汪文祥 儲(chǔ) 文 梅德圣 成洪濤 朱琳琳 付 麗 胡 瓊 劉 佳,*

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基于SNP遺傳圖譜定位甘藍(lán)型油菜分枝角度QTL

汪文祥1儲(chǔ) 文1梅德圣1成洪濤1朱琳琳2付 麗1胡 瓊1劉 佳1,*

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430062;2南漳縣植保站, 湖北襄陽(yáng) 441500

分枝角度是油菜株型的重要性狀, 與油菜的耐密植性密切相關(guān)。本研究利用油菜分枝角差異顯著的育種親本材料1098B (分枝角小)和R2 (分枝角大)雜交獲得F1, 通過(guò)小孢子培養(yǎng)獲得含163份株系的DH群體。以油菜60K SNP芯片進(jìn)行DH群體基因分型, 構(gòu)建高密度遺傳圖譜, 并利用QTL Cartographer 2.5對(duì)2個(gè)環(huán)境下油菜頂端分枝角和基部分枝角進(jìn)行QTL分析。結(jié)果表明, 構(gòu)建的高密度遺傳圖譜覆蓋甘藍(lán)型油菜19條染色體, 包含9521個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記, 1442個(gè)簇(bin), 覆蓋基因組長(zhǎng)度為2544.07 cM, 相鄰簇(bin)之間平均距離為1.76 cM。在此圖譜基礎(chǔ)上采用復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM), 在2個(gè)環(huán)境下檢測(cè)到17個(gè)分枝角度QTL, 分別位于A01、A02、A03、A06、A09、C02、C03、C04、C06和C08染色體上, 單個(gè)QTL解釋的表型變異為6.39%~21.78%。用比較基因組方法與擬南芥分枝角度同源基因區(qū)間比對(duì), 鑒定出其中6個(gè)QTL的12個(gè)候選基因。其中位于A03連鎖群QTL在2年的試驗(yàn)中被重復(fù)檢測(cè)到, 根據(jù)物理位置和基因組信息推測(cè)為分枝角度的候選基因。這些QTL和候選基因?qū)橛筒朔种嵌鹊倪z傳改良提供有用的信息。

甘藍(lán)型油菜; 分枝角度; 60K SNP芯片; QTL位點(diǎn); 候選基因

油菜是我國(guó)重要的油料作物, 每年提供450萬(wàn)噸左右食用油, 占全國(guó)植物油總產(chǎn)的40%以上[1]?，F(xiàn)階段, 油菜單產(chǎn)水平低和機(jī)械化生產(chǎn)普及率不高是限制我國(guó)油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的兩大瓶頸。為增加單產(chǎn)、提高油菜機(jī)械化生產(chǎn)效率, 改良現(xiàn)有品種的株型、提高油菜的種植密度是一條有效途徑。改良油菜株型不僅可以促進(jìn)光能和肥料利用率, 提高品種高密度耐性, 降低病害, 增加群體產(chǎn)量[2], 還有利于增強(qiáng)抗倒性和機(jī)械化生產(chǎn), 通過(guò)資源高效化利用實(shí)現(xiàn)低耗高產(chǎn)[3]。

隨著甘藍(lán)型油菜全基因組測(cè)序的完成[4-5]、高通量SNP芯片技術(shù)的完善和分析成本的下降, 油菜60K SNP芯片分型分析成為油菜遺傳研究的重要工具[6-11]。近幾年, 利用油菜60K SNP芯片對(duì)油菜產(chǎn)量及品質(zhì)等性狀的遺傳定位做了大量的研究[12-14]。Liu等[6]利用油菜芯片對(duì)RIL群體進(jìn)行分型, 對(duì)種子顏色、木質(zhì)素、纖維素和半纖維素等性狀進(jìn)行QTL定位。Sun等[15]利用520份油菜資源群體對(duì)株高性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 鑒定到68個(gè)顯著的SNP位點(diǎn), 超過(guò)70%的位點(diǎn)與已發(fā)表的9個(gè)遺傳群體中重合。Fu等[16]利用DH群體和永久F2群體對(duì)角果長(zhǎng)和千粒重性狀進(jìn)行聯(lián)合QTL分析, 將A9染色體的角果長(zhǎng)和千粒重區(qū)間縮小到1.14 Mb內(nèi)。油菜SNP芯片技術(shù)的利用, 提高了遺傳圖譜構(gòu)建精密度, 為油菜數(shù)量性狀的研究提供更方便、快捷的途徑。

