李光艷　吳斌　張眉　王升吉　竺曉平　杜振翠　辛相啟　姜珊珊

摘要：以濟(jì)麥22和臨麥4號小麥葉片為材料進(jìn)行離體培養(yǎng)試驗，通過添加1/2MS、霍格蘭營養(yǎng)液（Hoagland）、6-芐氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）分析不同培養(yǎng)條件下小麥離體葉片葉綠素及植物總蛋白的變化，建立適用于兩個品種的離體培養(yǎng)體系。結(jié)果表明，篩選的培養(yǎng)體系中1/2MS液體培養(yǎng)基最適用于濟(jì)麥22和臨麥4號，葉片離體培養(yǎng)10 d內(nèi)可保持生理活性穩(wěn)定;霍格蘭營養(yǎng)液僅適用于臨麥4號;1/2MS液體培養(yǎng)基添加6-BA后葉片SPAD值及總蛋白含量增加，濃度25 mg/L時效果最佳，離體培養(yǎng)14 d葉片仍可保持良好的生理活性。本研究建立了適用于濟(jì)麥22和臨麥4號的葉片離體培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步開展小麥抗病性研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小麥;離體葉片;1/2MS;6-BA;SPAD

中圖分類號：S512.103.53文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）11-0013-05

Establishment and Optimization of Culture

Conditions of Detached Wheat Leaves

Li Guangyan1，2， Wu Bin1， Zhang Mei1， Wang Shengji1，

Zhu Xiaopin2， Du Zhencui3， Xin Xiangqi1， Jiang Shanshan1

（1. Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong

Key Laboratory of Plant Virology， Jinan 250100，China;

2. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China;

3. Junan Plant Protection Station， Junan 276600， China）

Abstract Experiments on detached leaves of Jimai 22 and Linmai 4 were carried out. The effects of different culture conditions by adding 1/2MS， Hoagland and 6-BA on the changes of chlorophyll and total protein of detached wheat leaves were studied， and the culture conditions suitable for Jimai 22 and Linmai 4 were established. The results indicated that 1/2MS liquid medium was most suitable for Jimai 22 and Linmai 4 among all the selected culture conditions， and the physiological activity remained stable within 10 days. Hoagland nutrient solution was only suitable for Linmai 4. SPAD value and total protein content of detached leaves in 1/2MS liquid medium increased after adding 6-BA at the optimum concentration of 25 mg/L， and the leaves cultured in vitro for 14 days still maintained better physiological activity. This study established culture conditions suitable for Jimai 22 and Linmai 4 and could provide scientific references for further research on wheat disease resistance.

Keywords Wheat; Detached leaves; 1/2MS; 6-BA; SPAD

生物界中很多植物病原菌都是活體營養(yǎng)的專性寄生菌，只能在活體上侵染繁殖，建立離體葉片培養(yǎng)體系可加速植物抗病蟲害研究。利用離體葉片可突破季節(jié)、溫度、濕度等環(huán)境因素的限制，具有快速高效、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)勢，已在水稻、西瓜、甜瓜等農(nóng)作物品種抗性鑒定中廣泛應(yīng)用[1-3]。

葉片離體后依靠呼吸作用維持正常生命活動，若無外源營養(yǎng)物質(zhì)輸送，細(xì)胞活性會逐漸降低，葉片黃化，光合能力下降，葉綠素、蛋白質(zhì)等逐漸降解，直至衰老死亡[1，4，5]。因此，如何維持葉片生理活性、延緩衰老是建立離體培養(yǎng)體系的重點之一。葉綠素和可溶性蛋白含量等常作為葉片衰老的監(jiān)測指標(biāo)。氮素作為植物生長發(fā)育最重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，也是葉綠素合成途徑的重要影響因子[6]，提供外源氮素可減緩離體葉片衰老。6-芐氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）是一種人工合成的細(xì)胞分裂素，可通過刺激細(xì)胞分裂引發(fā)植物生長和發(fā)育，并可改善葉片光系統(tǒng)性能，提高光合性能，使衰老過程中的葉片維持較高的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性，減少丙二醛（MDA）積累，從而顯著降低膜脂過氧化過程，阻止自由基的形成，進(jìn)而延緩植物衰老[7]。研究表明，用6-BA處理小麥幼苗后，葉片葉綠素a、b及總量均明顯增加，降解速度減緩[8，9];利用6-BA處理馬鈴薯扦插苗可促進(jìn)葉片生長，提高葉綠素含量[10]。

小麥?zhǔn)俏覈饕募Z食作物之一，病原菌種類繁多，白粉病、銹病、病毒病等常年發(fā)生。建立有效的小麥葉片離體培養(yǎng)體系，可為小麥抗病研究提供便利[11，12]。本研究通過測定不同離體培養(yǎng)條件下濟(jì)麥22和臨麥4號葉片的SPAD值和植物總蛋白含量，分別篩選出適用于濟(jì)麥22和臨麥4號小麥葉片的離體培養(yǎng)體系，以期為后續(xù)開展小麥抗病性研究等提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種為濟(jì)麥22和臨麥4號。挑取大小均一的小麥種子，去離子水浸泡催芽，露白后均勻播種到培養(yǎng)缽中，置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為24℃、16 h光照/8 h黑暗;待長到2～3葉期時，取同葉位大小一致的葉片進(jìn)行試驗。

