李明如，聶振凱，林貴湖，張凱華

中國(guó)航天科工集團(tuán)七三一醫(yī)院胸外科，北京100074

肺腺癌是最常見的肺癌類型，也是最致命和最常見的癌癥之一[1]。肺腺癌患者的5 年總生存率僅為11%，嚴(yán)重威脅著人類健康[2]。因此，闡明肺腺癌發(fā)生的分子機(jī)制，尋找新的預(yù)后標(biāo)志物和分子治療靶點(diǎn)，提高對(duì)人肺腺癌的診斷、預(yù)防和治療水平，已成為當(dāng)務(wù)之急。ERBB4 是表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員，在生理和病理過(guò)程中起重要作用。但ERBB4 在癌癥中的作用仍存在爭(zhēng)議。長(zhǎng)期以來(lái)，ERBB4 一直被認(rèn)為是一種致癌基因，如是黑色素瘤的潛在治療靶點(diǎn)[3]，促進(jìn)尤文氏肉瘤的轉(zhuǎn)移[4]和人乳腺癌細(xì)胞的增長(zhǎng)[5-6]，甚至可以提高肺癌細(xì)胞的增殖潛能[7]。然而，一些研究結(jié)果卻表明ERBB4 在腫瘤中發(fā)揮著抑癌的作用，如促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡[8-9]，ERBB4 缺失會(huì)促進(jìn)肝細(xì)胞腫瘤的發(fā)生[10]。最近有研究發(fā)現(xiàn)ERBB4 的缺失通過(guò)抑制腫瘤抑制因子TP53 誘導(dǎo)核蛋白 1（TP53- inducible nucleoprotein 1，TP53INP1）的表達(dá)來(lái)抑制p53 基因的表達(dá)，從而促進(jìn)了肝癌的發(fā)生發(fā)展[10]。本研究旨在探究ERBB4與TP53INP1 在肺腺癌中的表達(dá)作用關(guān)系，并揭示ERBB4 的表達(dá)對(duì)肺腺癌預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

20 例腫瘤組織樣本來(lái)自在中國(guó)航天科工集團(tuán)七三一醫(yī)院治療的肺腺癌患者；肺腺癌細(xì)胞系SPC-A-1、H1299 和人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，均采用RPMI-1640 培養(yǎng)基（添加10%胎牛血清），于37℃、含5% CO2濕化氣氛的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)；pGL3 載體購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰荆籖PMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司；LipofectAMINE 3000 試劑盒、TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa 公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑購(gòu)自Promega 公司；TP53INP1、ERBB4、β-actin 及含辣根過(guò)氧化物酶的二抗購(gòu)自Abcam 公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自BioRad 公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

用LipofectAMINE 3000 試劑盒對(duì)H1299 細(xì)胞中的ERBB4 轉(zhuǎn)染siRNAs，分為si-ERBB4 組和si-NC 組。將PCR 擴(kuò)增得到的ERBB4 基因克隆到慢病毒載體中，滴度檢測(cè)后，將成功包裝的過(guò)表達(dá)載體和陰性對(duì)照載體轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞H1299，分為oe-ERBB4 組和oe-NC 組。

1.3 數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

通過(guò)Kaplan-Meier plotter 分析平臺(tái)（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service），在線分析來(lái)自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的TP53INP1 和ERBB4 基因表達(dá)數(shù)據(jù)與肺腺癌生存預(yù)后的關(guān)系。

1.4 RNA 提取和qRT-PCR

用TRIzol 試劑提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)cDNA，采用SYBR 熒光染料進(jìn)行qRT-PCR。標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin mRNA 的表達(dá)。TP53INP1 正義引物為5′-GCCTAAAGGCTACGGACTATTGC-3′，反義引物為5′-GGACCTAATCGAATGCTATTCAGA-3′；ERBB4 正義引物為5′-GTTGGCAGTCCAGCTA TGCAATAC-3′，反義引物為5′-CTATACGATACCTCCAACTAGGA-3′。實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)一式3份?；虮磉_(dá)的相對(duì)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.5 Western 印跡分析

將熱變性的蛋白樣品點(diǎn)至SDS-PAGE 膠中，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)到PVDF 膜，用5%脫脂牛奶封閉，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌后，與標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶的二抗孵育1 h，TBST 洗滌后向膜中加入化學(xué)顯色劑，反應(yīng)5 min，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像檢測(cè)。

1.6 螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

將含有miR-193a-3p 結(jié)合位點(diǎn)或突變位點(diǎn)的TP53INP1 或ERBB4 的3′UTR 全長(zhǎng)序列克隆到pGL3 載體，然后用100 nmol/L 的miR-4461 模擬物或NC 模擬物轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞24 h（NC 模擬物正義引物為5′-CGACUGGUACCAAUGAAC-3′，miR-193a-3p 模擬物正義引物為5′-GCAAUGAC AAGCUUACGAAGG-3′。螢光素酶相對(duì)活性統(tǒng)一化為海腎螢光素酶活性，用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑測(cè)定。

