宋奇琦 Pratiksha SINGH Rajesh Kumar SINGH 宋修鵬 李海碧農(nóng)友業(yè) 楊麗濤,,* 李楊瑞,,*

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基于iTRAQ技術(shù)的甘蔗受黑穗病菌侵染蛋白組分析

宋奇琦1,**Pratiksha SINGH2,**Rajesh Kumar SINGH2宋修鵬1李海碧1農(nóng)友業(yè)2楊麗濤1,2,*李楊瑞1,2,*

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/ 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院/ 農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西南寧 530007;2廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西南寧 530005

黑穗病已成為影響甘蔗產(chǎn)量和含糖量的重要病害。為從蛋白質(zhì)水平探討甘蔗應(yīng)答黑穗病菌的分子機(jī)制, 本實(shí)驗(yàn)選用抗黑穗病品種桂糖29號(hào)和感黑穗病品種崖城71-374, 處理組用浸漬法接種黑穗病菌, 對(duì)照組用無(wú)菌水模擬接菌, 在接種180 d后采取甘蔗葉片, 使用iTRAQ技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究。結(jié)果顯示, 桂糖29號(hào)中有定量信息蛋白1429個(gè), 差異表達(dá)蛋白290個(gè), 其中上調(diào)表達(dá)蛋白153個(gè), 下調(diào)表達(dá)蛋白137個(gè); 崖城71-374中有定量信息蛋白1576個(gè), 差異表達(dá)蛋白125個(gè), 其中上調(diào)表達(dá)蛋白55個(gè), 下調(diào)表達(dá)蛋白70個(gè)?？共∑贩N桂糖29號(hào)中差異表達(dá)蛋白數(shù)多于感病品種崖城71-374, 且桂糖29號(hào)在KEGG富集到的代謝通路也更多, 可能被侵染后抗病品種的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制更為復(fù)雜, 涉及的調(diào)控通路網(wǎng)更廣。經(jīng)對(duì)光合作用、抗氧化系統(tǒng)、鈣信號(hào)、苯丙烷類代謝、激素相關(guān)差異表達(dá)蛋白及共有差異表達(dá)蛋白分析, 發(fā)現(xiàn)光合作用通路、ROS、ABA、鈣信號(hào)通路相關(guān)蛋白在2個(gè)品種中多為上調(diào)表達(dá), 且桂糖29號(hào)的上調(diào)表達(dá)蛋白數(shù)多于崖城71-374, 可能參與甘蔗后期對(duì)黑穗病的應(yīng)答。植物抗病是一個(gè)復(fù)雜的過程, 需要多種功能與途徑參與調(diào)控。在本實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)苯丙烷類代謝途徑及一些酶(谷胱甘肽過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、過氧化氫酶)、激素(生長(zhǎng)素、乙烯、赤霉素)參與甘蔗的抗病過程, 可能與采樣時(shí)間有關(guān)。

甘蔗; 黑穗病; iTRAQ; 蛋白質(zhì)組

甘蔗是重要的農(nóng)作物, 種植在包括中國(guó)在內(nèi)的90多個(gè)國(guó)家。黑穗病已經(jīng)成為全球性的甘蔗病害, 且發(fā)病率逐年提高。如果感染嚴(yán)重, 可造成甘蔗20%~50%的產(chǎn)量損失, 糖含量也會(huì)大量減少[1-2]。

前人關(guān)于黑穗病的研究大部分集中在生理生化方面。Lloyd等[3]采用越過芽麟障礙的針刺接種方法, 將病原菌注入一些甘蔗品種芽體分生組織區(qū)后, 發(fā)現(xiàn)有些甘蔗品種仍不發(fā)病, 表明甘蔗體內(nèi)產(chǎn)生了抑制病原菌入侵繁殖的物質(zhì), 同時(shí)也揭示了甘蔗品種生理生化抗性的存在。Singh等[4]觀察到2個(gè)易感黑穗病甘蔗品種的葉片、芽、頂端分生組織、側(cè)枝以及莖中甘蔗汁的抗壞血酸含量增加, 推測(cè)這可能是病原菌產(chǎn)生抗壞血酸加速酶或宿主-病原菌相互作用所致。Santiago等[5]研究由黑穗病誘導(dǎo)植物酚類物質(zhì)含量的變化, 導(dǎo)致細(xì)胞壁木質(zhì)化加厚, 可作為對(duì)病原菌入侵的機(jī)械防御, 推測(cè)木質(zhì)素在機(jī)械組織中的沉積會(huì)增加甘蔗的生化和形態(tài)學(xué)抗性反應(yīng)。莫鳳蓮等[6]利用透射電子顯微鏡觀察甘蔗感黑穗病和蔗芽的超微結(jié)構(gòu)變化, 發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞變形嚴(yán)重甚至空泡化, 細(xì)胞核、核仁、染色質(zhì)和線粒體等均發(fā)生改變, 同時(shí)研究甘蔗接種黑穗病菌后內(nèi)源激素含量變化, 甘蔗葉片中生長(zhǎng)素(IAA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)含量及IAA/ABA值的變化與甘蔗抗性密切相關(guān)。蘇亞春等[7]研究表明, 甘蔗抗性品種崖城05-179在感染黑穗病初期幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶、過氧化氫酶活性均高于感病品種柳城03-182, 這些酶活性與甘蔗黑穗病抗性有一定聯(lián)系。Leila等[8]研究發(fā)現(xiàn), 抗性甘蔗品種中過氧化氫(H2O2)積累與甘蔗鞭黑粉菌冬孢子在植物體內(nèi)萌發(fā)和附著胞形成階段一致, 而感病品種只有少量H2O2的積累, 但2個(gè)品種均沒有超氧陰離子自由基(O2–)的累積, 同時(shí)通過對(duì)丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性及蛋白質(zhì)組研究, 推測(cè)H2O2的積累可能是與抗壞血酸、谷胱甘肽和硫氧還蛋白相關(guān)的多重系統(tǒng)來(lái)影響信號(hào)傳導(dǎo)。