油菜分枝角度是構(gòu)建理想株型的重要因素, 緊湊型株型有利于密植, 有利于提高群體的產(chǎn)量和抗倒伏性, 減少病害[17-24]。Liu等[18]最早利用143份自然群體對(duì)分枝角度進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 獲得6個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的基因組區(qū)域, 鑒定出其中4個(gè)區(qū)域內(nèi)候選基因。Sun等[19]利用520份自然群體進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 共獲得52個(gè)分枝角度相關(guān)位點(diǎn), 總共可解釋表型變異的51.1%, 并對(duì)52個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了候選基因分析。Wang等[20]利用分枝角差異顯著親本構(gòu)建F2群體, 鑒定F2代所有單株的分枝角表型, 挑選極端單株進(jìn)行混池, 利用BSA-seq方法確定A6染色體定位區(qū)間內(nèi)生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因?yàn)楹蜻x基因。Shen等[22]利用包含208個(gè)系的DH群體定位了17個(gè)油菜分枝角度QTL, 3個(gè)主效的QTL各能解釋約10%表型變異, 并在QTL區(qū)間獲得27個(gè)候選基因。上述研究表明, 油菜分枝角度受多基因控制, 油菜分枝角度性狀的遺傳解析對(duì)油菜品種的遺傳改良具有重要意義。

本研究利用油菜60K SNP芯片構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜, 對(duì)不同部位油菜分枝角度性狀進(jìn)行QTL定位分析。收集整理前人研究油菜分枝角度基因信息, 并利用甘藍(lán)型油菜基因組序列, 根據(jù)QTL區(qū)間物理位置及擬南芥功能基因組信息篩選可能的候選基因, 為明確關(guān)鍵QTL和克隆候選基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以分枝角度小的甘藍(lán)型油菜品系1019B和分枝角度大的R2為親本, 手工配置F1, 通過(guò)小孢子培養(yǎng)獲得DH群體。選取其中163個(gè)DH系進(jìn)行SNP標(biāo)記分型, 用以構(gòu)建高密度SNP遺傳連鎖圖譜。所有材料均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供及保存。

1.2 田間試驗(yàn)

2013年9月與2014年9月, 將親本及DH系群體種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所陽(yáng)邏試驗(yàn)基地, 分別記錄為WH2014和WH2015。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)2個(gè)重復(fù), 每個(gè)小區(qū)3行, 每行18株, 行距0.33 m,株距0.10 m。田間管理同常規(guī)生產(chǎn), 確保所有樣本的外部生長(zhǎng)環(huán)境一致, 待成熟后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.3 性狀考察

油菜成熟后, 從每個(gè)株系選取正常生長(zhǎng)的5株, 剪取連有油菜上部第一分枝(頂枝)和基部第一分枝(基枝)的莖段, 通過(guò)數(shù)字圖像采集法[17]獲取頂端分枝角和基部分枝角圖像文件, 將其導(dǎo)入AutoCAD軟件, 利用角度工具標(biāo)注角度, 記錄到Microsoft Excel文檔中。

