阮 鵬 譚愛麗

鼻咽癌是我國發(fā)病率較高的頭頸部惡性腫瘤之一，在我國南方部分地區(qū)，鼻咽癌的發(fā)病率高達20/10萬[1]。鼻咽癌起源于鼻咽的黏膜上皮，因腫瘤原發(fā)灶的特殊解剖結構，病理上多表現(xiàn)為低分化腫瘤，具有極強的侵襲性，大多數(shù)鼻咽癌患者確診時多處于腫瘤晚期階段[2]。近年來隨著影像學診斷的進步、放療和化療方案的更新，鼻咽癌的治愈率得到提高，但復發(fā)轉移的發(fā)生仍是治療失敗的主要原因[3]。此外，即使是同一TNM分期的患者，在化療療效和預后上仍存在較大的差異[4]。因此如何有效預測鼻咽癌患者的化療效果和生存預后，對制定鼻咽癌患者的個性化治療方案具有重要的指導價值。

微小RNA(micro RNA，miRNA)是一類長度僅為18～22個核苷酸的小非編碼RNA，在轉錄后水平調節(jié)基因表達，參與腫瘤細胞增殖、分化、凋亡和轉移侵襲等過程[5]。同時腫瘤細胞可釋放miRNA入外周血，而外周血中的miRNA穩(wěn)定性較強，作為新興生物學標志物方面具有重要的臨床價值。有研究發(fā)現(xiàn)miR-127、miR-144、miR-149、miR-155和miR-18a在鼻咽癌中顯著上調，但它們在血清中的表達量及對患者化療抗性的預測價值尚不清楚[6-7]。因此本研究主要評估血清中miR-127、miR-144、miR-149、miR-155和miR-18a對預測鼻咽癌患者化療療效和遠期生存預后的臨床價值。

1 資料和方法

1.1 研究對象

本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過，并經(jīng)患者及其家屬簽署知情同意書。連續(xù)性納入2010年1月—2016年12月在武漢大學人民醫(yī)院確診并接受治療的鼻咽癌患者。納入標準：(1)年齡大于18周歲；(2)經(jīng)組織病理學診斷確診為鼻咽癌；(3)接受以順鉑為基礎的一線化療方案；(4)行為狀態(tài)評分(Karnofsky performance status，KPS)在60分以上；(5)肝腎功能正常。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并感染性或其他炎癥性疾??；(3)隨訪資料不詳。共納入187例鼻咽癌患者，其中男134例，女53例，年齡23～76歲(平均45.7±12.6歲)。同時納入60例健康體檢人群作為對照。

1.2 臨床資料收集

通過病史系統(tǒng)收集患者的人口統(tǒng)計學資料和臨床病理學特征，包括性別、年齡、KPS評分、腫瘤病理診斷、化療方案等。還包括各項實驗室檢查和血清EV病毒抗體水平，包括EA/IgA和VCA/IgA。

1.3 化療方案

入組的患者均接受以順鉑為基礎的化療方案。187例患者中，97例接受PF方案：順鉑(25 mg/m2，iv，d1-3)和5-氟尿嘧啶(500 mg/m2，iv，d1-5)，每3周進行一次；56例接受TP方案：順鉑(25 mg/m2，iv，d1-3)和紫杉醇(175 mg/m2，iv，d1)，每3周進行一次；余34例接受其他治療方案?；熤芷诘闹形粩?shù)為4(范圍2～12)。

1.4 血清miRNA檢測

1.4.1 血液樣本中循環(huán)miRNA提取 鼻咽癌患者入院后在初次化療前空腹采血，對照組人群于體檢當天清晨空腹采血，置于EDTA抗凝管中，靜置30 min后，2000 r/min離心5 min，分離上層血清，置于-80℃冰箱中儲存。通過miRNeasy mini kit外周血RNA提取試劑盒提取500 μL血清中的miRNA，并最終以20 μL的DEPC水洗脫，Nanodrop 2000測定RNA吸光度A260/A280介于1.8～2.0之間者可用于逆轉錄反應。

1.4.2 逆轉錄和實時熒光定量PCR 調整RNA濃度值500 ng/μL用于逆轉錄成cDNA，反應體系：2×miScript II RT Mix 10 μL+2 μL RNA+8 μL DEPC水，共20 μL；反應條件：45℃ 30 min，85℃10 min。實時熒光定量PCR檢測6種miRNA，包括miR-127、miR-144、miR-149、miR-155和miR-18a，使用U6 snRNA作為內參。引物序列見表1。所有反應都設3復孔和空白對照，反應體系：2×SYBR Green Master Mix 10 μL+前/后引物混合物(5 μmol/L)1 μL+cDNA 1 μL+DEPC水 8 μL，共20 μL，反應條件：94℃ 2 min，40個PCR循環(huán)(94℃ 15 s，62℃ 30 s)。擴增產物量達到臨界閾值時所對應的循環(huán)數(shù)為Ct值，△Ct則為每個樣品的待測miRNA的Ct值與內參U6 snRNA的Ct值的差值，并以2-△△Ct作為循環(huán)miRNA的相對表達水平。