隨著先進(jìn)生物技術(shù)手段的出現(xiàn), 人們對(duì)甘蔗-病原菌互作有了更深入的了解。最近的分子生物學(xué)研究涉及分子標(biāo)記技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等。宋修鵬[9]成功構(gòu)建了甘蔗幼苗應(yīng)答黑穗病侵染的正向SSH文庫(kù), 并利用同源克隆和RACE技術(shù)得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAM)、木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移水解酶(XTH)、Nudix水解酶(NUDT)基因全長(zhǎng)。Barnabas等[10]通過雙向電泳(2-DE)聯(lián)合MALDI-TOF/TOF-MS技術(shù)鑒定感黑穗病40 d后甘蔗差異蛋白, 鑒定出53個(gè)蛋白質(zhì)與防御、脅迫、代謝、蛋白質(zhì)折疊、能量和細(xì)胞分裂有關(guān)。Su等[11]通過蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)兩者的相關(guān)性較差, 與差異基因表達(dá)趨勢(shì)相同的蛋白大多與植物抗逆相關(guān), iTRAQ分析結(jié)果顯示, 乙烯、赤霉素、苯丙烷類代謝參與甘蔗抗黑穗病過程, 而鈣信號(hào)通路、活性氧通路、脫落酸沒有參與應(yīng)答過程。Que等[12]利用2-DE技術(shù)分析甘蔗品種NCo376和Ya71-374感黑穗病后蛋白質(zhì)的表達(dá), 生物信息學(xué)分析表明, 20 個(gè)差異蛋白與光合作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能有關(guān)。

同位素相對(duì)和絕對(duì)定量標(biāo)記(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)是2004年美國(guó)ABI公司研發(fā)的一種新型定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù), 該技術(shù)具有分離能力強(qiáng)、定性分析結(jié)果可靠、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[13]。唐成等[14]基于iTRAQ技術(shù)對(duì)稻瘟病侵染水稻幼苗葉片后差異表達(dá)蛋白分析, 表明53個(gè)差異蛋白涉及氧化還原平衡、防御、信號(hào)傳導(dǎo)、糖和能量代謝、氨基酸代謝、光合作用及蛋白質(zhì)代謝等途徑。Marsh等[15]利用iTRAQ技術(shù)分析葡萄感染白粉病后葉片在不同時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)蛋白, 鑒定到63個(gè)差異蛋白與光合作用、代謝、病害防御、蛋白質(zhì)合成等相關(guān)。目前對(duì)甘蔗黑穗病的研究大部分在感病初期, 本實(shí)驗(yàn)利用iTRAQ技術(shù)分析甘蔗與黑穗病長(zhǎng)期互作后差異表達(dá)蛋白, 探尋與抗黑穗病相關(guān)的功能及代謝途徑, 以期為甘蔗抗黑穗病分子機(jī)制的研究提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用甘蔗品種桂糖29號(hào)(GT29)和崖城71-374 (Yacheng 71-374), 由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所提供。其中, GT29經(jīng)多年試驗(yàn), 其新植和宿根均表現(xiàn)為高抗黑穗病[16]; Yacheng 71-374經(jīng)鑒定為高感黑穗病品種[17]。黑穗病菌混合冬孢子收集于廣西大學(xué)試驗(yàn)田甘蔗品種桂糖11號(hào)、桂選B9、新臺(tái)糖22號(hào)、拔地拉。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 2016年4月至11月在廣西大學(xué)甘蔗智能溫室大棚, 將蔗種砍成單芽段, 水浴鍋中50℃浸種2 h, 之后進(jìn)行沙培育苗。1個(gè)月后, 分別挑選每個(gè)品種60株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗, 用無(wú)菌水清洗后分成兩等份。一組經(jīng)黑穗病菌孢子濃度為5106個(gè)孢子 mL–1懸浮液浸泡2 h作為處理組, 另一組則用無(wú)菌水浸泡2 h作為對(duì)照組, 將幼苗移栽到桶里, 置于甘蔗智能溫室。甘蔗通常在病菌侵染6~7個(gè)月黑穗長(zhǎng)度達(dá)到頂峰[18], 所以選取感染180 d后時(shí)間點(diǎn)取樣。采用浸漬法接菌最接近黑穗病菌侵染甘蔗的自然狀態(tài), 在侵染180 d后, 感病甘蔗比對(duì)照植株矮小, 葉片細(xì)長(zhǎng), 但葉片顏色肉眼觀察差異不明顯。均取2個(gè)品種甘蔗發(fā)病植株+1葉, 去除葉脈, 采集的樣品經(jīng)蒸餾水清洗后擦干, 用液氮冷凍, 保存于-80°C。2個(gè)品種均有2個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 PCR檢測(cè) 使用植物DNA提取試劑盒(康為世紀(jì), 北京)從GT29和Yacheng 71-374感病及對(duì)照植株中提取基因組DNA; 通過HP Fungal DNA Kit (Omega, 中國(guó)寧波)試劑盒提取黑穗病冬孢子DNA作為陽(yáng)性對(duì)照, 無(wú)菌水為陰性對(duì)照。用黑穗病菌檢測(cè)引物bE4 (5￠-CGCTCTGGTTCATCAACG-3')和bE8 (5￠-TGCTGTCGATGGAAGGTGT-3￠)檢測(cè)甘蔗是否感染黑穗病菌。用引物bE4/bE8能擴(kuò)增出黑穗病菌基因組序列上的一段特異序列, 長(zhǎng)度為459 bp。

1.2.3 蛋白樣品制備 提取蛋白參考林麗等[19]酚抽提法, 用裂解液溶解蛋白, 加入5倍體積預(yù)冷的丙酮, 于-20°C沉淀過夜, 離心得到蛋白沉淀, 晾干10 min左右, 用iTRAQ定量試劑盒中dissolution buffer溶解。

1.2.4 蛋白質(zhì)樣品定量與酶解 按照Qubit Protein Assay Kit試劑盒說明書進(jìn)行蛋白質(zhì)定量, 根據(jù)定量結(jié)果, 從每個(gè)樣品精確取出100 μg蛋白, 加入iTRAQ定量試劑盒中1 μL 2% SDS溶液使蛋白質(zhì)變性, 然后再加入2 μL還原試劑, 渦旋混合, 于60°C孵育1 h后加入1 μL半胱氨酸封閉試劑反應(yīng)30 min, 加入1 μg μL–1胰蛋白酶, 胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1∶20, 37°C酶解12~16 h。