1.2 主要試劑

6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、瓊脂粉（agar）購自生工生物工程（上海）股份有限公司; 植物凝膠（phytagel）購自Sigma公司;MS培養(yǎng)基、霍格蘭營養(yǎng)液購自青島日水生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葉片離體培養(yǎng)條件設(shè)置 共設(shè)置5個處理，分別為1/2MS液體培養(yǎng)基（1/2MS）、添加1.5 g/L 瓊脂的1/2MS固體培養(yǎng)基（1/2MS+A）、添加3.0 g/L 植物凝膠的1/2MS固體培養(yǎng)基（1/2MS+P）、霍格蘭營養(yǎng)液（Hoagland）和H2O。取完全展開的小麥葉片從葉基部剪下，用酒精棉球?qū)⑷~基部進(jìn)行表面消毒，然后置入培養(yǎng)基并于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每處理設(shè)置10次重復(fù)，每兩天更換一次培養(yǎng)基。

1.3.2 6-BA濃度篩選 配制100 mg/L 6-BA儲存液，按照0.25、2.50、25.00、50.00 mg/L的工作濃度分別加入1/2MS液體培養(yǎng)基中，以不加6-BA的1/2MS液體培養(yǎng)基作為空白對照。小麥葉片處理同上，每處理設(shè)置10次重復(fù)，每兩天更換一次培養(yǎng)基。

1.3.3 小麥SPAD值測定 利用SPAD 502葉綠素含量測定儀（日本柯尼卡）測試小麥葉片的SPAD值，在葉片中部進(jìn)行測試，每兩天測一次，每片葉重復(fù)測3遍。

1.3.4 植物總蛋白檢測 稱取植物樣品0.1 g，經(jīng)液氮速凍研磨后加入蛋白質(zhì)提取液（100 mmol/L Tris-HCl、6% SDS、2% β-mercaptoethanol）提取植物總蛋白。配制12% SDS-PAGE膠，蛋白樣品經(jīng)電泳后用考馬斯亮藍(lán)G-250染色液染色1 h，脫色至蛋白條帶清晰后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照及分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel、GraphPad Prism 8和Photoshop 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 濟(jì)麥22葉片離體培養(yǎng)條件篩選

對不同培養(yǎng)條件下濟(jì)麥22離體葉片進(jìn)行SPAD值和總蛋白檢測，結(jié)果（圖1A）顯示，離體培養(yǎng)前2 d各培養(yǎng)條件下濟(jì)麥22葉片SPAD值相差不大，都只有小幅度降低;2 d后，1/2MS+A處理開始明顯下降;4 d后，1/2MS+P、H2O處理快速降低，Hoagland處理也開始緩慢降低;6 d后Hoagland營養(yǎng)液和H2O中的葉片SPAD值下降幅度較大。1/2MS液體培養(yǎng)基中葉片SPAD值比較穩(wěn)定，6 d后出現(xiàn)小幅度下降。第10 d取樣進(jìn)行植物總蛋白檢測，凝膠結(jié)果（圖1B）顯示，1/2MS液體培養(yǎng)基處理葉片總蛋白量最高，其次是1/2MS固體培養(yǎng)基和Hoagland營養(yǎng)液，H2O中培養(yǎng)的葉片蛋白總量最少。綜上表明，1/2MS液體培養(yǎng)基最適于濟(jì)麥22葉片離體培養(yǎng)。

2.2 臨麥4號葉片離體培養(yǎng)條件篩選

對不同培養(yǎng)條件下臨麥4號離體葉片進(jìn)行SPAD值和總蛋白檢測，結(jié)果如圖2顯示。葉片SPAD值整體均呈降低趨勢，前4 d降幅較小，4 d后，1/2MS固體培養(yǎng)基和H2O中葉片SPAD值降幅較大;1/2MS液體培養(yǎng)基和Hoagland營養(yǎng)液中葉片SPAD值變化比較平穩(wěn)，8 d后開始出現(xiàn)明顯降低。第10 d，1/2MS液體培養(yǎng)基和Hoagland營養(yǎng)液中葉片蛋白含量最高，其次為1/2MS固體培養(yǎng)基，H2O處理的葉片蛋白含量較低。綜上表明，1/2MS液體培養(yǎng)基和Hoagland營養(yǎng)液適于臨麥4號葉片離體培養(yǎng)。

