周健飛 武云杰 薛 剛 張安乾 田 培 彭玉富 楊鐵釗,*

?

烤煙成熟期煙葉GS同工酶活性與氮素運(yùn)轉(zhuǎn)的關(guān)系

周健飛1武云杰1薛 剛1張安乾1田 培1彭玉富2楊鐵釗1,*

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院, 河南鄭州 450002;2河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心, 河南鄭州 450000

為研究不同氮效率烤煙品種成熟期葉片谷氨酰胺合成酶同工酶活性和相關(guān)生理指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化, 深入理解烤煙葉片氮素代謝的生理生化機(jī)制。以氮效率不同的3個(gè)烤煙品種中煙100、K326和NC89為材料進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。在不同葉齡時(shí)期取第12片葉(自下向上數(shù)), 采用Western blot方法, 測(cè)定葉片的葉肉和主脈谷氨酰胺合成酶同工酶蛋白亞基含量, 同時(shí)對(duì)葉片NH4+濃度、總氮、質(zhì)外體NH4+濃度以及氨氣揮發(fā)量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明, 烤煙葉片葉肉中的GS主要以GS2同工酶為主, 其蛋白亞基含量隨著葉齡的增長(zhǎng)逐漸下降, 而葉脈中GS1同工酶占主導(dǎo)地位, 其蛋白亞基含量呈先升高后下降的趨勢(shì)。在葉齡45~65 d, 葉肉和主脈的GS同工酶活性均表現(xiàn)為NC89>K326>中煙100, 且品種間差異達(dá)顯著水平。葉肉和主脈中GS1同工酶活性與總氮和葉片銨濃度呈負(fù)相關(guān), 與質(zhì)外體銨濃度和氨氣揮發(fā)量呈正相關(guān)。而葉肉中GS2同工酶活性與總氮和葉片銨濃度呈正相關(guān), 與質(zhì)外體銨濃度和氨氣揮發(fā)量呈負(fù)相關(guān)。葉脈GS2活性僅與總氮和氨氣揮發(fā)量有顯著相關(guān)性。氮低效烤煙品種成熟期葉片中兩種谷氨酰胺合成酶同工酶活性均較低, 氮素轉(zhuǎn)移和再利用能力差, 導(dǎo)致植株吸收的氮素以氨氣形式揮發(fā)損失量大, 葉片衰老速度較快。而氮高效品種氮素同化和再利用能力較強(qiáng), 氨氣揮發(fā)量小, 易發(fā)生貪青晚熟。

烤煙; 谷氨酰胺合成酶同工酶; 氮素代謝; 氨氣揮發(fā)

成熟期是煙葉品質(zhì)形成的關(guān)鍵時(shí)期, 氮代謝只有適時(shí)向碳代謝轉(zhuǎn)化才能形成符合工業(yè)要求的優(yōu)質(zhì)煙葉[1]。而氮代謝特性在不同基因型間存在差異[2]。我國(guó)植煙地區(qū)目前氮肥用量普遍偏多, 如遭遇生育后期較多雨水, 土壤中緩效氮和礦化氮釋放量增加, 則背離“煙株長(zhǎng)成肥退盡”的需肥規(guī)律, 不耐氮肥品種易形成難以烘烤的“黑暴”煙葉, 品質(zhì)下降。因此, 深入研究氮素利用生理生化機(jī)制, 對(duì)于篩選和培育氮素適應(yīng)范圍廣的煙草品種具有重要指導(dǎo)意義。

