武亞婷，杜木英，丁承焱，闞建全，程方方，殷 娜，劉維兵，韓亞楠，何歡歡，尹小慶，武 運*

（1.新疆農業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆果品精深加工與貯運保鮮工程技術研究中心，新疆 烏魯木齊 830052；3.西南大學 食品科學學院，重慶 400715；4.中匈食品科學聯(lián)合研究中心，重慶 400715）

發(fā)酵辣椒醬是一種具有特殊風味的乳酸菌發(fā)酵制品，有良好的感官品質，其成本低廉、食用方便[1-2]。我國傳統(tǒng)辣椒醬多以自然發(fā)酵為主，該方法存在容易被污染，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產，發(fā)酵條件難控制，產品品質不穩(wěn)定的問題[3-4]。而國外主要通過菌種純培養(yǎng)技術進行多菌種混合發(fā)酵或酶法生產優(yōu)質辣椒醬，產品營養(yǎng)豐富[5-7]。隨著人們生活質量和水平的不斷提高，采用乳酸菌純種發(fā)酵辣椒醬越來越受到國內外研究學者的關注，因此，優(yōu)良乳酸菌的篩選具有重要的意義。沙漠等[8]從自然發(fā)酵的辣椒醬中分離出兩株產酸量高、生長良好且適用于發(fā)酵辣椒試驗的菌株；周俊良[9]在貴州地區(qū)市售泡辣椒和農家自制醬辣椒產品中篩選出4株適用于發(fā)酵辣椒制品制作的乳酸菌。

耐鹽微生物作為一種新型微生物資源，對發(fā)酵產品口感、品質的提高及生產工藝的改善具有非常重要的作用[10]。發(fā)酵產品中添加嗜鹽微生物對于優(yōu)化生產工藝、改善鹽漬食品口感具有十分重要的意義[11-12]。曲玲童[13]從錦州腌漬小黃瓜中篩選出具有良好發(fā)酵性能的耐鹽植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），對產品質量提高具有理論支持和實際應用價值。

本試驗以新疆部分地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬為研究對象，首先，在厭氧條件下，采用富集培養(yǎng)法、溶鈣圈法等傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法對乳酸菌進行初篩；然后，通過測定產酸能力和NaCl耐受能力進行復篩；最后，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學技術對耐鹽乳酸菌進行鑒定。通過篩選獲得耐鹽乳酸菌，后期將其應用于辣椒醬發(fā)酵試驗，旨在為開展復合菌強化發(fā)酵辣椒醬研究提供優(yōu)良菌種，為發(fā)酵型辣椒醬生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

利用無菌袋，對新疆5個地區(qū)農戶家自然發(fā)酵結束后的辣椒醬進行取樣，每個地區(qū)取5～10份樣品，具體見表1。

表1 新疆發(fā)酵辣椒醬樣品Table 1 Fermented chili sauce samples from Xinjiang

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術有限責任公司。

改良MRS培養(yǎng)基[14]：稱取20 g碳酸鈣于100 mL蒸餾水中，制成乳濁液；將MRS瓊脂培養(yǎng)基和CaCO3乳濁液在121 ℃條件下滅菌15 min，MRS培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右時，加入3%CaCO3乳濁液，混合均勻，凝固。

1.1.3 化學試劑

氯化鈉、氫氧化鈉、過氧化氫、鹽酸、異丙醇、乙醇（均為分析純）：天津永晟精細化工有限公司；200 kit細菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：上海飛捷生物技術有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）：加拿大Fermentas公司；TaqDNA聚合酶：日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設備

FA2014N分析天平：北京東南儀誠實驗室設備有限公司；HR40-IIA2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；XSZ-4GA生物顯微鏡：上海光學儀器一廠；FE28 PLus pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TU-1810APC分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DYY-7B電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化及篩選

分別稱取25 g發(fā)酵辣椒醬樣品于225 mL無菌水中，振蕩，梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，制備菌懸液[15]。