1.4 遺傳連鎖圖譜及QTL分析

利用油菜60K Illumina InfiniumSNP芯片對(duì)親本(1019B和R2)及DH群體進(jìn)行SNP基因分型。采用GenomeStudio (Illumina公司)軟件分析SNP基因型, 排除低于0.05的最小基因型頻率(minor allele frequency, MAF), SNP得率(call frequency)小于80%, 篩選在親本間具有多態(tài)性的標(biāo)記, 利用SNP芯片序列信息和法國(guó)公布的甘藍(lán)型油菜品種“”的基因組序列信息進(jìn)行BlastN比對(duì), E-value閾值為1×10–15, 獲得唯一位置的SNP標(biāo)記信息, 最終獲得9521個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記用于后續(xù)分析。

利用MSTmap軟件[25]和JoinMap 4.0軟件[26]構(gòu)建遺傳圖譜, 通過(guò)兩兩標(biāo)記之間最小重組頻率計(jì)算每個(gè)連鎖群上標(biāo)記順序, 構(gòu)建高密度bin-map遺傳圖譜。利用Windows QTL Cartographer 2.5軟件[27]中復(fù)合區(qū)間作圖(Composite Interval Mapping, CIM)法對(duì)2個(gè)環(huán)境下基部分枝角和頂端分枝角進(jìn)行單環(huán)境QTL檢測(cè)。運(yùn)行CIM時(shí), 選用1 cM的步長(zhǎng)(walking speed), 同時(shí)設(shè)置5個(gè)標(biāo)記作為余因子, 采用模型6, 對(duì)每個(gè)性狀分別進(jìn)行1000次排列測(cè)驗(yàn)(permutation test), 顯著水平0.05來(lái)判斷是否存在QTL。運(yùn)行結(jié)果同時(shí)給出性狀QTL的加性效應(yīng)和表型貢獻(xiàn)率。以q加頂端分枝角度英文縮寫“頂端分”或基部分枝角度英文縮寫“基部分”, 再加上染色體編號(hào)及QTL序號(hào)命名QTL。在染色體相同的位置重復(fù)的QTL, 且加性效應(yīng)方向一致, 認(rèn)為是同一QTL。采用MapChart 2.3[28]繪制QTL定位遺傳連鎖圖。

1.5 候選基因篩選

為了篩選出分枝角度相關(guān)的候選基因, 基于油菜基因組和擬南芥基因組序列進(jìn)化的同源性[29], 在甘藍(lán)型油菜基因組[4]上查詢檢測(cè)到的QTL置信區(qū)間對(duì)應(yīng)的序列, 然后與Liu等[15]、Sun等[25]、Li等[21]和Shen等[22]搜索出的擬南芥分枝角度相關(guān)基因進(jìn)行BlastN比對(duì), 將E值設(shè)定為1×10–20, 最后篩選出每個(gè)QTL置信區(qū)間內(nèi)匹配E值小于閾值的候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙親及DH群體分枝角度表型變異

在兩年的環(huán)境中, 2個(gè)親本的頂端分枝角和基部分枝角差異均極顯著(表1)。1019B頂端分枝角和基部分枝角均較小, R2頂端分枝角和基部分枝角均較大。DH群體頂端分枝角和基部分枝角均呈連續(xù)性分布, 其中一些株系表現(xiàn)出明顯的超親分離現(xiàn)象, 平均變異幅度分別為22.98°~63.99°和20.76°~50.22° (圖1),平均值介于兩親本之間; 頂端分枝角和基部分枝角的變異系數(shù)都大于10, 說(shuō)明頂端分枝角和基部分枝角都具有較大的改良潛力。

相關(guān)性分析表明, 在2014年和2015年的2個(gè)環(huán)境中頂端分枝角和基部分枝角表現(xiàn)均呈極顯著正相關(guān)(表2), 相關(guān)系數(shù)分別為0.362和0.411, 說(shuō)明油菜分枝角性狀遺傳穩(wěn)定, 但受一定環(huán)境影響。在2個(gè)生長(zhǎng)周期里, 頂端分枝角和基部分枝角呈極顯著正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)分別為0.542和0.586, 說(shuō)明油菜頂端分枝角和基部分枝角相關(guān)性較強(qiáng), 具有一致性。

表1 親本及DH群體分枝角度性狀兩年的表型分析

BBA: 基部分枝角; TBA: 頂端分枝角。BBA: basal branch angle; TBA: top branch angle.

