張慶田　范書田　艾軍　秦紅艷

摘要：為更好了解L-半乳糖內(nèi)酯脫氫酶及編碼基因在軟棗獼猴桃中的生理功能及作用，以 ‘魁綠軟棗獼猴桃果實cDNA為模板，用RT-PCR及RACE技術，獲得L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯脫氫酶基因AaGalLDH（GenBank：KP145007.1）。序列分析表明該基因全長為2 394 bp，開放閱讀框為1 833 bp，編碼610個氨基酸，與其它植物GalLDH氨基酸序列具有78%～95%的同源性。編碼的蛋白序列具有GalLDH蛋白家族典型的保守結構域。進一步將該基因連接到原核表達載體并轉化大腸桿菌進行誘導表達，經(jīng)Western Blotting驗證，目的基因在pET-28a表達系統(tǒng)中有表達，但基本為不溶性表達。這為進一步研究該酶蛋白的體外表達和功能以及選育高品質軟棗獼猴桃品種奠定了基礎。

關鍵詞：軟棗獼猴桃;L-半乳糖內(nèi)酯脫氫酶（GalLDH）;維生素C;克隆;基因表達

中圖分類號：S663.4：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）11-0001-07

Cloning and Prokaryotic Expression Analysis of L-Galactono-1，

4-Lactone Dehydrogenase in Actinidia arguta

Zhang Qingtian1， Fan Shutian2， Ai Jun2， Qin Hongyan2

（1. Shandong Institute of Pomology， Taian 271000， China;

2. Institute of Special Animal and Plant Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changchun 130000， China）

Abstract In order to better understand the physiological function of L-galactono-1， 4-lactone dehydrogenase and coding gene in Actinidia arguta， 2 394 bp cDNA encoding L-galactono-1， 4-lactone dehydrogenase （GalLDH） fragment was cloned from fruit of A. arguta Planch by the method of RT-PCR and RACE， named AaGalLDH （GenBank： KP145007.1）. Sequence analysis showed that the open reading frame was 1 833 bp， encoding 610 amino acids， and had 78% to 95% homology with other plants GalLDH amino acid sequences. The encoded protein sequence had a typical conservative domain of the GalLDH protein family. The gene was constructed to the prokaryotic expression vector and transformed into E. coli for induction expression. The target gene was expressed in the pET-28a expression system， but it was basically insoluble after Western Blotting verified. This had laid the foundation for further research on the expression and function of the enzyme protein in vitro and the selection of high-quality varieties.

Keywords Actinidia arguta; L-galactono-1， 4-lactone dehydrogenase （GalLDH）; Ascorbic acid （AsA）; Cloning; Gene expression

維生素C （Vitamin C），又稱L-抗壞血酸（L-ascorbic acid， AsA），是一種水溶性的己糖內(nèi)酯小分子化合物[1，2]，具有增強機體免疫力、抑制腫瘤生長[3-6]，保護視網(wǎng)膜、治療眼部疾病[7-10]和抗菌消炎、輔助治療腎病綜合征、預防動脈粥樣硬化等作用[11-13]。人體自身無法合成與儲存VC，只能從外界食物中得到，因此，VC含量的多少可以作為衡量園藝產(chǎn)品品質的重要指標之一。研究表明，植物中VC合成可能存在4條途徑[14]，以Smirnoff-Wheeler提出的L-半乳糖合成途徑占主導地位[15]。該途徑中，L-半乳糖內(nèi)酯脫氫酶（GalLDH）作為關鍵酶可直接氧化半乳糖內(nèi)酯形成AsA，是所有合成相關酶中研究較多的一個酶[16]。

軟棗獼猴桃[Actinidia arguta（Sieb.et Zucc.） Planch. ex Miq.]為獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）多年生落葉木質藤本果樹，大多分布于我國東北、華北、西北及長江流域，以東北三省的資源最為豐富[17]。其果實品質優(yōu)良、酸甜適口、風味獨特、營養(yǎng)豐富，VC含量高達4.3 mg/g[18]。而較高的VC含量可能預示其存在特殊的合成機制。目前，GalLDH基因已在茶樹、美味獼猴桃、毛花獼猴桃等植物中得到克隆，但軟棗獼猴桃中未見報道。本研究擬從軟棗獼猴桃中克隆GalLDH基因，并解析其基因基礎，旨在為下一步開展軟棗獼猴桃AsA代謝分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試‘魁綠軟棗獼猴桃種植于中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所軟棗獼猴桃資源圃。取果實樣品，液氮速凍后-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