目前對(duì)谷氨酰胺合成酶(GS)同工酶的研究逐漸成為改良作物氮效率的熱點(diǎn)。分子生物學(xué)研究結(jié)果表明, GS同工酶在植物的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)和分配中具有重要作用[3-5]。高等植物的GS基于亞細(xì)胞定位不同可以分為兩類, 一類為定位于胞液中的GS1; 另一類為存在于葉綠體中的GS2。GS1的功能是對(duì)葉片衰老時(shí)的氮源進(jìn)行轉(zhuǎn)移及再利用, 而GS2主要對(duì)光呼吸、硝酸還原產(chǎn)生的氨進(jìn)行同化[6]。大量研究結(jié)果集中于糧食作物中GS同工酶的變化動(dòng)態(tài)以及不同氮效率品種間的差異。但不同烤煙品種葉片的GS同工酶活性及其與相關(guān)生理指標(biāo)的聯(lián)系, 以及對(duì)氮效率的影響尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)選用成熟期不同氮效率烤煙品種為試驗(yàn)材料, 采用Western-blot技術(shù)和質(zhì)外體提取等方法, 探索GS同工酶活性與相關(guān)生理指標(biāo)的關(guān)系, 進(jìn)一步研究不同氮效率品種成熟期氮素代謝機(jī)制和分子機(jī)理, 以期為篩選氮素適應(yīng)范圍廣的烤煙品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2017年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛莊農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。參試烤煙品種為中煙100 (ZY100)、K326和NC89 (成熟期氮效率為NC89>K326>ZY100[7-9])。供試土壤為黃棕壤, pH值為7.79, 含有機(jī)質(zhì)9.73 g kg–1、全氮0.96 g kg–1、速效氮68.71 mg kg–1、速效磷25.29 mg kg–1、速效鉀95.87 mg kg–1。盆栽采用聚乙烯塑料盆, 其內(nèi)徑為35 cm, 高度30 cm, 裝土18 kg。每盆植煙1株, 每個(gè)品種60盆, 重復(fù)3次。每盆施用純氮4 g, N∶P2O5∶K2O為1∶2∶3, 常規(guī)水分管理。在葉齡35、45、55、65、75 d (以幼葉長(zhǎng)1 cm, 寬0.5 cm時(shí)作為葉齡第1天)取第12片葉(自下向上數(shù))測(cè)定煙葉葉肉和主脈GS同工酶蛋白亞基含量, 同時(shí)測(cè)定葉片及質(zhì)外體相關(guān)生理指標(biāo)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 煙葉兩種GS同工酶聚合方式比較 參考文獻(xiàn)[10]中Native-PAGE的試驗(yàn)方法, 以葉齡55 d時(shí)的3個(gè)參試品種的煙葉樣品為試驗(yàn)對(duì)象。煙草葉片GS同工酶分離和酶活性檢測(cè)使用3%濃縮膠(pH 6.7)和5%分離膠(pH 8.7), 濃縮膠穩(wěn)定電壓為80 V, 分離膠穩(wěn)定電壓為120 V。上樣緩沖液pH為7.6, 由25 mmol L–1Tris-HCl、5% β-巰基乙醇、0.05%溴酚藍(lán)和50%甘油組成, 取5倍的上樣緩沖液和粗酶液混勻。電極緩沖液由25 mmol L–1Tris和192 mmol L–1甘氨酸組成, 電泳穩(wěn)定于4℃條件下進(jìn)行。

1.2.2 煙葉GS同工酶蛋白亞基含量的測(cè)定 參照Wang等[11]的試驗(yàn)方法。首先制備鮮葉片樣品粗酶液, 隨后將粗酶液與等體積的上樣緩沖液混合, 沸水浴5 min變性處理。室溫條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離(濃縮膠5%, 分離膠15%), 凝膠的制備和電泳方法參考文獻(xiàn)[10]。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行Western-blot檢測(cè), 所用抗體由貴州煙草研究院饋贈(zèng)。以蛋白Marker為標(biāo)準(zhǔn), 用Quantity One (Bio-Rad,Version4.6.2)進(jìn)行照相及光密度分析。

1.2.3 煙葉相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定 分別采用凱氏定氮法和水合茚三酮法[12]測(cè)定葉片總氮和NH4+濃度。提取質(zhì)外體和測(cè)定質(zhì)外體NH4+濃度參考文獻(xiàn)[13]的方法。采用武云杰等[14]的方法測(cè)定氨氣實(shí)際揮發(fā)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

用Microsoft Excel 2016求各測(cè)定指標(biāo)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及繪圖, 用IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行方差分析, 對(duì)各處理差異進(jìn)行LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉GS同工酶聚合方式比較