1.7 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

實(shí)驗(yàn)分為si-NC 組、si-ERBB4 組、si-ERBB4+miR-193a-3p 抑制劑組及si-ERBB4+oe-TP53INP1組，各組細(xì)胞以2×104/孔接種于96 孔板，每組3 個(gè)重復(fù)，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72 和96 h 后加入10 μL CCK-8，1 h 后在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的D450nm值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、D450nm值為縱坐標(biāo)細(xì)胞制增殖曲線。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

用GraphPad Prism 7 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，2 個(gè)獨(dú)立組均值間差異采用t檢驗(yàn)，3 組以上的組間比較采用方差分析法（One-Way ANOVA），組內(nèi)兩兩多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)

為了探究ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌中的表達(dá)，我們檢測(cè)了20 對(duì)肺腺癌組織和癌旁組織中ERBB4 和TP53INP1 的表達(dá)，還檢測(cè)了在肺腺癌細(xì)胞系SPC-A-1、H1299 和人類肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 中ERBB4 和TP53INP1 的表達(dá)。如圖1A、B 所示，腫瘤組織中ERBB4、TP53INP1 的表達(dá)均比在癌旁組織中低（均為P＜0.0001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖1C 所示，與人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B相比，SPC-A-1、H1299 細(xì)胞系ERBB4 和TP53INP1表達(dá)均顯著降低（均為P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示，ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌中表達(dá)均較低，且組織和細(xì)胞系具有一致性。

2.2 ERBB4/TP53INP1 的表達(dá)與肺腺癌預(yù)后相關(guān)

為了探究ERBB4/TP53INP1 表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系，我們應(yīng)用Kaplan-Meier Plotter 分析了ERBB4/TP53INP1 表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的相關(guān)性。如圖2 所示，肺腺癌組織中ERBB4/TP53INP1 高表達(dá)與整體生存期（overall survival，OS）良好顯著相關(guān)，ERBB4/TP53INP1 表達(dá)越高，肺腺癌的預(yù)后效果就越好，ERBB4 或TP53INP1 表達(dá)均可以作為肺腺癌患者整體生存率的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。同時(shí)這些結(jié)果也表明，ERBB4 和TP53INP1 可能在人類肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.3 ERBB4 與TP53INP1 的表達(dá)相關(guān)性分析

從上述肺腺癌組織和細(xì)胞中的ERBB4 和TP53INP1 表達(dá)結(jié)果，推測(cè)兩者在肺腺癌中的表達(dá)可能具有一定的相關(guān)性。為此我們做了進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果表明ERBB4 和TP53INP1 的mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（R2=0.7488，P＜0.0001）（圖3）。

圖1 ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平

圖2 ERBB4/TP53INP1 的表達(dá)與肺腺癌預(yù)后相關(guān)

2.4 ERBB4 沉默/過(guò)表達(dá)對(duì)TP53INP1 蛋白表達(dá)的影響

ERBB4 與TP53INP1 的mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)，那么ERBB4 蛋白表達(dá)的增減是否影響TP53INP1的蛋白表達(dá)量呢？通過(guò)Western 印跡檢測(cè)ERBB4沉默/過(guò)表達(dá)對(duì)TP53INP1 蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果如圖4，si-ERBB4 沉默表達(dá)，TP53INP1 的蛋白表達(dá)也明顯降低，而ERBB4 過(guò)表達(dá)時(shí)，TP53INP1 的蛋白表達(dá)量也明顯增加。該結(jié)果表明ERBB4 沉默或過(guò)表達(dá)也會(huì)影響TP53INP1 蛋白的表達(dá)。

2.5 ERBB4 通過(guò)靶向miR-193a-3p 調(diào)控TP53INP1的表達(dá)

圖3 ERBB4 與TP53INP1 的表達(dá)相關(guān)性分析

圖4 Western 印跡檢測(cè)ERBB4 沉默/過(guò)表達(dá)對(duì)TP53INP1 蛋白表達(dá)的影響

無(wú)論mRNA 還是蛋白表達(dá)，ERBB4 和TP53INP1 都呈現(xiàn)密切的相關(guān)性。為了探究其中的聯(lián)系，我們通過(guò)starBase 靶向預(yù)測(cè)了ERBB4 和TP53INP1 的3′UTR 均有miR-193a-3p 的結(jié)合位點(diǎn)，并采用肺腺癌細(xì)胞系H1299 進(jìn)行螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果（圖5）也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。過(guò)表達(dá)miR-193a-3p 抑制了ERBB4 和TP53INP1野生型3′UTR 螢光素酶活性（均為P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是對(duì)ERBB4 和TP53INP1 的突變型3′UTR 螢光素酶活性卻沒有影響。該結(jié)果提示ERBB4 可能通過(guò)靶向調(diào)控miR-193a-3p 來(lái)調(diào)節(jié)TP53INP1 的表達(dá)，三者構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.6 ERBB4-miR-193a-3p-TP53INP1 對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖的影響

