孫亦鵬 倪振華 吳穎穎 陳清閣 畢俊杰 林玉華 王雄彪

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康，而化療藥物耐藥是臨床治療肺癌療效不佳的關鍵問題[1]。因此，尋找耐藥基因、研究其潛在的機制，進而靶向治療是一種合理的思路方法。唇腭裂跨膜蛋白1樣蛋白(Cleft lip and palate transmembrane 1 like，CLPTM1L)與耐藥密切相關。該基因最初是在篩查順鉑耐藥相關基因時發(fā)現(xiàn)的，因此又稱為CRR9(Cisplatin resistance related protein，CRR9)，其在順鉑耐藥的卵巢癌細胞中表達上調(diào)[2]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CLPTM1L在肺癌中的表達顯著增加，并且其表達量與肺癌細胞對順鉑和喜樹堿的敏感性相關[3-4]。吉西他濱是治療肺癌的一線化療藥物，常用于聯(lián)合鉑類等抗癌藥物治療肺癌，臨床療效顯著。為此本研究以肺癌細胞95-D為研究對象，觀察CLPTMIL基因表達變化與肺癌細胞吉西他濱敏感性的關系，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Invitrogen公司；Caspase-3/7和Caspase-9活性檢測試劑盒購自Promega公司；CCK-8試劑購自同仁化學公司；蛋白裂解液購自Thermo公司；CLPTM1L抗體購自Novus、Santa公司；p-4E-BP1抗體、β-actin抗體購自CST公司；吉西他濱購自Selleck公司；肺癌95-D細胞購自中科院細胞所。

1.2 實驗方法

1.2.1 肺癌細胞95-D培養(yǎng) 人95-D肺癌細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，隔天換液。

1.2.2 CLPTM1L基因過表達慢病毒制備及感染 由上海吉凱公司克隆CLPTM1L基因的編碼區(qū)序列，構(gòu)建病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞，制備慢病毒顆粒。培養(yǎng)95-D細胞至對數(shù)生長期接種于24孔板，每孔5×104個細胞，在polybrene(濃度5 mg/L)存在的條件下分別以感染復數(shù)(MOI)=100的慢病毒感染細胞，感染72 h后收集細胞，通過有限稀釋法篩選單克隆，以成功感染的單克隆細胞為CLPTM1L過表達組，以正常95-D細胞為對照組。

1.2.3 熒光定量PCR檢測CLPTM1L mRNA表達水平 采用Trizol提取細胞總RNA，按照SuperScript III試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Roche熒光定量PCR試劑盒檢測CLPTM1L mRNA表達水平，反應條件為：94℃ 10 min，94℃ 30 s，60℃ 1 min，共40個循環(huán)，以GAPDH基因作為內(nèi)參，引物序列見表1。

1.2.4 免疫細胞化學法檢測CLPTM1L蛋白表達 收集95-D CLPTM1L過表達組和對照組細胞，以每孔7 000個細胞接種于96孔板中，細胞培養(yǎng)過夜后吸棄孔內(nèi)上清液，加入4%多聚甲醛固定10 min，然后用含0.1% Triton X-100的PBS溶液清洗3次，加入CLPM1L抗體4℃孵育過夜，之后用含0.1% Triton X-100的PBS溶液清洗3次，加入熒光二抗于37℃溫箱放置1 h，加入DAPI進行核染色，最后在熒光顯微鏡下觀察。

表1 引物序列表

1.2.5 CCK-8檢測細胞增殖 收集95-D CLPTM1L過表達組和對照組細胞，以每孔7 000個細胞接種于96孔板中。細胞培養(yǎng)過夜后，分別加入不同濃度吉西他濱(0 nM、2.5 nM、5 nM和10 nM)處理細胞48 h，之后吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，選擇450 nm波長在酶標儀上測定各孔吸光光度值。

1.2.6 Caspase-3/7和Caspase-9活性檢測 收集95-D CLPTM1L過表達組和對照組細胞，以每孔7 000個細胞接種于96孔板中。細胞培養(yǎng)過夜后，分別加入不同濃度吉西他濱(0 nM、2.5 nM、5 nM和10 nM)處理細胞48 h，每孔加入100 μL Caspase-3/7或Caspase-9底物，混合孵育3 h后采用Promega GloMax 20/20發(fā)光檢測儀檢測各孔吸光光度值。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達變化 取等量蛋白樣本進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST+5%BSA封閉液封閉2 h。將膜分別與CLPTM1L、p-4E-BP1、β-actin一抗4℃孵育過夜，然后TBST洗滌3次，每次10 min，之后加入HRP標記的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗，室溫孵育2 h。用TBST洗膜3次，每次10 min，最后加入ECL發(fā)光液，于Bio-Rad化學發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 CLPTM1L過表達細胞株構(gòu)建

用CLPTM1L過表達慢病毒感染肺癌95-D細胞，將細胞分為CLPTM1L過表達組和對照組。熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，CLPTM1L過表達組CLPTM1L mRNA(12.42±6.40，P=0.036)顯著增高；Western blot和細胞免疫熒光結(jié)果顯示，過表達組CLPTM1L蛋白高于對照組(P<0.01)(圖1)。

圖1 慢病毒感染95-D后CLPTM1L mRNA和蛋白表達變化

2.2 CLPTM1L過表達對吉西他濱抑制95-D細胞增殖的影響

CCK-8細胞增殖實驗顯示，在對照組內(nèi)，與吉西他濱0 nM組相比，2.5、5和10 nM組的細胞增殖能力顯著降低(P<0.01)；與對照組相比，CLPTM1L過表達組的細胞增殖能力顯著升高(P<0.01)(圖2)。說明CLPTM1L過表達后抑制了吉西他濱對肺癌細胞的殺傷作用。