將煙葉的葉肉和主脈分離, 分別進(jìn)行其蛋白提取液Native-PAGE并結(jié)合活性染色, 葉肉和葉脈中均只觀察到1條條帶(圖1和圖2)。由于Native-PAGE是根據(jù)GS同工酶全酶相對(duì)分子量進(jìn)行分離, 說明葉片兩種GS同工酶分子量比較接近, 聚體方式一致。因此可以用Western-blot測(cè)定出的GS同工酶蛋白亞基含量來間接表征GS同工酶的活性。

圖1 葉肉GS同工酶Native-PAGE結(jié)合活性染色

1~15分別代表葉齡55 d時(shí)K326、NC89和ZY100第12片葉葉肉樣品, 每個(gè)品種5次重復(fù)。

1-15 represents the 12th leaf mesophyll sample of K326, NC89, and ZY100 at leaf age 55 days with five replicates for each species.

圖2 葉脈GS同工酶Native-PAGE結(jié)合活性染色

16~30分別代表葉齡55 d時(shí)K326、NC89和ZY100第12片葉主脈樣品, 每個(gè)品種5次重復(fù)。

16-30 represents the 12th leaf main vein sample of K326, NC89, and ZY100 at leaf age 55 days with five replicates for each species.

2.2 煙葉GS同工酶活性動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 葉肉GS同工酶活性動(dòng)態(tài)變化 由圖3可知, 烤煙葉片葉肉中的GS主要以GS2同工酶為主,其蛋白亞基含量隨著葉齡的增長(zhǎng)逐漸下降, 而GS1蛋白亞基含量呈先升高后降低的趨勢(shì)。由圖4的灰度分析結(jié)果可知, 葉齡35 d時(shí)GS1蛋白亞基含量均較低, 葉齡45 d時(shí)GS1蛋白亞基含量大幅增加, NC89、K326和ZY100分別增加了3.78、4.52和2.54倍; 隨后GS1蛋白亞基含量持續(xù)增加, 至葉齡65 d左右含量開始減少。3個(gè)參試品種在葉齡45 d至65 d的葉肉GS1蛋白亞基含量差異均達(dá)顯著水平, 差異為NC89>K326>ZY100。對(duì)于葉肉GS2蛋白亞基含量來說, 35 d至45 d降幅較緩, 45 d后大幅減少, 隨后一直呈緩慢下降趨勢(shì)。45~65 d始終表現(xiàn)為NC89>K326>ZY100, 且差異達(dá)到顯著水平。

圖3 葉肉GS同工酶活性動(dòng)態(tài)變化譜帶

1: 葉齡35 d; 2: 葉齡45 d; 3: 葉齡55 d; 4: 葉齡65 d; 5: 葉齡75 d。

1: leaf age 35 days; 2: leaf age 45 days; 3: leaf age 55 days; 4: leaf age 65 days; 5: leaf age 75 days.

圖4 葉肉GS同工酶蛋白亞基含量動(dòng)態(tài)變化

圖柱上同一時(shí)期不同字母表示在< 0.05水平上差異顯著。

Bars superscripted by different letters are significantly different at0.05 within the same period.

2.2.2 葉脈GS同工酶活性動(dòng)態(tài)變化 由圖5可知, 與葉肉不同的是, 葉脈中的GS主要以GS1同工酶為主, 其蛋白亞基含量自葉齡45 d始大幅增加, 隨后呈先升高后降低的趨勢(shì), 而GS2蛋白亞基含量一直呈逐漸降低趨勢(shì)。由圖6的灰度分析結(jié)果可知, 葉脈GS1在葉齡35 d時(shí)蛋白亞基含量較低, 45 d時(shí)含量以較大幅度增加, NC89和K326的GS1蛋白亞基含量至葉齡55 d時(shí)達(dá)到峰值, NC89分別是K326和ZY100的1.27倍和2.42倍。而ZY100在葉齡45 d時(shí)含量已最高, 隨后均呈緩慢下降趨勢(shì)。與葉肉GS1不同的是, 各品種在葉齡75 d時(shí)仍具有相對(duì)較高的葉脈GS1蛋白亞基含量。3個(gè)參試品種在葉齡45 d后葉脈GS1蛋白亞基含量差異均達(dá)顯著水平, 且NC89>K326> ZY100。對(duì)于葉脈GS2蛋白亞基含量來說, 葉齡45 d后含量大幅減少, 葉齡35~65 d始終表現(xiàn)為NC89> K326>ZY100, 且差異達(dá)到顯著水平。