1.2.5 用iTRAQ試劑標(biāo)記 取出iTRAQ標(biāo)記, 室溫平衡, 短暫離心至管底。每管加入70 μL 乙醇, 震蕩混勻, 短暫離心。將每管標(biāo)記試劑分別轉(zhuǎn)移至樣品管中, 4個(gè)樣品分別用不同的同位素標(biāo)記, 即用iTRAQ 8 Plex 114標(biāo)記GT29對(duì)照, 115標(biāo)記GT29處理, 116標(biāo)記Yacheng 71-374對(duì)照, 117標(biāo)記Yacheng 71-374處理。震蕩混勻, 測(cè)定溶液的pH值, 保證pH=7.8~8.5, 且保證溶液的有機(jī)相比例≥70%, 室溫孵育1 h, 然后加入一定量的超純水(約100 μL)終止標(biāo)記反應(yīng)?；旌细鞴軜悠? 震蕩混勻, 短暫離心。使用C18小柱去除雜質(zhì), 真空濃縮抽干備用。

1.2.6 用高pH值C18反相色譜柱進(jìn)行第一維多肽分離 上述標(biāo)記后, 將樣品復(fù)溶于流動(dòng)相A, 使用C18反相色譜柱XBridge Peptide BEHC18 (4.6 mm×250.0 mm)進(jìn)行分離收集。流動(dòng)相A為98%水, 2%乙腈, pH 10.0。流動(dòng)相B為98%乙腈, 2%水, pH值為10.0。流速0.5 mL min–1。梯度0~8 min, 100% A; 8~48 min, 100% A~40% B; 48~53 min, 40%~100% B; 53~63 min, 100% B; 63~65 min, 100% B~100% A; 65~75 min, 100% A。檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。從8 min開始收集餾分, 每2 min收集1管, 然后將首尾收集的餾分適當(dāng)合并, 最后得到10個(gè)餾分。

1.2.7 納升液相結(jié)合LTQ-Orbitrap質(zhì)譜分析 將第一維分離后的餾分, 通過脫鹽處理、真空抽干, 復(fù)溶于流動(dòng)相A, 以便進(jìn)行后續(xù)的LC-MS/MS 分析。流動(dòng)相A為2% ACN+0.1% HCOOH。流動(dòng)相B為98% ACN+0.1% HCOOH。洗脫梯度: 0~5 min, 2%~10% B; 5~50 min, 10%~35% B; 50~55 min, 35%~98% B; 55~65 min, 98% B。流速為250 nL min–1。色譜柱為C18反相毛細(xì)管柱。

質(zhì)譜模式為ESI正離子模式, 一級(jí)質(zhì)譜掃描分辨率為60,000; 掃描范圍為m/z = 350~1800; 二級(jí)質(zhì)譜掃描分辨率為15,000, 用HCD 碰撞模式完成, 采用數(shù)據(jù)依賴型的自動(dòng)化采集模式。電噴霧電壓為2.8 kV。

1.2.8 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋鑒定 質(zhì)譜采集到的原始數(shù)據(jù)采用Proteome Discovery軟件的SEQUEST搜索器進(jìn)行搜索和匹配, 采用本課題組測(cè)定的轉(zhuǎn)錄組翻譯的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。搜索參數(shù)設(shè)置如下, 消化酶胰蛋白酶(trypsin)作為消化酶, 選擇酶解最大2個(gè)漏切位點(diǎn), 固定修飾為甲硫氨酸(methionine)的氧化, 可變修飾為烷基化(carbamidomethyl C)以及iTRAQ對(duì)N端和氨基酸K、Y位點(diǎn)的修飾。

1.2.9 生物信息學(xué)分析 對(duì)鑒定到的蛋白進(jìn)行GO注釋, 并進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO富集、KEGG富集分析。分別對(duì)每個(gè)甘蔗品種的2個(gè)樣本進(jìn)行重復(fù)性分析。2個(gè)樣本的ratio取平均值, 并通過2次結(jié)果進(jìn)行-test檢驗(yàn), 計(jì)算-value值, 當(dāng)-value<0.05, ratio>1.2或ratio<0.83視為差異表達(dá)蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳表明, GT29和Yacheng 71-374接種黑穗病的植株與陽(yáng)性對(duì)照均可擴(kuò)增出459 bp左右的條帶, 對(duì)照植株則無(wú)此條帶(圖1)。擴(kuò)增的PCR片段序列與GenBank中公布的bEast交配型基因序列相同, 證實(shí)處理組甘蔗已感染黑穗病菌, 而對(duì)照組沒有被感染(GenBank登錄號(hào)為KY575283~KY575284)。

2.2 鑒定的蛋白質(zhì)信息

成功鑒定的有定量信息的蛋白共有1831個(gè), 其中共有蛋白1174個(gè)。Yacheng 71-374中鑒定到的蛋白數(shù)比GT29中多147個(gè)。GT29鑒定到的差異表達(dá)蛋白有290個(gè), 其中上調(diào)表達(dá)蛋白有153個(gè), 下調(diào)表達(dá)蛋白有137個(gè)。Yacheng 71-374中鑒定到的差異表達(dá)蛋白有125個(gè), 其中上調(diào)表達(dá)蛋白有55個(gè), 下調(diào)表達(dá)蛋白有70個(gè)?？共∑贩NGT29中差異表達(dá)蛋白數(shù)多于感病品種Yacheng 71-374 (表1)。

圖1 對(duì)照和接種黑穗病菌甘蔗DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

M: molecular size marker (100~5000 bp); P: 黑穗病孢子DNA正對(duì)照; N: 無(wú)菌水負(fù)對(duì)照; G(T): GT29處理; G(C): GT29 對(duì)照; Y(T): Yacheng 71-374處理; Y(C): Yacheng 71-374對(duì)照。

M: molecular size marker (100-5000 bp); P:DNA as positive; N: sterile water as negative; G(T): GT29 treatment; G(C): GT29 control; Y(T): Yacheng 71-374 treatment; Y(C): Yacheng 71-374 control.