2.3 6-BA對小麥離體葉片生理活性的影響

為了研究6-BA是否利于小麥葉片離體培養(yǎng)，設(shè)置4個濃度6-BA并分別加入1/2MS液體培養(yǎng)基中。結(jié)果（圖3）顯示，濟(jì)麥22和臨麥4號的離體葉片SPAD值，在所有處理的前6 d均保持穩(wěn)定;6 d后添加6-BA處理的葉片SPAD值逐漸上升，而對照葉片的SPAD值逐漸下降。不同6-BA濃度處理的葉片SPAD值差異不顯著，25.00 mg/L和50.00 mg/L處理的SPAD值相對較高。植物總蛋白檢測結(jié)果與SPAD檢測結(jié)果一致，添加6-BA處理的葉片總蛋白含量明顯高于對照，均以25.00 mg/L和50.00 mg/L處理的含量較高。表明，1/2MS培養(yǎng)基中添加6-BA有利于濟(jì)麥22和臨麥4號葉片離體培養(yǎng)，其中25.00 mg/L添加濃度效果最優(yōu)。

3 討論與結(jié)論

離體葉片廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物抗性鑒定、病原菌分離等，維持葉片生理活性是離體葉片鑒定體系有效利用的關(guān)鍵。本研究分別選用1/2MS液體、固體培養(yǎng)基及Hoagland營養(yǎng)液為離體葉片提供外源營養(yǎng)元素，同時選用外源激素6-BA增強(qiáng)葉片生長，由此建立與優(yōu)化了分別適用于濟(jì)麥22和臨麥4號的離體葉片培養(yǎng)體系。

MS培養(yǎng)基是目前使用最普遍的培養(yǎng)基，具有平衡的離子濃度，能滿足植物細(xì)胞的營養(yǎng)和生理需要。Hoagland營養(yǎng)液是無土栽培常用營養(yǎng)液，富含作物生長發(fā)育必需的13種元素[13]。本研究選用1/2MS培養(yǎng)基和Hoagland營養(yǎng)液建立小麥葉片的培養(yǎng)體系，結(jié)果顯示，濟(jì)麥22和臨麥4號的葉片皆可在1/2MS液體培養(yǎng)基中維持生理活性達(dá)10 d，表明其適用于小麥葉片的離體培養(yǎng)。小麥葉片在清水中培養(yǎng)4 d后黃化明顯，SPAD值快速降低，第10 d時葉片細(xì)胞幾乎全部壞死。小麥葉片在1/2MS固體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)與在清水中相似，推測葉片可能無法有效地從固體培養(yǎng)基中吸收營養(yǎng)成分，導(dǎo)致細(xì)胞逐漸衰老。

臨麥4號葉片在1/2MS液體培養(yǎng)基和Hoagland營養(yǎng)液中的生長狀態(tài)較為一致，皆可維持穩(wěn)定的葉綠素及蛋白含量;而濟(jì)麥22葉片在Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d后迅速衰老，這種現(xiàn)象可能是由兩個品種的營養(yǎng)需求不同導(dǎo)致的。

在高等植物中，細(xì)胞分裂素通過控制細(xì)胞分裂和分化而廣泛參與植物生長發(fā)育的調(diào)控，包括胚胎發(fā)育、根和芽的分化、維管束的形成、葉綠體成熟、頂端優(yōu)勢、光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及延緩衰老等[7]。研究表明，細(xì)胞分裂素通過促進(jìn)功能葉葉綠體的發(fā)育提高葉面積、CO2同化速率、氣孔導(dǎo)度和Rubisco酶活性來提高植物的光合能力[8]。6-BA處理能夠維持葉綠體和基粒的結(jié)構(gòu)及形態(tài)穩(wěn)定，延緩葉綠素降解[5]。本研究結(jié)果顯示，添加6-BA培養(yǎng)6 d后，葉片SPAD值逐漸上升，第14 d植物總蛋白檢測結(jié)果也顯示添加6-BA的葉片生長狀態(tài)良好，均以25.00 mg/L 6-BA有利于小麥葉片的生長，可應(yīng)用于小麥葉片離體培養(yǎng)。

本研究針對濟(jì)麥22和臨麥4號兩個品種分別建立了其離體葉片培養(yǎng)體系，結(jié)果表明1/2MS液體培養(yǎng)基添加25.00 mg/L 6-BA更適于濟(jì)麥22離體葉片培養(yǎng)，1/2MS液體培養(yǎng)基和Hoagland營養(yǎng)液分別添加25.00 mg/L 6-BA均適宜于臨麥4號離體葉片培養(yǎng)，在此條件下，葉片離體狀態(tài)下的正常生理活性均達(dá)14 d以上，可高效應(yīng)用于植物抗病、病原菌分離鑒定等多方面的研究工作中。本研究結(jié)果為外源營養(yǎng)元素和激素在植物生長發(fā)育中的進(jìn)一步應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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收稿日期：2019-09-27

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31701762）;國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD0201700）;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目（CXGC2018E04，CXGC2016B11）

作者簡介：李光艷（1995—），女，在讀碩士研究生，研究方向：植物病毒病害研究。E-mail： lihayy616@163.com

通訊作者：姜珊珊（1987—），女，山東聊城人，博士，主要從事植物病毒與寄主互作研究。E-mail：shanshan2113@163.com

辛相啟（1965—），男，山東安丘人，研究員，主要從事植物病害防控技術(shù)研究。E-mail：xinxiangqi@126.com