圖5 葉脈GS同工酶活性動(dòng)態(tài)變化譜帶

1: 葉齡35 d; 2: 葉齡45 d; 3: 葉齡55 d; 4: 葉齡65 d; 5: 葉齡75 d。

1: leaf age 35 days; 2: leaf age 45 days; 3: leaf age 55 days; 4: leaf age 65 days; 5: leaf age 75 days.

圖6 葉脈GS同工酶蛋白亞基含量動(dòng)態(tài)變化

圖柱上同一時(shí)期不同字母表示在< 0.05水平上差異顯著。

Bars superscripted by different letters are significantly different at0.05 within the same period.

2.3 葉片總氮含量和NH4+濃度的動(dòng)態(tài)變化

總氮含量可以反映出煙葉總體的氮素水平。由圖7可知, 自35 d開始葉片總氮含量表現(xiàn)出持續(xù)下降趨勢(shì)。45~65 d均表現(xiàn)為NC89>K326>ZY100, 差異達(dá)到顯著水平。葉齡65 d時(shí)NC89總氮含量為1.89%, 分別是K326和ZY100的1.27倍和2.33倍?？偟到獍俜?jǐn)?shù)(1-最終剩余量/最大積累量)在一定程度上可以反映出煙葉氮素降解速率, NC89、K326和ZY100的總氮降解百分?jǐn)?shù)分別為47.95%、63.65%和71.13%。葉片NH4+濃度在葉齡45 d時(shí)達(dá)到最大值, 隨后濃度持續(xù)下降。55~75 d各品種間差異達(dá)到顯著水平, 且均表現(xiàn)為NC89>K326>ZY100。

圖7 葉片總氮含量和NH4+濃度的動(dòng)態(tài)變化

圖柱上同一時(shí)期不同字母表示在< 0.05水平上差異顯著。

Bars superscripted by different letters are significantly different at0.05 within the same period.

2.4 質(zhì)外體NH4+濃度和氨氣揮發(fā)量的動(dòng)態(tài)變化

質(zhì)外體被稱為NH4+的動(dòng)力池, 維持著葉片和大氣的氣體交換。若NH4+過量積累將以氨氣的形式揮發(fā)出去, 從而達(dá)到質(zhì)外體中水溶態(tài)氨和氣態(tài)氨的平衡[15]。由圖8可以看出, 質(zhì)外體NH4+濃度于55 d達(dá)到最高點(diǎn), 隨后大幅下降, 在45~65 d間始終表現(xiàn)為ZY100>K326>NC89, 其中ZY100增長(zhǎng)幅度非常大。氨氣揮發(fā)量在葉齡35 d時(shí)較低, 隨后大幅升高并于55 d達(dá)到最大值, ZY100、K326和NC89分別為28.73、17.46和10.11 μg m–2h–1, 差異達(dá)到顯著水平。隨后盡管ZY100有較大的下降幅度, 但依然顯著高于K326和NC89。

圖8 葉片質(zhì)外體NH4+濃度和氨氣揮發(fā)量的動(dòng)態(tài)變化

圖柱上同一時(shí)期不同字母表示在< 0.05水平上差異顯著。

Bars superscripted by different letters are significantly different at0.05 within the same period.

2.5 煙葉成熟期GS同工酶的蛋白亞基含量與生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

通過對(duì)葉齡35~75 d每隔10 d的葉肉和主脈的GS同工酶蛋白亞基含量與相關(guān)生理指標(biāo)作相關(guān)性分析, 由表1可知, 葉肉GS1蛋白亞基含量與質(zhì)外體銨濃度和氨氣揮發(fā)量呈正相關(guān), 與總氮和葉片銨濃度呈負(fù)相關(guān); 葉肉GS2蛋白亞基含量與葉片總氮呈極顯著正相關(guān), 與葉片銨濃度呈顯著正相關(guān), 與氨氣揮發(fā)量呈極顯著負(fù)相關(guān), 與質(zhì)外體銨濃度呈顯著負(fù)相關(guān); 葉脈GS1蛋白亞基含量與葉片氨氣揮發(fā)量呈極顯著正相關(guān), 與質(zhì)外體銨濃度呈顯著正相關(guān), 與葉片銨濃度呈極顯著負(fù)相關(guān), 與總氮呈顯著負(fù)相關(guān); 葉脈GS2蛋白亞基含量?jī)H與總氮和氨氣揮發(fā)量有顯著相關(guān)性。