表1 2個(gè)甘蔗品種中鑒定到的肽段和蛋白數(shù)

GO注釋包含生物過程(biological process)、分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)三大分支。對(duì)總蛋白進(jìn)行GO注釋, 鑒定到的蛋白在生物過程中占比例最大條目為代謝過程(metabolic process)(62%)、細(xì)胞過程(cellular process)(43%)、單一生物過程(single-organism process)(35%), 在分子功能中催化(catalytic)(55%)和結(jié)合(binding)(48%)占多數(shù), 而細(xì)胞組分中主要條目為細(xì)胞(cell)(25%)和細(xì)胞部分(cell part)(25%)(圖2)。

2.3 差異表達(dá)蛋白GO富集分析

GT29差異表達(dá)蛋白GO富集分析結(jié)果如附表1所示, 在生物過程中, 極顯著富集(<0.01)條目有光合作用-光反應(yīng)(photosynthesis-light reaction)、光合作用-光捕獲(photosynthesis-light harvesting)、光合作用(photosynthesis); 分子功能中主要富集條目為蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性(methionine adenosyl transferase acti-vity)、酶抑制劑活性(enzyme inhibitor activity); 細(xì)胞組分中極顯著富集(<0.01)條目為膜(membrane)。

圖2 GO注釋分析

Yacheng 71-374差異表達(dá)蛋白富集結(jié)果如附表2所示。生物過程中極顯著富集(<0.01)條目有氧化應(yīng)激反應(yīng)(response to oxidative stress)、代謝調(diào)節(jié)過程(regulation of metabolic process); 而分子功能中極顯著富集(<0.01)條目有7條, 分別為兒茶酚氧化酶活性(catechol oxidase activity)、氨裂解酶活性(ammonia-lyase activity)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity, acting on diphenols and related substances as donors, oxygen as acceptor)、碳酸脫水酶活性(carbonate dehydratase activity)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity acting on peroxide as acceptor)、過氧化物酶活性(peroxidase activity)、裂解酶活性(lyase activity); 細(xì)胞組分中主要富集到光合體系(photosystem)條目中。

2.4 差異表達(dá)蛋白KEGG富集分析

通過kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異蛋白進(jìn)行富集分析。GT29差異蛋白顯著富集(<0.05)到8條通路中, 分別為核糖體(ribosome)、光合作用(photosynthesis)、類胡蘿卜素生物合成(carotenoid biosynthesis)、植物-病原菌互作(plant-pathogen interaction)、抗原的加工提呈(antigen processing and presentation)、雙組分系統(tǒng)(two-component system)、光合作用-天線蛋白(photosynthesis-antenna proteins)、吞噬體(phagosome)。其中, 極顯著富集(<0.01)通路為光合作用(=0.0067)、核糖體(=0.0063)。

Yacheng 71-374差異蛋白顯著富集(<0.05)到3條通路中, 分別為光合作用(photosynthesis)、苯丙烷類生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、次生代謝產(chǎn)物生物合成(biosynthesis of secondary metabolites), 其中極顯著富集(<0.01)通路為光合作用(= 0.0014)、苯丙烷類生物合成(=0.0082)。

2.5 光合作用相關(guān)差異表達(dá)蛋白

GO富集和KEGG富集結(jié)果顯示, 2個(gè)甘蔗品種均在光合作用代謝過程差異蛋白最多、差異最顯著, 因此, 我們重點(diǎn)關(guān)注了與此相關(guān)的差異表達(dá)蛋白。光合作用4個(gè)多亞基蛋白復(fù)合體分別為光系統(tǒng)I (PS I)、光系統(tǒng)II (PSII)、ATP合成酶(ATPase)及細(xì)胞色素b6f復(fù)合體(Cytb6f)[20]。PS I由天線系統(tǒng)、反應(yīng)中心、外周蛋白、內(nèi)在蛋白構(gòu)成, PS II主要由外周天線、內(nèi)周天線、反應(yīng)中心、放氧復(fù)合體和輔助亞基構(gòu)成[21]。由表2可知, GT29鑒定到28個(gè)相關(guān)差異蛋白, 26個(gè)上調(diào)表達(dá), 2個(gè)下調(diào)表達(dá); Yacheng 71-374鑒定到16個(gè)相關(guān)差異蛋白, 12個(gè)上調(diào)表達(dá), 4個(gè)下調(diào)表達(dá)。PSI反應(yīng)中心亞基在GT29中有4個(gè)(c54318_ g1;orf1、c69501_g1;orf1、c56023_g1;orf1、c56941_g1; orf1)均為上調(diào)表達(dá), 在Yacheng 71-374中有5個(gè)(c54318_g1;orf1、c48673_g1;orf1、c43081_g1;orf1、c129327_g1;orf1、c55121_g1;orf1)同樣都上調(diào)表達(dá); 鐵氧還蛋白[2Fe-2S]為PSI反應(yīng)中心電子受體[22], 在GT29下調(diào)表達(dá), Yacheng 71-374無(wú)差異; PSI組裝蛋白ycf4在GT29上調(diào)表達(dá), Yacheng 71-374下調(diào)表達(dá); 葉綠素結(jié)合蛋白由Lhca基因家族編碼, 為PSI天線系統(tǒng)[23], 在GT29有11個(gè)差異表達(dá), 其中僅有1個(gè)下調(diào)表達(dá), 在Yacheng 71-374有4個(gè)差異表達(dá), 其中1個(gè)下調(diào)表達(dá)。PSII反應(yīng)中心相關(guān)蛋白[21]在GT29中PSII蛋白D1、PSII蛋白D2、細(xì)胞色素b559亞基α均上調(diào)表達(dá), 在Yacheng 71-374僅細(xì)胞色素b559亞基α (c54219_g1;orf2)差異下調(diào); 內(nèi)周天線蛋白PSII CP43脫輔基蛋白(c77580_g1;orf1)在GT29上調(diào)表達(dá), Yacheng 71-374中無(wú)差異; 放氧增強(qiáng)蛋白是PSII的放氧復(fù)合體的一部分[24], 結(jié)果顯示, GT29中有1個(gè)上調(diào)表達(dá), Yacheng 71-374有2個(gè)上調(diào)表達(dá); PSII PsbR、PSII 47 kDa蛋白在GT29上調(diào)表達(dá), 在Yacheng 71-374中無(wú)差異。細(xì)胞色素b6f復(fù)合體連接PSI和PSII中電子傳遞, 同時(shí)促進(jìn)ATP合成。GT29中細(xì)胞色素b6、細(xì)胞色素f上調(diào)表達(dá), 而在Yacheng 71-374中均無(wú)差異。ATP合成酶在GT29中一個(gè)上調(diào)表達(dá)一個(gè)下調(diào)表達(dá), 在Yacheng 71-374中均無(wú)差異。還有葉綠體Ptr-ToxA結(jié)合蛋白在GT29上調(diào)表達(dá), 銅蛋白在Yacheng 71-374上調(diào)表達(dá), 16 kDa膜蛋白在GT29上調(diào)表達(dá), 而在Yacheng 71-374下調(diào)表達(dá)。結(jié)果表明, 相關(guān)差異蛋白參與光合作用的多個(gè)方面, 可能在2個(gè)甘蔗品種抗黑穗病過程均起重要作用, 在抗病品種GT29中表現(xiàn)更加突出。