分別吸取稀釋度為10-3、10-4和10-5的不同樣品稀釋液0.1 mL均勻涂布到改良MRS培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，采用游標卡尺測定溶鈣圈直徑及菌落直徑。挑取透明圈大的單菌落進行平板劃線純化3次，直至得到純菌落[16]。將具有溶鈣圈的菌株按1%（V/V）接種量接種到MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，以不接種的MRS肉湯培養(yǎng)基為對照，每隔2 h取樣，采用紫外分光光度計測定波長680 nm處的吸光度值[17]，根據OD680nm值繪制乳酸菌的生長曲線。采用pH計測定發(fā)酵液的pH值并計算產酸率[18-19]。

1.3.2 乳酸菌的耐鹽性能測定

由于市售自然發(fā)酵辣椒醬中口感較好的樣品食鹽含量為6%～8%，故選用NaCl含量為1%～11%的范圍進行耐鹽性能試驗[20-22]。將篩選的乳酸菌菌株按1%接種量接入分別含1%、3%、5%、7%、9%、11%NaCl的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測定波長680 nm處的吸光度值，通過比較不同鹽濃度條件下乳酸菌的生長狀況來指示乳酸菌的耐鹽能力[23]。

1.3.3 耐鹽乳酸菌的鑒定

形態(tài)觀察[24]：將篩選得到的耐鹽乳酸菌接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h。觀察菌落大小、形狀、表面、隆起形狀、邊緣、顏色及透明度等。

生理生化試驗[24]：挑取乳酸菌菌落涂片，進行革蘭氏染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)及其排列方式。挑取乳酸菌進行過氧化氫酶試驗、糖發(fā)酵試驗。

分子生物學鑒定：采用200 kit細菌DNA提取試劑盒提取乳酸菌的基因組DNA，以其為模板，采用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）對菌株的16S rDNA進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR擴增體系：10×Buffer 2 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，上下游引物（25 μmol/L）各3 μL，TaqDNA聚合酶（250 U）0.2 μL，模板DNA 1 μL，雙蒸水（ddH2O）17.8 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30次循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至華大基因進行測序。將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank數據庫中進行BLAST同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用MEGA 6.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[25]。

1.3.4 數據分析

實驗中每個處理重復3次，采用SPSS 24進行數據的顯著性分析，應用Origin 2018軟件和MEGA 6.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離篩選

2.1.1 乳酸菌的分離及初篩

通過改良MRS培養(yǎng)基共分離篩選得到16株能產生溶鈣圈的乳酸菌，結果見表2。

由表2可知，菌株S、T、W、R來自伊犁地區(qū)樣品、菌株B、H、Z來自哈密地區(qū)樣品、菌株SS、Q、LL、BW來自奇臺地區(qū)樣品、菌株X、Y、L來自阿克蘇地區(qū)樣品、菌株E、YS來自烏魯木齊地區(qū)樣品。其中菌株T、SS、B、X、E、Q、S的溶鈣圈與菌落直徑比較大，因此，選擇這7株菌株進行復篩。

表2 乳酸菌的分離結果Table 2 Isolation results of lactic acid bacteria

2.1.2 乳酸菌的復篩

7株初篩菌株的生長曲線見圖1，發(fā)酵過程中pH值、產酸率的變化見圖2和圖3。

圖1 7株乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of 7 strains of lactic acid bacteria

圖2 7株乳酸菌發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.2 Change of pH value of 7 strains of lactic acid bacteria during fermentation

由圖1及圖2可知，7株菌株發(fā)酵16 h后均處于穩(wěn)定期。發(fā)酵24 h內，菌株SS的OD680nm值最高，pH值最?。痪闠、B、X的OD680nm值相對較高，pH值相對較??；菌株S、Q、E的OD680nm值相對較低，pH值相對較大；而菌株E的OD680nm值最低，生長態(tài)勢較差，pH值最大。結果表明，菌株SS、T、B、X的產酸能力較強。由圖3可知，當發(fā)酵16 h時，7株菌株的產酸率均達到最高值，分別為（1.91±0.012）%、（1.88±0.015）%、（1.86±0.020）%、（1.92±0.017）%、（1.97±0.025）%、（1.72±0.025）%和（1.64±0.010）%，且菌株SS、T、B、X的產酸率最高，因此，對菌株SS、T、B、X的耐鹽性能進行測定。