表1 GS同工酶的蛋白亞基含量與生理指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)

L-NH4+: 葉片銨離子濃度; A-NH4+: 質(zhì)外體銨濃度; NH3-V: 氨氣揮發(fā)量。**和*分別表示在0.01和0.05水平上顯著相關(guān)。

L-NH4+: leaf NH4+concentration; A-NH4+: apoplastic NH4+concent-r-a-tion; NH3-V: NH3volatilization amount.**and*denote significances of correlation at the0.01 and 0.05 probability levels, respectively.

3 討論

現(xiàn)蕾打頂導(dǎo)致烤煙的源庫(kù)關(guān)系發(fā)生改變, 葉位偏下、葉齡較大的煙葉仍然是“源”, 而葉位偏上或未完全成熟的煙葉成為新的“庫(kù)”, 即生長(zhǎng)重心轉(zhuǎn)移到保留的葉片上來[16]?？緹煶墒炱谌艟哂休^低的氮素同化利用效率則不易貪青晚熟。衰老葉片降解的氮素既可以轉(zhuǎn)移到其他葉片中再利用, 亦可以通過質(zhì)外體以氨氣的形式揮發(fā)出去[14], 不同氮效率烤煙品種具有不同的氮素運(yùn)籌方式。近年來大量研究表明, 不同源庫(kù)間GS同工酶的相對(duì)含量和時(shí)空表達(dá)特性可能是造成這種差異的重要原因之一[17]。

煙葉葉肉和葉脈中兩種谷氨酰胺合成酶同工酶相對(duì)分子量較為接近, 聚體方式一致, 因此煙草GS同工酶活性可以由其蛋白亞基含量來表征。本研究中, 對(duì)于兩種GS同工酶蛋白亞基含量在葉肉和主脈的變化趨勢(shì)而言, 品種間表現(xiàn)基本一致, 說明烤煙中部葉在葉齡45 d時(shí)已完成生長(zhǎng)發(fā)育而進(jìn)入成熟時(shí)期, 氮運(yùn)轉(zhuǎn)進(jìn)入分配再利用階段, GS1活性升高開始行使其氮素再運(yùn)轉(zhuǎn)功能, 而GS2隨著葉綠體的降解活性不斷下降。GS2在葉肉中處于主導(dǎo)地位, 其活性在各時(shí)期均明顯高于GS1, 而葉脈中則是GS1處于主導(dǎo)位置, 這可能與葉綠體在葉肉中大量分布, 而葉脈中富含輸導(dǎo)組織、葉綠體含量較少有關(guān)。