表2 光合作用相關(guān)差異表達(dá)蛋白

(續(xù)表2)

蛋白IDProtein ID蛋白名稱Protein name差異倍數(shù) Fold change GT29Yacheng 71-374 c126236_g1;orf1放氧增強(qiáng)蛋白1 Oxygen-evolving enhancer protein 11.00641.2372- c59540_g1;orf1放氧增強(qiáng)蛋白3 Oxygen-evolving enhancer protein 30.87541.8631- c100226_g1;orf1放氧增強(qiáng)蛋白 Oxygen-evolving enhancer protein1.5306-0.9906 c55903_g1;orf1葉綠體放氧增強(qiáng)蛋白1 (部分) Chloroplast oxygen-evolving enhancer protein 1 (partial)1.04561.2517- c51741_g1;orf1光系統(tǒng)II PsbR Photosystem II PsbR1.9037-1.0547 c22663_g1;orf1光系統(tǒng)II 47kDa蛋白 Photosystem II 47 kDa protein1.7295-0.9404 c56158_g2;orf1細(xì)胞色素b6 (部分) Cytochrome b6 (partial)1.4786-1.0816 c72546_g2;orf1細(xì)胞色素f Cytochrome f1.2540-0.9964 c67723_g1;orf1ATP合成酶CF1α亞基 ATP synthase CF1 α subunit1.3837-1.0172 c57360_g1;orf2ATP合成酶 ATP synthase0.6735ˉ1.0127 c61429_g2;orf1葉綠體Ptr-ToxA結(jié)合蛋白 Chloroplast Ptr ToxA-binding protein1.4116-0.9843 c54911_g1;orf116 kDa膜蛋白 16 kDa membrane protein1.6364-0.7557ˉ c47557_g1;orf1銅蛋白 Blue (type 1) Copper protein Blue (type 1)1.11701.5826-

-為上調(diào)表達(dá),ˉ為下調(diào)表達(dá)。-is up-regulated andˉis down-regulated.

2.6 抗氧化相關(guān)差異表達(dá)蛋白

植物在受到脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS), 而過量的ROS會(huì)氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸, 從而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷[25]。鑒定到的相關(guān)酶包括過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)和過氧化氫酶(CAT)。

由表3可知, 在GT29中鑒定到15個(gè)POD差異表達(dá)蛋白, 其中11個(gè)上調(diào)表達(dá); Yacheng 71-374鑒定到13個(gè)差異表達(dá)蛋白, 其中10個(gè)上調(diào)表達(dá), 3個(gè)下調(diào)表達(dá)。在GT29鑒定到2個(gè)GPX差異表達(dá)蛋白均下調(diào)表達(dá), 而在Yacheng 71-374中無(wú)差異表達(dá)。在GT29鑒定到4個(gè)APX差異表達(dá)蛋白均下調(diào)表達(dá); 在Yacheng 71-374中鑒定到1個(gè)差異下調(diào)表達(dá)蛋白。在GT29鑒定到3個(gè)SOD差異表達(dá)蛋白均下調(diào)表達(dá); 在Yacheng 71-374中鑒定到1個(gè)差異上調(diào)表達(dá)蛋白。在GT29鑒定到6個(gè)GST差異表達(dá)蛋白其中1個(gè)上調(diào)表達(dá), 5個(gè)上調(diào)表達(dá); 而在Yacheng 71-374中鑒定到5個(gè)差異表達(dá)蛋白均為上調(diào)表達(dá)。在GT29鑒定到3個(gè)CAT差異表達(dá)蛋白, 其中1個(gè)上調(diào)表達(dá), 2個(gè)下調(diào)表達(dá); 在Yacheng 71-374中鑒定到1個(gè)差異下調(diào)表達(dá)蛋白。2個(gè)品種的POD均大部分為上調(diào)表達(dá), 抗性品種GT29稍多一些,而GPX、APX、SOD、GST、CAT在GT29中大都為下調(diào)表達(dá), Yacheng 71-374中表現(xiàn)為上調(diào)或無(wú)差異, 結(jié)果表明, 甘蔗在受黑穗病菌脅迫時(shí)會(huì)誘導(dǎo)抗氧化蛋白來(lái)參與應(yīng)答, 可能主要為POD。

表3 抗氧化相關(guān)差異表達(dá)蛋白

(續(xù)表3)

蛋白IDProtein ID蛋白名稱Protein name差異倍數(shù) Fold change GT29Yacheng 71-374 c58718_g1;orf1過氧化物酶 Peroxidase0.4462ˉ0.4493ˉ c67818_g4;orf1過氧化物酶 Peroxidase1.3312-1.6457- c64648_g9;orf1過氧化物酶 Peroxidase2.7030-1.4510- c70898_g1;orf2過氧化物酶 Peroxidase1.2262-1.3997- c50276_g1;orf1過氧化物酶 Peroxidase1.2289-1.3558- c58269_g2;orf1過氧化物酶 Peroxidase1.4748-1.2872- c46626_g1;orf1過氧化物酶 Peroxidase1.4542-1.2559- c70898_g1;orf1過氧化物酶 Peroxidase1.3312-1.2195- 谷胱甘肽過氧化物酶GPX c73435_g2;orf1谷胱甘肽過氧化物酶 Glutathione peroxidase0.8064ˉ1.0474 c55250_g2;orf1磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶6Probable phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase 60.7848ˉ0.9799 抗壞血酸過氧化物酶APX c79083_g1;orf1L-抗壞血酸過氧化物酶 L-ascorbate peroxidase0.7024ˉ0.9451 c113714_g1;orf1APx1-細(xì)胞溶質(zhì)抗壞血酸過氧化物酶 APx1-cytosolic Ascorbate Peroxidase0.7028ˉ0.9186 c76142_g1;orf1抗壞血酸過氧化物酶 Ascorbate peroxidase0.7592ˉ0.9356 c64041_g1;orf1抗壞血酸過氧化物酶 Ascorbate peroxidase0.7935ˉ0.9019 c62865_g1;orf1抗壞血酸過氧化物酶 Ascorbate peroxidase0.93930.7810ˉ 超氧化物歧化酶SOD c73325_g1;orf1超氧化物歧化酶(Cu/Zn) Superoxide dismutase (Cu/Zn)0.6040ˉ1.4209- c73325_g2;orf2超氧化物歧化酶(Cu/Zn) Superoxide dismutase (Cu/Zn)0.4810ˉ1.1765 c55722_g2;orf1超氧化物歧化酶 Superoxide dismutase0.5893ˉ1.0278 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶GST c66937_g2;orf2谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶4 Glutathione S-transferase 40.4706ˉ1.0162 c71423_g2;orf2谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶F8 Glutathione S-transferase F80.7288ˉ1.3394- c57078_g1;orf1谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GST 12 Glutathione S-transferase GST 121.07511.2122- c47481_g1;orf1谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GST 14 Glutathione S-transferase GST 140.94911.3272- c49019_g1;orf1谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 Glutathione S-transferase0.92921.2484- c125211_g1;orf1谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 Glutathione S-transferase1.17191.2102- c67259_g1;orf1谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 Glutathione S-transferase0.6751ˉ1.0939 c66937_g2;orf1谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 Glutathione S-transferase0.5350ˉ0.9349 c65037_g3;orf1谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 Glutathione S-transferase1.2785-0.9165 c66547_g1;orf2蛋白IN2-1同系物B同型X2 Protein IN2-1 homolog B isoform X20.6158ˉ1.0739 過氧化氫酶CAT c63190_g2;orf1過氧化氫酶 Catalase-1-like0.7984ˉ0.9734 c63190_g2;orf2過氧化氫酶 Catalase-1-like0.8116ˉ0.8982 c63190_g1;orf1過氧化氫酶 Catalase1.2415-0.7038ˉ