PrimeSTAR? HS（Premix）、cDNA第一鏈合成試劑盒、膠回收試劑盒、載體連接試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司;RACE 試劑盒購于 Clontech 公司;其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 軟棗獼猴桃總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成

總RNA提取緩沖液的配制參照Jaakola等[19]的方法，使用前需65℃預熱，并加入3%的β-巰基乙醇。其它提取操作過程參照裴嘉博等[20]的方法進行。取1～5 μg總RNA，參照反轉錄試劑盒說明書進行操作，合成第一鏈cDNA。

1.4 軟棗獼猴桃GalLDH基因cDNA片段的克隆

根據(jù)GenBank中已有植物GalLDH基因保守序列設計引物（F：5′-CTTCTATCTTGCTCGCTGT-3′;R：5′-CGTGCTTGATTGTATGTATCCAC-3′），由吉林省庫美生物科技有限公司合成。以第一鏈cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系（20 μL）： 第1鏈cDNA 1 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，PrimeSTAR? HS 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR擴增條件：94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min， 34個循環(huán);72℃延伸10 min。將PCR特異產(chǎn)物回收純化后送至吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.5 軟棗獼猴桃GalLDH基因全長克隆

根據(jù)得到的GalLDH保守核心區(qū)段序列，設計基因特異引物GSP1（3′-RACE引物）： 5′-CTATCAGAGAACAAGCACGTA-3′和GSP2 （5′-RACE引物）： 5′-CGTCCTTGTCCTTCGGAACCTCA-3′。利用Clontech公司的SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit進行擴增，退火溫度為65℃。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收試劑盒回收后測序。利用Vector NTI Suite 9.0軟件去除載體序列，將5′-RACE 和3′-RACE 測序結果拼接獲得GalLDH基因全長序列。

1.6 序列特征分析

利用DNAStar軟件對獲得的GalLDH基因全長序列進行開放閱讀框（ORF）分析，并得到氨基酸序列。蛋白質的分子量、等電點及基本性質用ProtParam （https：//web.expasy.org/protparam/）預測;利用SOPMA 在線程序預測蛋白質二級結構。通過Pfam 32.0（http：//pfam.xfam.org/）對蛋白質的結構域進行分析;通過NCBI網(wǎng)站BLAST，選擇與軟棗獼猴桃GalLDH同源性較高的其它植物GalLDH，用BioEdit軟件進行多序列比對，MEGA軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 原核表達載體構建

根據(jù)得到的GalLDH基因全長設計原核表達引物 Gal-S：5′-GGAATTCCATATGATGTTCCGAGCTCTCATTCTCCGGCG-3′（下劃線為內(nèi)切酶Nde Ⅰ識別位點）和Gal-AS：5′-ACGCGTCGACTCAAATTTTTTCAGACAGTGGGAATAA-3′（下劃線為內(nèi)切酶SalⅠ識別位點）。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測、切膠回收后，連接到pEASY克隆載體。將測序正確的質粒與pET-28a質粒分別進行雙酶切。分別回收酶切目的片段和pET-28a載體片段，并于16℃下連接過夜。連接體系：酶切后的pET-28a 3 μL、酶切后的目的片段3 μL、10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、ddH2O 11 μL，后將連接產(chǎn)物轉化至DH5α菌株感受態(tài)細胞中，提取質粒，經(jīng)雙酶切篩選正確后測序。測序構建成功的表達質粒命名為軟棗獼猴桃pET-28a-GalLDH，轉化至BL21（DE3） 表達菌株中培養(yǎng)。

1.8 軟棗獼猴桃GalLDH基因的原核表達及Western Blotting 驗證

取30 μL 大腸桿菌菌株BL21（DE3）轉pET-28a-GalLDH菌液涂布于含50 μg/mL Kan的LB平板進行培養(yǎng)，對照大腸桿菌菌株BL21（DE3）轉空載體pET-28a（+）進行同樣操作。挑取單菌落至2 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL Kan）中，37℃進行種培養(yǎng);分別在玻璃試管中添加5 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL Kan），添加種培養(yǎng)菌液100 μL。37℃培養(yǎng)至OD600值約為0.6，添加150 mmol/L IPTG 33 μL（終濃度1 mmol/L IPTG）進行誘導，37℃培養(yǎng)4 h后收集菌體加入320 μL PBS懸濁液并超聲波破碎，經(jīng)離心分離（12 000 r/min，10 min），取各抽提液（全蛋白、上清、沉淀）8 μL，加入2 μL 5×SDS Loading Buffer，99℃加熱10 min，進行SDS-PAGE 電泳。