成熟期氮低效烤煙品種ZY100和中等氮效率烤煙品種K326, 相對(duì)于氮高效品種NC89而言, 葉肉和葉脈中起同化作用的GS2同工酶在衰老啟動(dòng)時(shí)活性就大幅降低。ZY100的GS2活性更是低于NC89, 最終導(dǎo)致葉片降解的氮素再同化量較少, 表現(xiàn)為葉片具有較低的總氮含量和NH4+濃度, 以及較高的總氮降解百分?jǐn)?shù)。同時(shí)氮低效品種ZY100葉肉和葉脈中負(fù)責(zé)氮素再運(yùn)轉(zhuǎn)的GS1活性均較低, 可能會(huì)導(dǎo)致降解氮素向“庫(kù)”轉(zhuǎn)移的能力相對(duì)較弱。NH4+在植物體內(nèi)過量積累將產(chǎn)生毒害作用, 而本研究中葉片NH4+濃度在葉齡45 d之后持續(xù)下降, 質(zhì)外體NH4+濃度積累高峰比葉片晚10 d左右, 且氨氣揮發(fā)量在成熟期大量增加, 說明NH4+向質(zhì)外體轉(zhuǎn)移可能是一種緩解氨害積累的生理機(jī)制, 且有利于實(shí)現(xiàn)自身的氮素調(diào)虧。氮高效品種NC89在成熟期葉肉和葉脈均具有相對(duì)較高的GS1和GS2活性, 結(jié)合GS同工酶的生理功能和“源庫(kù)流”理論, 較高的氮素同化效率造成了氮同化物在“源”的富集, 為成熟期煙株的代謝提供了豐富的底物, “源”壓力較大, 同時(shí)由于其GS1活性較高, 轉(zhuǎn)運(yùn)效率高, 衰老降解的氮素被大量再利用, 致使NH4+向質(zhì)外體轉(zhuǎn)移量較少, 易導(dǎo)致貪青晚熟。源庫(kù)之間的壓力差和質(zhì)外體生理上的差異綜合導(dǎo)致了不同基因型烤煙成熟期氮素利用效率的差異。相關(guān)性分析也表明, 成熟期不同氮效率烤煙品種葉片質(zhì)外體銨濃度及氨氣揮發(fā)量與GS同工酶活性具顯著或極顯著相關(guān)性, 說明GS同工酶活性的差異是不同基因型間具有不同成熟期氮效率的主要原因之一。

最新研究表明, GS同工酶活性的調(diào)控在RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后修飾等不同水平上實(shí)現(xiàn)[18-19], 且某些轉(zhuǎn)錄因子也可以對(duì)GS的活性造成影響[20]。氮素利用效率是作物的一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀, 還需要其他調(diào)控的參與, 如外界環(huán)境條件、激素調(diào)控等, 這些都是下一步研究工作的方向和重點(diǎn)。

4 結(jié)論

氮低效烤煙品種成熟期GS同工酶活性在葉肉和葉脈中均較低, 氮素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解速度快且轉(zhuǎn)移再利用能力弱, NH4+向質(zhì)外體轉(zhuǎn)移能力強(qiáng), 從而以氨氣大量揮發(fā)的形式實(shí)現(xiàn)氮素調(diào)虧。而氮高效品種與其恰好相反, 生育后期在高氮條件下容易貪青晚熟。葉片GS同工酶活性最終決定了不同烤煙品種的氮素代謝能力和衰老特性。本研究對(duì)于解釋烤煙品種氮代謝差異以及成熟期氮低效品種的選育具有一定的指導(dǎo)作用。

[1] 史宏志, 韓錦峰. 烤煙碳氮代謝幾個(gè)問題的探討. 煙草科技, 1998, 129(2): 34–36. Shi H Z, Han J F. Discussion on several problems of carbon and nitrogen metabolism in flue-cured tobacco., 1998, 129(2): 34–36 (in Chinese).

[2] 嚴(yán)小龍, 張福鎖. 植物營(yíng)養(yǎng)遺傳. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1997. pp 78–106. Yan X L, Zhang F S. Genetics of Plant Nutrition. Beijing: China Agriculture Press, 1997. pp 78–106 (in Chinese).

[3] Hirel B, Andrieu B, Renard S, Quillere I, Chelle M, Pommel B, Fournier C. Physiology of maize II: Identification of physiological markers representative of the nitrogen status of maize () leaves during grain filling., 2005, 124: 178–188.

[4] Fei H, Chaillou S, Hirel B, Polowick P, Mahon J, Vessey J. Effects of the overexpression of a soybean cytosolic glutamine synthetase gene () linked to organ-specific promoters on growth and nitrogen accumulation of pea plants supplied with ammonium., 2006, 44: 543–550.

[5] Li X P, Zhao X Q, He X, Zhao G Y, Li B, Liu D C, Zhang A M, Zhang X Y, Tong Y P, Li Z S. Haplotype analysis of the genes encoding glutamine synthetase plastic isoforms and their association with nitrogen-use and yield-related traits in bread wheat., 2011, 189: 449–458.