-為上調(diào)表達(dá),ˉ為下調(diào)表達(dá)。-is up-regulated andˉis down-regulated.

2.7 鈣信號(hào)通路相關(guān)差異表達(dá)蛋白

鈣信號(hào)是植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的信號(hào)分子, 參與了大多細(xì)胞生理代謝過程[26]。在GT29中鑒定到2個(gè)差異表達(dá)鈣調(diào)蛋白均下調(diào)表達(dá), 1個(gè)鈣依賴性蛋白激酶上調(diào)表達(dá), 3個(gè)EF-手型鈣結(jié)合蛋白中有1個(gè)上調(diào)表達(dá), 2個(gè)下調(diào)表達(dá)。而在Yacheng 71-374中沒有鑒定到任何相關(guān)差異表達(dá)蛋白。說明鈣信號(hào)在一定程度上參與了甘蔗應(yīng)答黑穗病過程, 但可能不是主要影響因素。

2.8 苯丙烷類代謝相關(guān)差異表達(dá)蛋白

在受到生物或非生物脅迫時(shí), 苯丙烷類代謝途徑是植物抗病反應(yīng)次生代謝中重要的代謝途徑之一[27]。本實(shí)驗(yàn)鑒定到相關(guān)差異蛋白中苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶和限速酶, 在GT29中有1個(gè)上調(diào)表達(dá), 在Yacheng 71-374中有2個(gè)上調(diào)表達(dá)。3-脫氫奎尼酸合酶在苯丙氨酸生物合成途徑中將4-磷酸赤蘚糖催化生成分支酸[28], 其在GT29中無(wú)差異, 在Yacheng 71-374中上調(diào)表達(dá)。分支酸變位酶催化分支酸生成預(yù)苯酸[28], 在GT29中上調(diào)表達(dá), 在Yacheng 71-374中無(wú)差異。DAHP合成酶受終產(chǎn)物酪氨酸和苯丙氨酸的協(xié)同反饋抑制[29], 在2個(gè)品種均下調(diào)表達(dá)?？Х弱］o酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶是木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵酶[30], 在2個(gè)品種均下調(diào)表達(dá)。表明苯丙烷類代謝途徑可能也不是甘蔗抗黑穗病的關(guān)鍵途徑。

2.9 激素相關(guān)差異表達(dá)蛋白

激素在甘蔗抗黑穗病中的作用已有研究[31]。與生長(zhǎng)素(IAA)相關(guān)蛋白IAA-氨基酸水解酶ILR1、生長(zhǎng)素抑制12.5 kDa蛋白在GT29中均下調(diào)表達(dá), 在Yacheng 71-374中無(wú)差異。與乙烯(ETH)相關(guān)蛋白1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸酯氧化酶在GT29中無(wú)差異, 在Yacheng 71-374中下調(diào)表達(dá)。與脫落酸(ABA)相關(guān)蛋白, 在GT29中有3個(gè)蛋白磷酸酶2C、1個(gè)推定9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶均上調(diào)表達(dá), 在Yacheng 71-374中有2個(gè)蛋白磷酸酶2C同樣均上調(diào)表達(dá)。與赤霉素(GA)相關(guān)蛋白赤霉素受體GID1L2在GT29中均下調(diào)表達(dá), 在Yacheng 71-374中無(wú)差異。這表明ABA在甘蔗抗黑穗病過程中可能有重要作用。同Su等[11]鑒定結(jié)果一致, 茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)、細(xì)胞分裂素(CTK)相關(guān)蛋白沒有被鑒定到, 可能其在早期被誘導(dǎo), 采樣時(shí)間點(diǎn)較晚, 表達(dá)豐度低。

2.10 共有差異表達(dá)蛋白分析

2個(gè)甘蔗品種共同差異表達(dá)蛋白有83個(gè)。其中GT29上調(diào)表達(dá)蛋白55個(gè), 下調(diào)表達(dá)蛋白28個(gè); Yacheng 71-374上調(diào)表達(dá)蛋白48個(gè), 下調(diào)表達(dá)蛋白35個(gè)。對(duì)83個(gè)共有差異表達(dá)蛋白進(jìn)行COG功能分類, 整體功能類(general function prediction only)蛋白數(shù)量最多, 其次是翻譯/核糖體結(jié)構(gòu)域生物起源(translation, ribosomal structure and biogenesis)(圖3)。表4列出了在GT29中上調(diào)表達(dá)而在Yacheng 71-374中下調(diào)表達(dá)的共有差異表達(dá)蛋白。