取各抽提液（全蛋白、上清、沉淀）8 μL，加入2 μL 5×SDS Loading Buffer，95℃加熱10 min，使用彩色Marker及組氨酸標簽Marker，進行SDS-PAGE電泳。將 PVDF膜、濾紙分別剪切成與凝膠相同大小，使用轉膜緩沖液處理后，按濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙的順序依次放在轉膜儀電極板之間，開始轉膜。將PVDF膜置于含1.5% BSA的10 mL Blocking Buffer中，44℃平放過夜封閉。 使用稀釋后的Penta - His Antibody溶液5 mL，進行一次抗體反應1 h。TBST 緩沖液（20 mL）洗滌兩次;洗滌TBS 緩沖液沖洗3次。 使用稀釋后的HRP- Rabbit Anti- Mouse IgG抗體溶液5 mL，進行二次抗體反應1 h。TBST緩沖液（20 mL）洗滌兩次;洗滌TBS緩沖液洗沖洗3次。1 mL TrueBlue Peroxidase Substrate 顯色 1 min。

2 結果與分析

2.1 軟棗獼猴桃GalLDH基因的RT-PCR擴增

參照其它植物RNA提取方法，本研究提取RNA結果如圖1所示，28S和18S條帶較亮，且28S亮度約為18S的兩倍，表明RNA提取質量較好。以反轉錄得到的cDNA為模板，經(jīng)保守區(qū)PCR擴增，獲得約1 000 bp的特異片斷（圖2），與預期片段大小相近。產(chǎn)物經(jīng)測序后利用NCBI中BLAST程序進行同源比對，發(fā)現(xiàn)其與美味獼猴桃 （Actinidia deliciosa）和毛花獼猴桃（Actinidia eriantha） GalLDH基因的相似性分別為98%、97%。因此，初步認定擴增片段為軟棗獼猴桃GalLDH基因片段。

2.2 cDNA全長序列克隆及生物信息學分析

參照RACE試劑盒說明書分別進行5′-RACE和3′-RACE擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)回收后克隆測序，再拼接獲得cDNA全長。應用DNAStar和ProtParam程序對獲得的cDNA全長序列進行開放閱讀框分析，得到氨基酸序列。結果顯示，該基因全長2 394 bp（GenBank：KP145007.1），開放閱讀框1 833 bp，編碼610個氨基酸，分子量為69 309.5 Da，等電點為8.68。負電荷殘基（Asp+Glu）數(shù)為75個，正電荷殘基（Arg+Lys）數(shù)為81個。不穩(wěn)定系數(shù)為51.41，為不穩(wěn)定蛋白質。AaGalLDH具有3個跨膜區(qū)（transmembrane region），分別位于68～86（19）、265～287（23）、322～343（22）個氨基酸之間;在氨基酸序列123～258之間，AaGalLDH含有1個典型的黃素腺嘌呤二核苷酸結合域（FAD-binding region），在282～603部位含有1個ALO結構域。蛋白質二級結構預測發(fā)現(xiàn)，AaGalLDH蛋白以α-螺旋（alpha helix） 和自由卷曲（random coil）結構為主，分別占41.64%、39.34%，延伸鏈（extended strand）和β-轉角（beta turn） 結構分別占13.93%、5.08%。

2.3 不同植物GalLDH氨基酸序列比較分析

用推導的軟棗獼猴桃GalLDH氨基酸序列與其它物種進行同源性比較得出，其與中華獼猴桃（PSS01756.1） 氨基酸序列相似性為95%、茶（AHB11182.1）為79%、芝麻（XP_011075395.2）為79%、葡萄（ACN59217.1）為80%、番木瓜（XP_021908679.1）為79%、甜櫻桃（XP_021830036.1）為79%、蓖麻（EEF30888.1）為79% 、蘋果（NP_001315785.1）為78%、橙為（XP_024948405.1）78%。利用BioEdit軟件對上述GalLDH序列做多序列比對分析（圖3），結果顯示3′端序列保守性較高，5′端序列變化明顯，差異較大。其中軟棗獼猴桃與中華獼猴桃GalLDH氨基酸序列存在18處位點差異，其中15處為單位點置換突變，1處為雙位點變化，1處6個組氨酸缺失，1處2個脯氨酸缺失和3個氨基酸置換。系統(tǒng)進化樹結果（圖4）表明，軟棗獼猴桃與中華獼猴桃聚在一起，表明兩者GalLDH進化關系最近。茶、葡萄、芝麻與軟棗獼猴桃的進化關系也較近，而與甜櫻桃、蘋果等的進化關系較遠。