[6] 鄧揚(yáng)悟. 甜瓜谷氨酰胺合成酶基因的克隆和功能研究. 上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文, 上海, 2010. Deng Y W. Cloning and Characterization of Glutamine Synthetase Genes in Melon. PhD Dissertation of Shanghai JiaoTong University, Shanghai, China, 2010 (in Chinese with English abstract).

[7] 盧素萍, 李玉娥, 劉鵬飛, 趙銘欽, 張渝婕, 李志鵬. 氮用量對(duì)南陽不同基因型烤煙煙葉品質(zhì)的影響. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 38: 67–73. Lu S P, Li Y E, Liu P F, Zhao M Q, Zhang Y J, Li Z P. Effects of nitrogen fertilizer on quality of different genotypes of flue-cured tobacco in Nanyang county., 2016, 38: 67–73 (in Chinese with English abstract).

[8] 崔昌范, 王書凱, 宋立君. 烤煙新品種K326和NC89特征特性及配套栽培技術(shù)規(guī)范. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 21(1): 70–75. Cui C F, Wang S K, Song L J. Characteristics of flue-cured tobacco new varieties K326 and NC89 and their cultivation techniques., 1999, 21(1): 70–75 (in Chinese).

[9] 武云杰, 李飛, 楊鐵釗, 張小全. 氮素營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)衰老期煙葉氮代謝的影響及品種間差異. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào), 2014, 20(4): 41–47. Wu Y J, Li F, Yang T Z, Zhang X Q. Effects of nitrogen nutrition on nitrogen metabolism in flue-cured tobacco leaves and differences among varieties., 2014, 20(4): 41–47 (in Chinese with English abstract).

[10] 黃培堂. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2007. pp 155–157. Huang P T. The Condensed Protocols from Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Beijing: Chemical Industry Press, 2007. pp 155–157 (in Chinese).

[11] Wang X, Wei Y, Shi L, Ma X, Theg S. New isoforms and assembly of glutamine synthetase in the leaf of wheat (L.)., 2015, 66: 6827–6834.

[12] 鄒琦. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo). 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2000. pp 56–89. Zou Q. The Guidance of Plant Physiology Experiment. Beijing: China Agriculture Press, 2000. pp 56–89 (in Chinese).

[13] 段旺軍, 楊鐵釗, 劉化冰, 張小全, 戴亞, 李東亮. 煙葉氨氣補(bǔ)償點(diǎn)的品種間差異及其與氮素代謝的關(guān)系研究. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2011, 17: 419–424. Duan W J, Yang T Z, Liu H B, Zhang X Q, Dai Y, Li D L. Differences in NH3compensation point among tobacco (L.) cultivars and its relationship with nitrogen metabolism., 2011, 17: 419–424 (in Chinese with English abstract).

[14] 武云杰, 楊鐵釗, 張小全, 李飛, 李麗華. 不同烤煙品種煙葉衰老期氨氣揮發(fā)及其與氮素代謝的相關(guān)性. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46: 4027–4034. Wu Y J, Yang T Z, Zhang X Q, Li F, Li L H. Study on correlation between ammonia volatilization and nitrogen metabolism during the tobacco leaves senescence., 2013, 46: 4027–4034 (in Chinese with English abstract).

[15] Nielsen K H, Schjoerring J K. Regulation of apoplastic NH4+concentration in leaves of oilseed rape., 1998, 118: 1361–1368.

[16] 范江, 楊繼洪, 王守旗, 肖志新, 梁梅, 李海平, 邱堯. 打頂對(duì)烤煙生長(zhǎng)和各器官煙堿積累分配的影響. 作物研究, 2016, 30(1): 36–40. Fan J, Yang J H, Wang S Q, Xiao Z X, Liang M, Li H P, Qiu Y. Effect of topping on growth of flue-cured tobacco and nicotine accumulation and distribution in different organs., 2016, 30(1): 36–40 (in Chinese with English abstract).

[17] 王云華, 歐吉權(quán), 王志強(qiáng), 周忠新, 歐陽敏, 張楚富. 黃瓜(L.)子葉發(fā)育過程中谷氨酰胺合成酶同工酶的變化. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版), 2005, 51: 517–520. Wang Y H, Ou J Q, Wang Z Q, Zhou Z X, Ou Y M, Zhang C F. Changes of glutamine synthetase isozymes during the development of cucumber (L.) cotyledons.(Nat Sci Edn), 2005, 51: 517–520(in Chinese with English abstract).

