孫曉宇,薄明井,楊亞欣,張惟材,葛欣,熊向華
1.河北大學生命科學學院,河北保定071000;
2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生物工程研究所,北京100071
甲基營養(yǎng)菌(Methylotrophs)是一類能利用甲醇作為惟一碳源和能源生長的革蘭陰性細菌。本實驗室前期通過對甲基營養(yǎng)菌MP688 多輪誘變篩選獲得吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)高產(chǎn)菌株J1-1,其甲醇代謝由周質(zhì)定位的甲醇脫氫酶(methanol dehydrogenase,MDH)負責,氧化生成的產(chǎn)物甲醛進入胞質(zhì)經(jīng)H4MPT、RuMP和FaDH-FDH 等途徑進一步代謝,為菌體生長及PQQ 的合成提供構(gòu)造元件和能量,也產(chǎn)生部分副產(chǎn)物,影響PQQ 產(chǎn)量[1]。前期研究發(fā)現(xiàn),J1-1 的甲醇脫氫酶活性與PQQ 產(chǎn)量呈負相關(guān),因而推測通過改造MDH 天然啟動子(P0771),下調(diào)MDH 轉(zhuǎn)錄水平從而降低MDH 活性,有望提高PQQ 產(chǎn)量[2-3]。本研究我們通過P0771定點突變獲得了7 個突變啟動子,利用lacZ作為報告基因檢測突變啟動子對其轉(zhuǎn)錄水平的影響,篩選出2 個lacZ 酶活水平較天然啟動子下降的突變啟動子P0771-1、P0771-5 并導入J1-1 替換天然P0771啟動子,得到的2 株突變菌株在增菌培養(yǎng)基中MDH 活性下降,PQQ 合成水平高于J1-1,且在生長穩(wěn)定期(96 h)PQQ 合成水平較起始菌株J1-1 分別提高約9.76%和11.6%。
甲基營養(yǎng)菌J1-1、質(zhì)粒pCM66-lacZ、自殺質(zhì)粒pGX 由本實驗室保存;大腸桿菌DH5α、λ-pir感受態(tài)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司;快速質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;限制性內(nèi)切酶、瓊脂糖凝膠DNA 回收純化試劑盒購自Thermo 公司;DNA marker、2×Basic Assemble Mix 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;Mut ExpressⅡFast Mutagenesis Kit V2 試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;PCR 引物(表1)合成及DNA 測序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。
增菌培養(yǎng)基:MgSO4·7H2O 0.2 g/L,KH2PO41.4 g/L,(NH4)2SO43.0 g/L,Na2HPO43.0 g/L,CaCl230.0 mg/L,MnCl2·4H2O 5.0 mg/L,ZnSO4·7H2O 5.0 mg/L,CuSO4·5H2O 0.5 mg/L,檸檬酸鐵30.0 mg/L。115℃滅菌30 min,使用時添加甲醇至10 mL/L。
突變啟動子質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)Mut Express Ⅱ Fast Mutagenesis Kit V2 試劑盒說明書指導完成。
表1 PCR 引物及序列
將突變菌株按1%的接種量接種于5 mL 增菌液體培養(yǎng)基中,相同條件下培養(yǎng)2~3 d 至對數(shù)生長期(菌液D600nm為1.0),收取4 mL 菌液,12 000 r/min 離心10 min,棄上清;菌體重懸于500 μL TE 緩沖液(pH7.0),冰水浴超聲2 min(超聲3 s,間歇3 s)破碎菌體,4℃、12 000 r/min 離心10 min;取超聲上清100 μL 于EP 管中,加入0.5 mL Z 緩沖液(60 mmol/L Na2HPO4,40 mmol/L NaH2PO4,10 mmol/L KCl,1 mmol/L MgSO4,50 mmol/L β巰基乙醇,pH7.0),30℃溫育10 min;加入150 μL ONPG,30℃溫育25 min,加入0.5 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應;測定反應液D420nm和D550nm值,按下式計算D600nm值酶單位:
式中,T為反應時間(min),V為所用細胞破碎液體積(mL)。
1.4.1 粗酶液的制備 將突變菌株按1%的接種量接種至100 mL 增菌液體培養(yǎng)基中,30℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng),12 000 r/min 離心10 min 收集菌體,重懸于1 mL 100 mmol/L Tris-HCl(pH9.0)緩沖液中,冰水浴超聲2 min(超聲3 s,間歇3 s),4℃、12 000 r/min 離心10 min,上清液用于酶活性檢測。
1.4.2 DCIP 法檢測MDH 活性 1 mL 反應液包含100 mmol/L Tris-HCl(pH9.0)、15 mmol/L NH4Cl、10 mmol/L 甲醇、50 μmol/L DCIP、100 μL 粗酶液,最后加入0.33 mmol/L PMS 啟動反應。根據(jù)反應液退色(綠色→黃色)時間可以快速判別樣品中酶的活性,按下式計算MDH 的活性。1 個活性單位(U)定義為每分鐘還原1 μmol DCIP 所需酶量,在D600nm處DCIP 的摩爾吸光系數(shù)ε 為1.9×104L/(mol·cm)。
式中,N為稀釋率,V總為酶活測定反應體系的總體積(mL),ΔD600nm為T時間內(nèi)反應液D600nm的增加值,V酶為反應添加酶液的體積(mL),T為反應時間(min),L為比色皿直徑(cm)。
將待測菌接種于含有100 mL 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中,30℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng),每12 h檢測一次菌密度和PQQ 產(chǎn)量[6],每組設3 個平行。
MP688 全基因組(CP002258)注釋結(jié)果顯示反向mpq_0770基因(編碼TruB)和正向mpq_0771基因(編碼MDH α亞基)的編碼區(qū)間隔251 bp(圖1),這一段序列我們確定為mpq_0771基因的啟動子(P0771),用P0771-XbaⅠ-F 和P0771-BamHⅠ-R 引物對擴增P0771啟動子,構(gòu)建pCM66-P0771-lacZ質(zhì)粒。前期研究及文獻調(diào)研結(jié)果提示啟動子5′端為其調(diào)控元件,因而選擇啟動子5′端25 bp 序列以每5個堿基為一組進行突變(A 與G 互換,T 與C 互換),依次命名為突變啟動子P0771-1 至P0771-5。另將預測的P0771啟動子-35 區(qū)第3 個堿基G 替換成A(P0771-6),第4 個堿基T 替換成A(P0771-7)[7-9]。設計P0771啟動子突變引物,利用定點突變試劑盒對pCM66-P0771-lacZ質(zhì)粒進行定點突變,經(jīng)測序驗證最終獲得7 個P0771啟動子突變質(zhì)粒(圖2)。
將pCM66-P0771-lacZ質(zhì)粒及7 個啟動子突變質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)至J1-1,通過β半乳糖苷酶活測定來分析突變啟動子活性。結(jié)果如圖3 所示,不同的突變位點對P0771啟動子活性均有一定的影響,其中P0771-1、P0771-5 突變啟動子的活性較天然啟動子下降,通過SPSS 軟件進行統(tǒng)計學分析,結(jié)果顯示差異具有顯著性(P<0.05,P<0.01)。