圖1 油菜1019B×R2 DH群體分枝角度性狀(BBA和TBA)兩年的頻率分布圖

表2 在2014年和2015年甘藍(lán)型油菜DH群體分枝角度性狀的相關(guān)系數(shù)

BBA: 基部分枝角; TBA: 頂端分枝角。**代表在0.01顯著水平。

BBA: basal branch angle; TBA: top branch angle.**denote significant correlation at the 0.01 probability level.

2.2 高密度遺傳圖構(gòu)建

利用油菜SNP芯片, 檢測(cè)DH群體的基因型, 共得到9521個(gè)高質(zhì)量多態(tài)性SNP標(biāo)記?；谶@些SNP標(biāo)記, 利用MSTmap軟件構(gòu)建DH群體的重組區(qū)塊圖譜共得到1442個(gè)Bin, 并利用這些Bin構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜總長(zhǎng)度為2544.07 cM, 標(biāo)記間的平均距離1.76 cM, 標(biāo)記間最大距離為30.59 cM, 最小距離0.06 cM; 其中A10染色體上標(biāo)記間的平均遺傳距離最小(1.03 cM), C09染色體上標(biāo)記間平均遺傳距離最大(3.73 cM)(圖2)。

圖2 SNP標(biāo)記簇在連鎖群上分布圖

縱坐標(biāo)顯示甘藍(lán)型油菜基因組19個(gè)連鎖群中的每一個(gè)SNP簇的遺傳距離。

The ordinate shows the genetic distance along each of the 19 linkage groups corresponding togenome.

2.3 油菜分枝角度QTL分析

利用軟件Windows QTL Cartographer 2.5對(duì)頂端分枝角和基部分枝角性狀進(jìn)行QTL分析, 共檢測(cè)到17個(gè)QTL, 分布于A01、A02、A03、A06、A09、C02、C03、C04、C06和C08染色體上, 單個(gè)QTL可解釋的表型變異為6.39%~21.78% (表3和圖3)。其中檢測(cè)到6個(gè)基部分枝角QTL, 單個(gè)QTL解釋的表型變異為8.07%~15.10%; 檢測(cè)到11個(gè)頂端分枝角QTL, 單個(gè)QTL解釋的表型變異為6.39%~21.78%。在2年內(nèi)重復(fù)檢測(cè)到基部分枝角性狀顯著效應(yīng)的QTL和, 與在一個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到的頂端分枝角性狀QTL ()在同一個(gè)置信區(qū)間, 在3個(gè)環(huán)境中解釋的表型變異為8.28%~11.79%, 加性效應(yīng)值為1.74~2.03。另外, 在同一環(huán)境中檢測(cè)到頂端分枝角和基部分枝角共同的QTL (和), 解釋表型變異8.78%~8.85%。

表3 2個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到的頂端分枝角和基部分枝角QTL

BBA: 基部分枝角; TBA: 頂端分枝角。BBA: basal branch angle; TBA: top branch angle.

2.4 分枝角度候選基因篩選

將17個(gè)QTL置信區(qū)間序列與前人報(bào)道的181個(gè)分枝角度相關(guān)基因分別比對(duì), 在其中6個(gè)QTL區(qū)間內(nèi)檢測(cè)到12個(gè)候選基因。在兩年均檢測(cè)到的QTL (、和)置信區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因, 其物理位置離整合后的QTL峰值非常近, 該基因也存在于Sun等[19]定位的分枝角度QTL區(qū)間內(nèi)。在基部分枝角度QTL (置信區(qū)間內(nèi)篩選到生長(zhǎng)素相關(guān)的基因; 在頂端分枝角度2個(gè)QTL (和置信區(qū)間內(nèi)分別篩選出2個(gè)分枝角度候選基因。另外, 在頂端分枝角度QTL (置信區(qū)間內(nèi)篩選到4個(gè)生長(zhǎng)素相關(guān)候選基因; 與控制水稻分蘗角基因同源的基因也在頂端分枝角的QTL ()區(qū)間內(nèi)檢測(cè)到(表4)。