3 討論

通過iTRAQ技術(shù)鑒定到感黑穗病后甘蔗品種GT29和Yacheng 71-374中有定量信息蛋白分別為1429個(gè)和1576個(gè), 差異表達(dá)蛋白分別為290個(gè)和125 個(gè), 遠(yuǎn)多于本課題組此前利用雙向電泳技術(shù)鑒定到甘蔗品種ROC22感黑穗病后差異表達(dá)蛋白數(shù)(18個(gè))[9], 證明了iTRAQ技術(shù)的高通量。其中抗病品種GT29的差異表達(dá)蛋白多于感病品種Yacheng 71-374, GT29在KEGG富集到的代謝通路也更多, 可能感病后抗病品種的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制更為復(fù)雜, 涉及的調(diào)控通路網(wǎng)更廣。對(duì)鑒定到的所有蛋白進(jìn)行GO注釋, 在生物過程、分子功能、細(xì)胞組分中不同功能蛋白數(shù)分布情況與蘇亞春等[7]結(jié)果一致, 但對(duì)差異表達(dá)蛋白富集分析結(jié)果則有所不同, 可能不同時(shí)期不同品種甘蔗對(duì)黑穗病應(yīng)答機(jī)制有所差異。

圖3 共有差異表達(dá)蛋白COG功能分類

表4 在GT29中上調(diào)表達(dá)、在Yacheng 71-374中下調(diào)表達(dá)的共有差異表達(dá)蛋白

-為上調(diào)表達(dá),ˉ為下調(diào)表達(dá)。-is up-regulated andˉis down-regulated.

綠色植物通過光合作用合成有機(jī)物質(zhì)和獲取能量, 是植物重要的生理活動(dòng)。許多研究表明, 植物在受到生物或非生物脅迫后, 通常光合能力受到影響, 相關(guān)參數(shù)與對(duì)照比發(fā)生變化[32-36]。沈喜等[37]通過研究感病品種和抗病品種小麥感染條銹病菌后0~12 d葉綠素含量變化顯示, 感病品種的葉綠素含量一直在下降, 而抗病品種葉綠素含量呈先下降后上升趨勢(shì), 推測(cè)抗病品種通過葉綠素機(jī)制來(lái)抵御病原菌入侵。本研究發(fā)現(xiàn), 與光合作用相關(guān)差異表達(dá)蛋白在2個(gè)甘蔗品種中大多為上調(diào)表達(dá), 且抗性品種上調(diào)表達(dá)蛋白數(shù)多于感病品種。差異表達(dá)蛋白參與了光合作用的各個(gè)方面, 如光捕獲、光傳遞、電子傳遞、維持蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、能量轉(zhuǎn)換等。推測(cè)光合作用在甘蔗感黑穗病后期免疫機(jī)制中可能起重要作用, 上調(diào)表達(dá)蛋白可能有利于修復(fù)受損的光合系統(tǒng), 進(jìn)而維護(hù)植物生長(zhǎng), 提高對(duì)病原菌抗性。

植物對(duì)各種脅迫的反應(yīng)之一是ROS的快速生成,而過量的ROS會(huì)氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸, 從而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷[38]。對(duì)于維持細(xì)胞體內(nèi)的ROS平衡, 控制過多ROS帶來(lái)的毒性影響, 植物建立了多重的抗氧化酶系統(tǒng)[39]。本研究抗性品種GT29中鑒定到POD差異表達(dá)蛋白有11個(gè)上調(diào)表達(dá), 4個(gè)下調(diào)表達(dá), 感病品種Yacheng 71-374有10個(gè)上調(diào)表達(dá), 3個(gè)下調(diào)表達(dá)。Su等[11]對(duì)甘蔗感病初期研究結(jié)果顯示, ROS相關(guān)蛋白并沒有表現(xiàn)出與抗性顯著相關(guān), 其中POD在抗性品種Yacheng 05-179中有6個(gè)上調(diào)表達(dá)蛋白, 6個(gè)下調(diào)表達(dá)蛋白, 感病品種ROC22中10個(gè)蛋白全部為上調(diào)表達(dá), 盡管如此, 本研究與其相似的是POD差異表達(dá)蛋白均在抗氧化酶系統(tǒng)中占多數(shù), 且上調(diào)表達(dá)蛋白在4個(gè)品種中數(shù)量均較多。暗示POD在甘蔗應(yīng)答黑穗病過程中可能有重要作用。POD和CAT能將H2O2分解成無(wú)毒害的H2O和O2, 兩者在一定強(qiáng)度的環(huán)境脅迫下有互補(bǔ)的作用, 后期CAT活性減弱, POD活性增強(qiáng)[40]。

植物激素將生長(zhǎng)和環(huán)境信號(hào)整合到一個(gè)精細(xì)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中, 在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用, 其不但能調(diào)控植物株型的形成, 而且能使植物適當(dāng)?shù)貞?yīng)對(duì)潛在的壓力[41]。對(duì)激素相關(guān)差異蛋白分析, 發(fā)現(xiàn)主要為ABA相關(guān)蛋白[蛋白磷酸酶2C(PP2C)、9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)]。NCED是高等植物ABA生物合成途徑的關(guān)鍵酶[42], 當(dāng)植物被誘導(dǎo)產(chǎn)生ABA后, PYR/PYL/ RCAR作為ABA信號(hào)受體, 與PP2C家族的A類蛋D結(jié)合, 釋放SnRK2s類激酶, 激活A(yù)BA信號(hào)反應(yīng)[43]。ABA相關(guān)差異蛋白均為上調(diào)表達(dá), GT29蛋白個(gè)數(shù)多于Yacheng 71-374, 顯示ABA對(duì)甘蔗抗黑穗病有重要作用, 這與Que等[44]轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。ABA能促進(jìn)植物的防御, 并參與復(fù)雜的協(xié)同和拮抗相互作用網(wǎng)絡(luò), 它在抗病中的作用取決于病原菌的類型、進(jìn)入宿主的具體方式以及防御反應(yīng)的時(shí)間和植物組織的類型[45]。ABA在植物抗病中的作用已有大量報(bào)道[46-49]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鈣信號(hào)通路在一定程度上參與了甘蔗抗病過程, Ca2+信號(hào)作為第二信使在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中也發(fā)揮著重要作用[50], 可能參與了ABA的調(diào)控。