構(gòu)建含慶大霉素(Gm)篩選抗性和P0771啟動子基因的自殺質(zhì)粒,利用同源重組替換染色體上的P0771啟動子,獲得重組菌株。mpq_0770基因和mpq_0771基因間隔區(qū)長251 bp,且轉(zhuǎn)錄方向相反,經(jīng)啟動子軟件(SoftBerry)分析發(fā)現(xiàn),正向的P0771啟動子和反向的P0770啟動子相互重疊(圖4)。為防止P0771啟動子突變對mpq_0770基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響,設計將P0770啟動子通過Gm基因和P0771啟動子分隔,并將Gm基因作為篩選標記,選取P0770啟動子上游1500 bp 作為Up 同源臂,P0771啟動子下游1500 bp 作為Down 同源臂,如圖5 所示。依此構(gòu)建自殺型pGX-Up-P0770-Gm-P0771-Down 重組質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)至J1-1,利用同源重組置換天然啟動子,得到重組菌株,測序證明基因已成功替換(測序結(jié)果略),考察生長及PQQ 產(chǎn)量與起始菌株J1-1 無顯著差異(圖6、7),說明P0770-Gm-P0771雙啟動子的置換對菌株生長及PQQ 合成沒有影響,為后續(xù)P0771突變啟動子的替換奠定了基礎(chǔ)。
圖1 P0771啟動子
圖2 P0771突變啟動子測序鑒定
將自殺型pGX-Up-P0770-Gm-P0771-Down 重組質(zhì)粒中的P0771啟動子與突變啟動子P0771-1 和P0771-5 替換后電轉(zhuǎn)至J1-1,利用同源重組法進行基因替換,分別獲得P0771-1/J1-1 和P0771-5/J1-1 突變菌株。在增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng),穩(wěn)定期(96 h)2 株突變菌株的MDH 活性均明顯低于起始菌株J1-1(圖8),提示P0771突變啟動子通過下調(diào)mpq_0771基因轉(zhuǎn)錄降低了MDH 活性。如圖9 所示,24 h 時2 株突變菌株生長速率均顯著高于起始菌株J1-1,到穩(wěn)定期后三者菌密度無顯著差異。在生長過程中2 株突變菌株的PQQ 合成水平均高于起始菌株J1-1,到96 h 時突變菌株P(guān)0771-1/J1-1 和P0771-5/J1-1 的PQQ 產(chǎn)量分別為29.36、29.85 mg/mL,與起始菌株J1-1(26.75 mg/mL)相比,分別提高9.76%、11.6%(圖10)。
圖3 啟動子突變株的β半乳糖苷酶活性
圖4 P0770和P0771啟動子預測
圖6 重組菌株在增菌培養(yǎng)基中的生長曲線
圖7 重組菌株在增菌培養(yǎng)基中的PQQ 合成水平
圖8 突變菌株的MDH 活性(增菌培養(yǎng)基,96 h)
圖9 突變菌株在增菌培養(yǎng)基中的生長曲線
圖10 突變菌株在增菌培養(yǎng)基中的PQQ 合成水平
迄今發(fā)現(xiàn),在自然界能夠合成PQQ 的生物只有某些革蘭陰性細菌,而甲基營養(yǎng)菌是PQQ 合成水平最高的菌屬[10-13]。甲基營養(yǎng)菌J1-1 是本研究團隊從土壤中分離得到的PQQ 高產(chǎn)菌。甲醇初級氧化生成甲醛作為甲醇代謝途徑的第一步,在甲基營養(yǎng)菌J1-1 的分解代謝中至關(guān)重要,也是甲醇代謝調(diào)控的重要靶點[14-15]。本實驗室前期將J1-1 染色體上的MDH 基因mpq_0771敲除,發(fā)現(xiàn)敲除菌在甲醇為碳源的培養(yǎng)基中不能生長。前期研究同時還發(fā)現(xiàn)J1-1 中MDH 活性與PQQ 合成水平呈負相關(guān),因而進一步推測通過降低MDH 啟動子轉(zhuǎn)錄活性,可以提高PQQ 的產(chǎn)量。本研究中我們通過對P0771啟動子的突變、篩選、鑒定,最終獲得2 株較天然啟動子轉(zhuǎn)錄水平下降的啟動子突變菌株P(guān)0771-1/J1-1 和P0771-5/J1-1;與J1-1 相比,突變菌株在增菌培養(yǎng)基中MDH 活性均顯著低于起始菌株J1-1,且在生長穩(wěn)定期(96 h)PQQ 合成水平分別提高了約9.76%、11.6%,證明通過降低MDH 基因的轉(zhuǎn)錄水平可以有效提高J1-1 的PQQ產(chǎn)量。