圖3 7株乳酸菌發(fā)酵過程中產酸率的變化Fig.3 Changes of acid production rate of 7 strains of lactic acid bacteria during fermentation

2.2 乳酸菌耐鹽性能的測定結果

菌株SS、T、B、X的耐鹽性能測定結果見圖4。

圖4 4株乳酸菌的鹽耐受性Fig.4 Salt tolerance of 4 strains of lactic acid bacteria

由圖4可知，在NaCl含量為1%～11%范圍內，隨著NaCl含量的增加，4株乳酸菌的生長明顯受到抑制。當NaCl含量為1%～5%，4株乳酸菌能較好地生長；當NaCl含量＞5%之后，乳酸菌的生長明顯受到抑制；當NaCl含量＞7%之后，乳酸菌生長極為緩慢，過低的OD680nm值無法滿足生產需要。結果表明，乳酸菌SS、B、T、X均可耐受7%NaCl。4株乳酸菌株中，菌株SS的OD680nm值最高，說明鹽耐受性最好，菌株T次之，菌株B和X較差，且無顯著性差異（P＞0.05）。經過反復傳代培養(yǎng)，菌株SS、T、B具有穩(wěn)定的遺傳特性，菌株X遺傳特性不穩(wěn)定。綜合分析，菌株SS、T、B為耐鹽性能較好的菌株，對其進行鑒定。

2.3 耐鹽乳酸菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察

菌株SS、T、B的形態(tài)觀察結果見圖5。

圖5 菌株B、SS和T菌落形態(tài)（A）和細胞（B）形態(tài)Fig.5 Colony (A) and cell (B) morphology of strains B,SS and T

由圖5可知，菌株B、T、SS菌落均呈圓形，表面光滑，乳白色，中間突起較白，邊緣整齊。在顯微鏡下觀察，菌株B、SS、T都為短桿狀，菌株T桿狀較粗。

2.3.2 生理生化試驗

菌株B、T、SS革蘭氏染色均為紫色，呈陽性；過氧化氫酶試驗均無氣泡產生，呈陰性，糖發(fā)酵試驗結果見表3。

表3 耐鹽乳酸菌的糖發(fā)酵試驗結果Table 3 Results of carbohydrate fermentation test of salt-tolerance lactic acid bacteria

續(xù)表

由表3可知，3株菌株均不能利用鼠李糖，菌株B、SS不能利用木糖，其余試驗結果均呈陽性。結合形態(tài)觀察結果，參考《伯杰細菌鑒定手冊》[26]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[27]初步鑒定菌株B、T、SS為乳桿菌（Lactobacillus）。

2.3.3 分子生物學鑒定

菌株B、T、SS的16S r DNA PCR擴增產物見圖6。

圖6 菌株B、T和SS 16S rDNA PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.6 Results of agarose gel electrophoresis of PCR products of 16S rDNA of strain B,T and SS

由圖6可知，3株乳酸菌的PCR擴增產物的堿基長度均在1 500 bp左右，與預期結果相符。將PCR產物進行測序，采用MEGA 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖7。

圖7 基于16Sr DNA序列菌株B、T和SS的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain B,T and SS based on 16S rDNA sequences

由圖7可知，菌株B、T、SS與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）聚于一支，親緣關系最近，結合形態(tài)觀察結果及生理生化試驗的結果，判定菌株B、T、SS均為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

3 結論

采用富集培養(yǎng)法、溶鈣圈法等傳統(tǒng)方法從新疆部分地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬中分離純化得到7株溶鈣圈較明顯的菌株，根據菌株對NaCl的耐受性和產酸能力，進一步篩選得到3株產酸能力較強、可耐受7%NaCl的菌株，分別為SS、T、B。通過形態(tài)觀察、生理生化及分子生物學技術鑒定3株耐鹽乳酸菌均為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。綜合3株菌的耐鹽能力、產酸能力，下一步工作將圍繞植物乳桿菌在自然發(fā)酵辣椒醬品質形成中的作用機制，研究植物乳桿菌與產香酵母等多菌種混合接種發(fā)酵的工藝，并進一步明確植物乳桿菌在辣椒醬品質形成中的作用機制及植物乳桿菌在辣椒營養(yǎng)物質轉化的作用等。