圖2 吉西他濱處理CLPTM1L過表達組和對照組細胞后細胞增殖的變化

2.3 CLPTM1L過表達對吉西他濱激活95-D細胞內(nèi)Caspase-3/7和Caspase-9的影響

本研究檢測了吉西他濱作用于CLPTM1L過表達組和對照組后細胞內(nèi)Caspase-3/7和Caspase-9的激活情況。結(jié)果顯示，在對照組內(nèi)，與0 nM組相比，吉西他濱2.5、5、10 nM組的Caspase-3/7和Caspase-9活性顯著增高(P<0.01)；與對照組相比，CLPTM1L過表達組的Caspase-3/7和Caspase-9活性顯著降低(P<0.01)(圖3)。說明CLPTM1L過表達后抑制了吉西他濱誘導肺癌細胞凋亡的作用。

2.4 CLPTM1L過表達對p-4E-BP1的影響

研究表明，真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(Eukaryotic translation initiation factor 4E(eIF4E)-binding protein 1，4E-BP1)在肺癌細胞中高表達，可抑制腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[5]。因此本研究檢測了CLPTM1L過表達組和對照組細胞內(nèi)4E-BP1的磷酸化狀態(tài)，結(jié)果顯示，與對照組相比，CLPTM1L過表達組p-4E-BP1表達水平顯著升高(3.41±0.22，P<0.01)(圖4)。

圖3 吉西他濱敏作用于CLPTM1L過表達組和對照組后細胞內(nèi)Caspase-3/7和Caspase-9活性的變化

圖4 CLPTM1L過表達對p-4E-BP1的影響

3 討論

CLPTM1L基因位于人染色體5p15.33，其與肺癌的關系最初是在肺癌的全基因組關聯(lián)分析(Genome wide association study，GWAS)中發(fā)現(xiàn)的。2008年McKay等[6]報道了一項關于肺癌的GWAS研究，他們的研究結(jié)果指出5p15.33區(qū)域上的rs402710位點(CLPTM1L基因第9內(nèi)含子)是肺癌的易感位點，可顯著增加肺癌的發(fā)病風險。同時英國的學者發(fā)現(xiàn)CLPTM1L基因內(nèi)另一位點rs401681的多態(tài)性與肺癌發(fā)病相關[7]。國內(nèi)學者也證實在中國人中CLPTM1L是肺癌預后不良的標志物[8-10]。之后越來越多的報道揭示CLPTM1L是一個重要的肺癌易感基因[11]。然而，盡管已經(jīng)證實CLPTM1L與肺癌密切相關，但是關于CLPTMIL的功能研究并不多。最初被發(fā)現(xiàn)時報道CLPTM1L與卵巢癌中順鉑耐藥有關[2]。Ni等[3]研究發(fā)現(xiàn)CLPTM1L的表達水平與肺癌細胞對順鉑的敏感性相關。近年來，Clarke等[12]也發(fā)現(xiàn)CLPTM1L的高表達可導致胰腺癌細胞對化療藥耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)，CLPTM1L過表達可逆轉(zhuǎn)吉西他濱對肺癌細胞增殖的抑制、抑制吉西他濱誘導細胞凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的激活。因此過表達CLPTM1L可降低95-D肺癌細胞對吉西他濱的敏感性，而影響癌細胞對抗癌藥物敏感性很可能就是CLPTM1L基因的主要功能。

對CLPTM1L調(diào)節(jié)腫瘤耐藥機制的深入探究可使得靶向CLPTM1L的藥物開發(fā)、進而為臨床服務成為可能。近年來，4E-BP1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和化療藥耐藥中的重要作用日益受到關注。在非小細胞肺癌中，4E-BP1的高磷酸化均與高侵襲性、低生存率顯著相關[13]。Roh等[14]亦發(fā)現(xiàn)p-4E-BP1在小細胞肺癌組織中高表達，并且其與胞質(zhì)p-AKT可作為肺癌不良預后的重要指標。4E-BP1還是PI3K/Akt/mTOR通路下游的靶分子之一，而AKT/mTOR的異常激活是一種重要的致癌機制[16]。此外，4E-BP1與腫瘤細胞的藥物敏感性關系密切。在前列腺癌細胞中，4E-BP1低表達的細胞對藥物MLN0128(mTOR抑制劑)更敏感，而在耐藥的前列腺癌細胞中下調(diào)4E-BP1的表達可增加細胞對MLN0128的敏感性；抑制4E-BP1表達增加了細胞對雷帕霉素的敏感性[17]。進一步研究顯示，4E-BP1與翻譯起始因子eIF4E的結(jié)合是4E-BP1介導腫瘤藥物敏感性的重要機制。4E-BP1低磷酸化時與eIF4E緊密結(jié)合，4E-BP1磷酸化增高可使其與eIF4E解離，從而促進蛋白的翻譯。在肺癌細胞中，敲低eIF4E可減少帽依賴性復合物形成，從而增加癌細胞對吉西他濱的敏感性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達CLPTM1L后顯著增加了4E-BP1的磷酸化，表明CLPTM1L抑制肺癌細胞對吉西他濱的敏感性很可能是通過增加4E-BP1的磷酸化，降低其與eIF4E結(jié)合實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)過表達CLPTM1L可抑制95-D肺癌細胞對吉西他濱的敏感性。CLPTM1L過表達可逆轉(zhuǎn)吉西他濱對肺癌細胞的增殖的抑制、抑制吉西他濱誘導肺癌細胞的凋亡，其機制可能是促進了4E-BP1的磷酸化水平。