我們進(jìn)一步探究了ERBB4、miR-193a-3p 和TP53INP1 三者之間的作用聯(lián)系。如圖6 所示，沉默ERBB4 后細(xì)胞增殖速率顯著增加，但聯(lián)合miR-193a-3p 抑制劑或過(guò)表達(dá)TP53INP1 后細(xì)胞增殖速率降低，說(shuō)明miR-193a-3p 抑制劑和過(guò)表達(dá)TP53INP1 能夠恢復(fù)由沉默ERBB4 造成的細(xì)胞增殖率增加，ERBB4 可通過(guò)miR-193a-3p/TP53INP1影響肺腺癌細(xì)胞增殖。

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因[11]；而肺腺癌是最常見的肺癌類型，占原發(fā)性肺癌的30%～35%[12]。因此，探究肺腺癌的分子發(fā)生機(jī)制，對(duì)診斷和治療肺癌有著十分重要的意義。ERBB4 在不同人類腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但ERBB4 對(duì)腫瘤的作用還存在爭(zhēng)議。有研究表明ERBB4 發(fā)揮促癌作用[3-7]，但也有研究表明ERBB4 在腫瘤中發(fā)揮著抑癌作用[8-10]。傳統(tǒng)上，ERBB4 作為細(xì)胞表面受體參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但有研究揭示了ERBB4 可以作為基因轉(zhuǎn)錄的輔助因子發(fā)揮作用，ERBB4 與配體結(jié)合后可分裂成多個(gè)片段并釋放胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域，然后胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域會(huì)移位到細(xì)胞核，作為共轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致基因表達(dá)的激活[5,13]。如ERBB4 的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致TP53INP1 的轉(zhuǎn)錄抑制[10]。我們知道，TP53INP1 是一種關(guān)鍵的腫瘤抑制因子，通過(guò)增強(qiáng)p53 功能，可以抑制腫瘤的發(fā)生[14]。所以，本研究的目的就是探究ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌中的表達(dá)及其作用關(guān)系。

圖5 螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)ERBB4 和TP53INP1 均為miR-193a-3p 的靶基因

圖6 ERBB4-miR-193a-3p-TP53INP1 軸對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖的影響

本研究結(jié)果顯示，ERBB4 與TP53INP1 在肺腺癌組織和細(xì)胞中均明顯低于正常對(duì)照，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)的關(guān)系，ERBB4 沉默或過(guò)表達(dá)使TP53INP1 的蛋白表達(dá)也相應(yīng)減少或增加。該結(jié)果預(yù)示著ERBB4 的表達(dá)與TP53INP1 的表達(dá)可能存在某種聯(lián)系。隨后我們通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件starBase 和螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ERBB4 和TP53INP1 均是miR-193a-3p 的靶基因，均受miR-193a-3p 的調(diào)控表達(dá)。Liang 等[15]也發(fā)現(xiàn)ERBB4 受miR-193a-3p 靶向調(diào)控。本結(jié)果表明ERBB4 通過(guò)靶向調(diào)控miR-193a-3p 來(lái)調(diào)節(jié)TP53INP1 的表達(dá)，三者構(gòu)成ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p 抑制劑和過(guò)表達(dá)TP53INP1 能夠緩解由沉默ERBB4 提高的細(xì)胞增殖，ERBB4 可以通過(guò)miR-193a-3p-TP53INP1 影響肺腺癌進(jìn)展。Kaplan-Meier 生存曲線結(jié)果顯示肺腺癌組織中ERBB4 和TP53INP1 均高表達(dá)，與OS 良好顯著相關(guān)，ERBB4/TP53INP1 表達(dá)越高，肺腺癌的預(yù)后效果就越好，ERBB4 或TP53INP1 表達(dá)均可以作為肺腺癌患者整體生存率的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。

綜上所述，ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌組織或細(xì)胞中均低表達(dá)，2 個(gè)基因的表達(dá)呈正相關(guān)，ERBB4通過(guò)靶向調(diào)控miR-193a-3p 來(lái)調(diào)節(jié)TP53INP1 的表達(dá)，且ERBB4 和TP53INP1 表達(dá)越高，肺腺癌的預(yù)后效果就越好。ERBB4 或TP53INP1 表達(dá)可以作為肺腺癌患者預(yù)后指標(biāo)。