[18] Rueda-López M, Crespillo R, Cánovas F M, Avila C. Differential regulation of two glutamine synthetase genes by a single Dof transcription factor., 2008, 56: 73–85.

[19] Stanulovi? V S, Garcia R M, Labruyère W T, Ruijter J M, Hakvoort T B M, Lamers W H. The 3'-UTR of the glutamine-synthetase gene interacts specifically with upstream regulatory elements, contains mRNA-instbility elements and is involved in glutamine sensing., 2006, 88: 1255–1264.

[20] Kumar R, Taware R, Gaur V S, Guru S K, Kumar A. Influence of nitrogen on the expression of TaDof1 transcription factor in wheat and its relationship with photo synthetic and ammonium assimilating efficiency., 2009, 36: 2209–2216.

Relationship between GS isoenzyme activity and nitrogen transportation in flue-cured tobacco leaves

ZHOU Jian-Fei1, WU Yun-Jie1, XUE Gang1, ZHANG An-Qian1, TIAN Pei1, PENG Yu-Fu2, and YANG Tie-Zhao1,*

1College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China;2Technical Center, Henan Tobacco Industry Co., Ltd., Zhengzhou 450000, Henan, China

A pot experiment was conducted to study the dynamic changes of glutamine synthetase isoenzyme activity and the related physiological indexes in leaves of flue-cured tobacco with different nitrogen efficiencies at maturity stage, and understand the physiological and biochemical mechanism of nitrogen metabolism in flue-cured tobacco leaves. Three different flue-cured tobacco varieties Zhongyan 100, K326, and NC89 with different nitrogen efficiencies were used as materials, and the 12th leaves were taken at different leaf ages. Western blot method was used to determine the content of glutamine synthetase isoenzyme isoforms in leaf mesophyll and main veins. At the same time, the concentrations of NH4+, total nitrogen, apoplastic NH4+and ammonia volatilization were determined. The results show, GS2 was the main form of GS isoenzyme in mesophyll of flue-cured tobacco leaves, the protein subunit content gradually decreased with the age of the leaf. The GS1 isoenzyme dominated in the veins, and its protein subunits showed a trend of increasing first and then decreasing. From 45 to 65 days of leaf age, the GS isoenzyme activities of leaf mesophyll and main vein were all expressed as NC89 > K326 > Zhongyan 100, and the difference among varieties was significant. The activities of GS1 in mesophyll and main veins were negatively correlated with total nitrogen and leaf ammonium concentrations, and positively correlated with apoplastic ammonium concentration and ammonia volatilization. The GS2 activity in mesophyll was positively correlated with total nitrogen and leaf ammonium, and negatively correlated with apoplastic ammonium concentration and ammonia volatilization. The GS2 activity of leaf veins was only significantly correlated with the total nitrogen and ammonia volatilization. The activity of two glutamine synthetase isoenzymes in leaves of nitrogen-inefficient flue-cured tobacco varieties at the mature period was lower, and the ability of nitrogen transfer and reuse was poor, resulting in most of the nitrogen absorbed by plants evaporated in the form of ammonia, and the leaves had a faster rate of aging. However, nitrogen efficient varieties had strong nitrogen reutilization capacity, so the ammonia volatilization was small and the aging was postponed.

flue-cured tobacco;glutamine synthetase isozyme; nitrogen metabolism; ammonia volatilization

2018-04-12;

2018-08-20;

2018-09-14.

10.3724/SP.J.1006.2019.84054

通信作者(Corresponding author): 楊鐵釗, E-mail: yangtiezhao@126.com

E-mail: ndzhoujianfei@163.com

本研究由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目(HNZY102015004)和河南省煙草公司科技項(xiàng)目(2018410000270035)資助。

This study was supported by the Henan Tobacco Industry Co., Ltd.Science and Technology Project (HNZY102015004) and Henan Tobacco Company Science and Technology Project (2018410000270035).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180912.1609.004.html