2個(gè)甘蔗品種共有差異表達(dá)蛋白經(jīng)COG功能分類顯示在整體功能類蛋白數(shù)最多, 其中在GT29上調(diào)表達(dá)而在Yacheng 71-374下調(diào)表達(dá)的蛋白除與光合作用和活性氧代謝相關(guān)外, 還參與了多種途徑與功能。核糖體蛋白(c62874_g2; orf1、c60900_g1; orf1、c61922_g1; orf1、c53669_g1; orf1)除參與蛋白質(zhì)的生物合成外, 還具有轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA修復(fù)等功能[51]。NAD(P)H-醌氧化還原酶催化醌到氫醌的有益雙電子還原, 防止在分子氧存在下通過半醌類的氧化還原反應(yīng)形成活性氧物質(zhì)[52]。過氧化氫酶是一種有效的活性氧清除劑, 主要功能是消除在發(fā)育過程中生物/非生物脅迫產(chǎn)生的過量的過氧化氫, 同樣參與ROS代謝。蛋白c54219_g1; orf2、c70387_g2; orf1、c58104_g1; orf1、c54911_g1; orf1為光合作用相關(guān)蛋白。C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(c42694_g1; orf1、c42694_g2; orf1、c53868_g3; orf1)在C4植物中作為C4二羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶, 起著固定大氣中CO2并作為CO2泵而提高光合效率的作用; 同時(shí)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞pH, 保持離子平衡[53]。2A型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶在植物代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著多種調(diào)控作用[54]。γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶是天然維生素E合成途徑中的關(guān)鍵酶之一, 其表達(dá)及活性對(duì)決定植物維生素E的組成起著重要作用[55]。已有研究表明光合器官的維生素E在逆境如強(qiáng)光、干旱、重金屬、高溫、低溫條件下大幅升高[56]。

苯丙烷類代謝相關(guān)蛋白及一些酶(GPX、APX、SOD、GST、CAT)活性、激素(IAA、ETH、GA)在前人研究中與植物抗病相關(guān)[57], 表現(xiàn)為抗病品種在感病后表達(dá)量均比感病對(duì)照顯著增加。但在本實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)參與甘蔗的抗病過程, 可能與采樣時(shí)間有關(guān)。前人研究多為感病初期, 而各個(gè)代謝途徑產(chǎn)生作用的時(shí)間與環(huán)境、植物、病原菌自身均有聯(lián)系, 即使在十幾個(gè)小時(shí)內(nèi)也是不斷變化的[58], 這是一個(gè)復(fù)雜的代謝過程。

4 結(jié)論

感黑穗病后抗病甘蔗品種GT29的差異表達(dá)蛋白數(shù)多于感病品種Yacheng 71-374, GT29在KEGG富集到的代謝通路也更多。光合作用通路、ROS途徑、ABA、鈣信號(hào)通路相關(guān)蛋白在2個(gè)品種中多為上調(diào)表達(dá), 且GT29的上調(diào)表達(dá)蛋白數(shù)多于Yacheng 71-374, 可能參與甘蔗后期對(duì)黑穗病的應(yīng)答。植物抗病是一個(gè)復(fù)雜的過程, 需要多種功能與途徑參與調(diào)控。

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附表1 GT29差異表達(dá)蛋白GO富集分析

Supplementary table 1 Differentially expressed protein GO enrichment analysis for GT29

附表2 Yacheng 71-374差異表達(dá)蛋白GO富集分析

Supplementary table 2 Differentially expressed protein GO enrichment analysis for Yacheng 71-374

Proteomic analysis of sugarcane-interaction based on iTRAQ technique

SONG Qi-Qi1,**, Pratiksha SINGH2,**, Rajesh Kumar SINGH2, SONG Xiu-Peng1, LI Hai-Bi1, NONG You-Ye2, YANG Li-Tao1,2,*, and LI Yang-Rui1,2,*

1Sugarcane Research Center, ChineseAcademy of Agricultural Sciences / Guangxi Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and GeneticImprovement (Guangxi), Ministry of Agriculture / Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Nanning 530007, Guangxi, China;2AgriculturalCollege, GuangxiUniversity / State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Nanning 530005, Guangxi, China

Sugarcane smut has become an important disease affecting sugarcane yield and sugar content. In order to investigate the molecular mechanism of sugarcane responding to smut at protein level, the smut-resistant variety GT29 and the smut-susceptible variety Yacheng 71-374 were used in this study. Both varieties were inoculated with the teliospore suspension of smut pathogen by dipping method whereas the control was treated with sterile water. Leaf samples were collected and used for proteomic analysis by iTRAQ technique at 180 days after treatment. The that 1429 proteins presented in GT29 with quantitative information, including 290 differentially expressed proteins with 153 up-regulated and 137 down-regulated; while 1576 proteins in Yacheng 71-374 with quantitative information, including 125 differentially expressed proteins with 55 up-regulated and 70 down-regulated. The number of differentially expressed proteins in resistant variety was higher than that in susceptible variety, and GT29 enriched more metabolic pathways in KEGG, indicating that the immunomodulatory mechanism of the resistant variety may be more complicated, and the regulatory network involved in response was broader. Through the analysis of photosynthesis, antioxidant system, calcium signal, phenylpropane metabolism, hormone related differential expressed protein and co-owned differentially expressed protein, it was found that the photosynthesis pathway, ROS, ABA, calcium signal pathway related protein were up-regulated in both varieties. The up-regulated expressed proteins were more in GT29 than in Yacheng 71-374, which may be involved in resistance response in sugarcane against smut pathogen at later growth stage. Plant disease resistance is a complex process that requires multiple functions and pathways to participate in regulation. The phenylpropanoid metabolic pathway, enzymes GPX, APX, SOD, GST, and CAT, and hormones IAA, ETH, and GA were not found to be involved in the disease resistance process of sugarcane.

sugarcane; smut; iTRAQ; proteomics

2018-01-04;

2018-08-20;

2018-09-26.

10.3724/SP.J.1006.2019.84001

通信作者(Corresponding authors):李楊瑞, E-mail: lyr@gxaas.net; 楊麗濤, E-mail: litao61@hotmail.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

宋奇琦, E-mail: 2632754996@qq.com

本研究由廣西八桂學(xué)者和特聘專家專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目([2013]3號(hào)), 廣西科技基地和人才專項(xiàng)(桂科AD17195100), 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西甘蔗創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(gjnytxgxcxtd-03-01), 廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015GXNSFBA139060)和廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(16-K-02-01)資助。

This study was supported by the Guangxi Special Fund for Scientific Base and Talent (GKAD17195100), the Special Funds for Bagui Scholars and Distinguished Experts in Guangxi (2013-03), Guangxi Sugarcane Innovation Team of National Agricultural Industry Technology System (gjnytxgxcxtd-03-01), Guangxi Natural Science Fundation (2015GXNSFBA139060), and Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement (16-K-02-01).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180921.1625.006.html