3 討論

株型緊湊和抗倒伏是實(shí)現(xiàn)油菜全程機(jī)械化栽培的重要性狀。本研究通過(guò)高通量SNP標(biāo)記構(gòu)建高密度遺傳圖譜, 鑒定獲得了油菜分枝角的QTL及兩側(cè)與性狀連鎖的標(biāo)記, 為油菜分枝角度的分子標(biāo)記輔助育種提供了依據(jù)。我們前期研究發(fā)現(xiàn), 油菜從基部到頂部的分枝角度并不完全一樣, 有逐漸增大的趨勢(shì)[30]。不同材料間從下到上分枝角度變化具有同樣的趨勢(shì), 這是由油菜多分枝生長(zhǎng)發(fā)育習(xí)性決定的。本研究同時(shí)調(diào)查頂部和基部的分枝角度, 可以對(duì)這一性狀進(jìn)行更全面的分析。本研究獲得的油菜分枝角度QTL多數(shù)與已研究報(bào)道的QTL[18-22]相吻合, 還鑒定到一些新的QTL; 2個(gè)環(huán)境重復(fù)檢測(cè)到位于A03連鎖群的QTL效應(yīng)穩(wěn)定, 與前人利用關(guān)聯(lián)分析方法獲得的peak-SNP ()位點(diǎn)相同。頂端分枝角度和基部分枝角在同一環(huán)境中均在C08連鎖群定位到重合的QTL, 并且表型數(shù)據(jù)表明頂端分枝角和基部分枝角具有顯著相關(guān)性, 說(shuō)明可能存在同時(shí)控制油菜上、下分枝角度的基因。

圖3 甘藍(lán)型油菜頂端分枝角和基部分枝角QTL在連鎖群上分布圖

表4 在甘藍(lán)型油菜分枝角QTL置信區(qū)間比對(duì)獲得的候選基因

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展, 油菜參考基因組信息的公布[4-5], 油菜基因組上大量的SSR、Indel、SNP等標(biāo)記被發(fā)掘出來(lái)[31-32]。SNP標(biāo)記因?yàn)閿?shù)量多、分布廣, 在基因組中密度更高和分布更均勻, 已實(shí)現(xiàn)SNP基因型分型的高通量、快速和自動(dòng)化檢測(cè), 使不同研究者間的數(shù)據(jù)整合分析成為現(xiàn)實(shí)[33]。本研究構(gòu)建的高密度遺傳圖譜, 標(biāo)記間平均距離1.76 cM, 是較精密的甘藍(lán)型油菜遺傳圖譜之一。利用該圖譜獲得的分枝角性狀相關(guān)SNP標(biāo)記, 有助于進(jìn)一步發(fā)展加密QTL區(qū)間的分子標(biāo)記, 用于進(jìn)一步精細(xì)定位和功能基因克隆。