1.5 化療效果評估

化療結束后，根據(jù)實體瘤療效評價標準(RECIST 1.0)評估治療反應[8]，包括完全緩解(Complete response，CR)、部分緩解(Partial response，PR)、疾病穩(wěn)定(Stable disease，SD)和疾病進展(Progressive disease，PD)，其中CR和PR定義為化療敏感組(123例)，SD和PD定義為化療抵抗組(64例)。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 鼻咽癌化療敏感與抵抗患者的臨床資料比較

與化療敏感組相比，化療抵抗組T3-4期比例、N3期比例、TNM Ⅲ～Ⅳ期比例更高，差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但年齡、性別、EA/IgA滴度、VCA/IgA滴度無統(tǒng)計學差異(表2)。

表1 熒光定量PCR引物序列

表2 敏感與抵抗患者的臨床資料比較[n(%)]

2.2 血清miRNA水平比較

鼻咽癌患者血清miR-127水平顯著高于健康對照組(4.3±1.6vs. 1.4±0.5，P<0.001)，但其它血清miRNA在兩組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖1)。亞組分析發(fā)現(xiàn)，化療抵抗組患者的血清miR-127水平顯著高于化療敏感組患者(4.5±1.3vs. 3.8±1.7，P<0.001)。

2.3 血清miR-127對化療抵抗的預測價值和閾值

通過ROC曲線分析顯示，血清miR-127對鼻咽癌患者化療抵抗價值較高(AUC=0.702，P<0.001)，血清miR-127對化療抵抗的預測閾值為4.2，靈敏度82.3%，特異度76.3%(圖2)。

圖1 鼻咽癌患者與健康人群的血清miRNA比較

2.4 血清miR-127與化療反應性的關系

化療抵抗組血清miR-127≥4.2比例顯著高于化療敏感組(78.1%vs. 30.1%，P<0.001)(表3)。

2.5 鼻咽癌患者化療抵抗的影響因素分析

將表1中存在統(tǒng)計學差異的參數(shù)以及血清miR-127水平納入多因素Logistics回歸分析中，結果顯示，TNM分期(OR=1.655，95%CI：1.142～2.584，P=0.016)和血清miR-127≥4.2(OR=2.231，95%CI：1.762～4.503，P=0.001)是影響鼻咽癌患者化療抵抗的獨立危險因素(表4)。

圖2 血清miR-127水平預測化療抵抗的ROC曲線分析

表3 血清miR-127與化療反應性相關性[n(%)]

表4 影響鼻咽癌患者化療抵抗的多因素分析

3 討論

鼻咽癌化療抵抗是多種遺傳因素導致的復雜且多步驟過程，如抗凋亡基因的上調、抑癌基因的下調和藥物代謝基因的改變等[9]。因此研究影響鼻咽癌化療抵抗的分子機制和尋找化療敏感性標志物是目前臨床上備受關注的問題。目前主要通過血液標志物、免疫組織化學檢查等評估鼻咽癌患者的生存預后，但針對化療抗性的標志物研究較少。

miRNA是一類高度非編碼的小RNA分子，可結合到目標mRNA的3′非編碼區(qū)以調節(jié)目標mRNA的降解，從而抑制蛋白的表達。近年來的研究表明miRNA可作為促癌基因或抑癌基因而對腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移和耐藥能力具有調控作用[10]。而在鼻咽癌中，miRNA也參與了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展及耐藥，并可作為標志物對鼻咽癌進行分子分型[11]。但如何通過miRNA的檢測來判斷鼻咽癌患者的化療抗性是目前研究的熱點。

miR-127位于第14號常染色體q32.2區(qū)域內，在多種惡性腫瘤中表達上調，包括鼻咽癌、胃癌、肺癌等[12-13]。miR-127能夠激活NFκB-TNFα信號通路而促進腫瘤細胞的上皮間質轉化，從而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和化療耐藥。此外，miR-127還能夠直接抑制抑癌基因SEPT7和BCL6的蛋白表達，從而促進腫瘤細胞的增殖和侵襲[14-15]。腫瘤細胞可分泌miRNA至外周血中，血清中的miRNA水平可作為一種理想的腫瘤標志物[16]。Lu等[17]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清內miR-127水平顯著上調，并且上調的miR-127能夠提高對乳腺癌的診斷準確性；You等[18]則發(fā)現(xiàn)血清miR-127的上調能夠有效鑒別宮頸癌，并且與宮頸癌患者的遠期生存預后不良密切相關。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)了鼻咽癌患者血清中miR-127水平顯著高于正常人群，并且升高的miR-127與鼻咽癌患者的化療抵抗密切相關。通過ROC曲線分析證實血清中miR-127≥4.2是預測鼻咽癌患者化療抵抗的最佳閾值，進一步通過多因素回歸分析確定血清miR-127水平升高是預測鼻咽癌化療抵抗的獨立危險因素，提示了血清miR-127水平可作為有效預測鼻咽癌患者化療抗性的有效標志物。

綜上所述，本研究證實鼻咽癌患者的血清miR-127水平顯著上調，與鼻咽癌患者化療抵抗密切相關，是預測鼻咽癌患者化療抵抗的獨立危險因素。但由于本研究僅為單中心、小樣本回顧性研究，因此仍需要擴大樣本量來進一步證實本研究，并將血清miR-127檢測應用于臨床實踐中。