2.4 軟棗獼猴桃GalLDH基因原核表達及Western Blotting雜交鑒定

由圖5可以看出，經(jīng)過IPTG誘導，大腸桿菌菌株BL21（DE3）轉pET-28a-GalLDH菌液的重組質粒全細胞、重組質粒沉淀均產(chǎn)生1條約70 kDa的蛋白條帶，與理論融合蛋白的分子量一致，表明GalLDH基因已經(jīng)在大腸桿菌中成功表達;上清液中檢測不到目的蛋白。

通過Western Blotting驗證，目的基因在pET-28a表達系統(tǒng)中有表達，但基本為不溶性表達（圖6）。

3 討論

抗壞血酸是動植物生長發(fā)育所必需的微量營養(yǎng)素，在生命過程中發(fā)揮重要生理功能，特別是在抵抗逆境脅迫反應中具有重要作用[21]，這也正是人們關心和研究植物合成和積累AsA的主要原因。研究表明，L-半乳糖途徑是高等植物合成AsA的主要途徑，其在西瓜[22]、番茄[23]、刺梨[24]、枸杞[25]、柚[26]、黃瓜[27]、毛花獼猴桃[28]等果實的AsA代謝機制均已見報道，擬南芥甚至將其作為唯一的AsA合成途徑[29]。過表達GalLDH的煙草BY-2細胞系中，GalLDH活性和VC含量呈顯著正相關[30]。甜瓜果實生長發(fā)育過程中，GalLDH基因的表達也與VC含量的變化趨勢正相關， 含量高的組織中基因表達也相對較高[22]。軟棗獼猴桃作為VC含量較高的新興果樹，發(fā)掘和驗證AsA生物合成途徑中的關鍵基因（酶），能夠為將來定向育種、調(diào)控植物VC含量和提高果實品質提供分子輔助手段。本研究從軟棗獼猴桃果實中克隆到AaGalLDH基因全長（GenBank：KP145007.1），其含有1個典型的該基因在所有植物中都保守的FAD結合域‘VGSGLSP和1個ALO結構域;存在有信號肽的切割位點FR/YA，與已克隆的其它植物GalLDH氨基酸序列同源性為78%～95%;AaGalLDH具有3個預測的跨膜區(qū)。其中，蛋白位置及氨基酸殘基數(shù)與番茄、辣椒、煙草、甘薯、白菜均相似，可以推定具有相似的結構與功能[31]。

受環(huán)境和自身特性的影響，從植物體內(nèi)提取某些物質費時費力。隨著基因工程技術的發(fā)展，利用原核表達系統(tǒng)將外源基因整合到高效表達載體中進行生物大分子的體外制備成為可能，該方法具有高效、快速、規(guī)?；a(chǎn)等特點[32，33]，在分子生物學和食品工業(yè)領域的應用日益廣泛。本研究使用含T7啟動子能特異表達目的蛋白的pET系統(tǒng)，成功構建軟棗獼猴桃GalLDH基因原核表達載體，經(jīng)IPTG誘導，在大腸桿菌BL21中成功表達含His標簽的重組融合蛋白。為進一步研究GalLDH的體內(nèi)蛋白水平的表達狀況與調(diào)控機制、體外表達與制備以及揭示軟棗獼猴桃果實高VC含量合成與積累的分子機制奠定基礎。

4 結論

本研究首次從軟棗獼猴桃中獲得L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯脫氫酶基因的ORF序列，該序列全長1 833 bp，編碼610個氨基酸，與其它植物GalLDH氨基酸序列具有78%～95%的同源性。將該基因連接到原核表達載體并轉化大腸桿菌進行誘導表達，重組GalLDH蛋白在IPTG終濃度1 mmol/L、37℃誘導4 h條件下可高表達。

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收稿日期：2019-07-30

基金項目：山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目（CXGC2016A03，CXGC2018D05）;吉林省科技發(fā)展計劃項目（20170203006NY）

作者簡介：張慶田（1981—），男，碩士，助理研究員，主要從事果樹資源評價與育種研究。E-mail：88327195@qq.com

通訊作者：秦紅艷（1984—），女，博士，助理研究員，主要從事經(jīng)濟植物種質資源評價與利用研究。E-mail：qinyan11@163.com