螠體壁蛋白質(zhì)水解，生成游離氨基酸，提高產(chǎn)品的鮮度，因此是單環(huán)刺螠調(diào)味料最適宜的制備方式。

2.2 風(fēng)味酶的酶解條件優(yōu)化

2.2.1 單酶的篩選

風(fēng)味蛋白酶包含了內(nèi)切酶和外切酶2種活性，可以使風(fēng)味前體物酶解，釋放風(fēng)味物質(zhì)，在一定程度上增強(qiáng)和改善食品風(fēng)味。加入風(fēng)味蛋白酶的試驗組具有淺淡的海鮮味，且無其他異味。

酶的種類對單環(huán)刺螠體壁酶解的影響見圖2。

圖2 酶的種類對單環(huán)刺體壁酶解的影響

由圖2可知，風(fēng)味蛋白酶組的感官評分最高。

2.2.2 酶解時間的篩選

以感官評價為指標(biāo)，分別選取5種不同酶解時間1，2，3，4，5 h，控制酶解溫度50℃，酶添加量0.3%，料液比1∶20對單環(huán)刺螠原料進(jìn)行酶解。

酶解時間對單環(huán)刺螠體壁酶解的影響見圖3。

圖3 酶解時間對單環(huán)刺體壁酶解的影響

由圖3可知，當(dāng)酶解時間為2 h時，感官評分最高。因此，選取2 h為最合適的酶解時間。

2.2.3 酶添加量的篩選

以感官評價為指標(biāo)，分別選取5種不同酶添加量0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，控制酶解時間 2 h，酶解溫度50℃，料液比1∶20對單環(huán)刺螠體壁進(jìn)行酶解。

酶添加量對單環(huán)刺螠體壁酶解的影響見圖4。

圖4 酶添加量對單環(huán)刺體壁酶解的影響

由圖4可知，當(dāng)酶添加量為0.5%時，感官評分最高。因此，選取0.5%為最適酶添加量。

2.2.4 料液比的篩選

以感官評價為指標(biāo)，分別選取5種不同料液比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，控制酶解時間2 h，酶解溫度50℃，酶添加量0.5%，對單環(huán)刺螠體壁進(jìn)行酶解。

料液比對單環(huán)刺螠體壁酶解的影響見圖5。

圖5 料液比對單環(huán)刺體壁酶解的影響

由圖5可知，當(dāng)料液比為1∶15時，感官評分最高。因此，選取1∶15為最適料液比。

2.2.5 酶解條件的正交試驗

正交試驗直觀分析見表3。

極差分析結(jié)果表明，影響風(fēng)味酶酶解感官評分的各因素排列順序為C＞A＞B，即酶解溫度＞酶添加量＞酶解時間。由正交試驗結(jié)果可以得到風(fēng)味酶對單環(huán)刺螠的優(yōu)化酶解條件為A2B2C2，即酶添加量0.5%，酶解時間2 h，酶解溫度50℃。

2.3 單環(huán)刺螠調(diào)味料的抗氧化活性測定

單環(huán)刺螠調(diào)味料對·OH的清除作用見圖6，單環(huán)刺螠調(diào)味料對DPPH·的清除作用見圖7。

由圖6可知，隨著單環(huán)刺螠調(diào)味料質(zhì)量濃度的增加對·OH的清除能力表現(xiàn)為質(zhì)量濃度依賴性增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，清除率為65.07%。由圖7可知，隨著單環(huán)刺螠調(diào)味料質(zhì)量濃度的增加，其對DPPH·清除能力表現(xiàn)為質(zhì)量濃度依賴性增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，清除率為75.86%。

表3 正交試驗直觀分析

圖6 單環(huán)刺調(diào)味料對·OH的清除作用

圖7 單環(huán)刺調(diào)味料對DPPH·的清除作用

3 結(jié)論

對比不同的制備方法，酶解法制備的單環(huán)刺螠調(diào)味料味道鮮美、質(zhì)感細(xì)膩、無腥味、感官評價更好。通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化，確定風(fēng)味酶的最佳酶解條件為酶添加量0.5%，酶解時間2 h，pH值7，酶解溫度50℃，料液比1∶15。單環(huán)刺螠調(diào)味料對·OH及DPPH·均有清除效果，并呈劑量依賴性。