利用油菜基因組序列信息及SNP標(biāo)記的側(cè)翼序列, 從分枝角度的QTL置信區(qū)段內(nèi), 借助和擬南芥基因組間同源區(qū)間序列比對(duì), 篩選出12個(gè)油菜分枝角候選基因。其中坐落于A03染色體上的候選基因, 與擬南芥的基因同源。據(jù)擬南芥基因的功能注釋,基因正向調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素, 在生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸中通過(guò)正確的蛋白分泌與定位來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能, 在植物分枝數(shù)或分生組織的建成中發(fā)揮著重要作用[34]。位于C04染色體的候選基因, 該基因的擬南芥同源基因是。是控制水稻分蘗角度增加的主效基因, 具有顯性效應(yīng)[35]; 在玉米[36]、小麥和桃樹[37]中也已分別克隆和驗(yàn)證了基因的功能。因此,類基因在植物中具有廣泛的調(diào)節(jié)側(cè)生分枝水平生長(zhǎng)的功能[34]。在定位到的分枝角度QTL區(qū)間內(nèi)還鑒定到生長(zhǎng)激素相關(guān)的基因、、和。此外, 本研究還在QTL區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)許多未知功能的候選基因, 可能存在油菜特有的分枝角度的功能基因, 有待進(jìn)一步挖掘。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了包含19條染色體的油菜高密度遺傳圖譜, 該圖譜含9521個(gè)多態(tài)性標(biāo)記, 經(jīng)過(guò)整合為1442個(gè)簇, 相鄰簇之間平均距離為1.76 cM。定位到位于A01、A02、A03、A06、A09、C02、C03、C04、C06和C08染色體上的17個(gè)分枝角度QTL, 其中位于A03染色體上的QTL能在兩年環(huán)境下被重復(fù)檢測(cè)到, 貢獻(xiàn)率為9.31%~11.80%, 在A03染色體上重復(fù)檢測(cè)到的QTL 置信區(qū)間獲得1個(gè)與分枝角度相關(guān)的候選基因, 在C04染色體上的QTL置信區(qū)間獲得1個(gè)控制水稻分蘗角度的候選基因; 分別在染色體A01、A09、C03和C06上QTL中檢測(cè)到生長(zhǎng)激素相關(guān)基因、、和。本研究為進(jìn)一步鑒定和克隆油菜分枝角度功能基因奠定了基礎(chǔ)。

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Quantitative trait loci mapping for branch angle and candidate gene screening inL.

WANG Wen-Xiang1, CHU Wen1, MEI De-Sheng1, CHENG Hong-Tao1, ZHU Lin-Lin2, FU Li1, HU Qiong1, and LIU Jia1,*

1Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430062, Hubei, China;2Plant Protection Station of Nanzhang, Xiangyang 441500, Hubei, China

Branch angle is an important agronomic trait of plant architecture. In this study, 163 lines of a DH population derived from a cross between 1019B (compact type) and R2 (loose type) were genotyped by using 60K SNP array and a high-density genetic linkage map was constructed with 1442 bins inclusive of 9521 SNP markers to detect quantitative trait loic (QTL) for basal branch angle and top branch angle. The genetic map contained 19 lingkage groups with a total length of 2544.07 cM and an average distance between adjacent bin-markers of 1.76 cM. Totally, 17 QTL for branch angle were detected on chromosomes A01, A02, A03, A06, A09, C02, C03, C04, C06, and C08, respectively. The phenotypic variation accounted by a single locus was from 6.36% to 21.78%. Twelve candidate genes of branch angle were found underlying six QTL by comparing with homologous genesin. Candidate genewas close to the peak position of A03 QTL confidence interval, which was identified on chromosome A03 in both environments. These QTL and candidate genes provide useful information for the genetic modification of rapeseed branch angle.

oilseed rape; branch angle; 60K SNP array;QTL mapping; candidate gene

): 2018-03-22;

2018-08-20;

2018-09-09.

10.3724/SP.J.1006.2019.84042

通信作者(Corresponding author):劉佳, E-mail: liujia02@caas.cn, Tel: 027-86711556

E-mail: wangwenxiang@caas.cn, Tel: 027-86711556

本研究由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(Group No. 118), 國(guó)家農(nóng)業(yè)現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-12), 湖北省科技創(chuàng)新工程和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471535, 31771842)資助。

This study was supported by the Science and Technology Innovation Project of Chinese Academy of Agricultural Sciences (Group No. 118), the China Agriculture Research System (CARS-12), the Hubei Agricultural Science and Technology Innovation Center, and the National Natural Science Foundation of China (31471535, 31771842).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180918.1125.004.html