劉記成，司偉民，孫玉梅

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

培養(yǎng)基中的Fe2+、Mn2+、Mg2+等微量金屬離子是微生物在發(fā)酵過程中維持正常生長必不可少的營養(yǎng)因子，它們以輔基或輔酶的形式參與微生物體中某些酶的合成，對微生物新陳代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。目前國內(nèi)外對影響生物表面活性劑發(fā)酵的研究主要集中在芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）和假單胞菌屬（Pseu domonas），對蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）產(chǎn)生物表面活性劑的研究尚不深入。相關(guān)研究表明，5 mmol/L FeSO4和0.01 mmol/L MnSO4可分別將枯草芽孢桿菌的脂肽類生物表面活性劑提高9倍和8倍[2-3]，0.04 mmol/L Mn2+可促進(jìn)Bacillus subtilisATCC 22214大量生長，其糖脂類生物表面活性劑產(chǎn)量是不添加Mn2+產(chǎn)量的2倍[4]。不同金屬之間還存在協(xié)同作用，MnSO4、MgSO4和FeSO4可共同作用提高枯草芽孢桿菌的脂肽類生物表面活性劑和銅綠假單胞菌的糖脂類生物表面活性劑產(chǎn)量，其效果優(yōu)于單一金屬離子[5-7]。

蒼白桿菌（Ochrobactrum）可產(chǎn)脂肽類生物表面活性劑，具有低毒、無污染和界面活性高的特性，主要應(yīng)用于石油開采、環(huán)境治理和化妝品等工業(yè)領(lǐng)域[8-9]。有研究表明，首次報(bào)道能產(chǎn)脂肽類生物表面活性劑的蒼白桿菌是從油藏產(chǎn)出液中篩出的，產(chǎn)物中脂肪酸和氨基酸的組成與目前報(bào)道的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌及短短芽孢桿菌產(chǎn)生的生物表面活性素組成相同[8]。蒼白桿菌CN3產(chǎn)生的脂肽類生物表面活性劑表現(xiàn)出高的熱穩(wěn)定性和對極端鹽度和pH的耐受性，發(fā)酵上清液對環(huán)己烷、正己烷和廢機(jī)油的乳化活性高達(dá)65%～86%[10]。由蒼白桿菌MTCC 5720產(chǎn)生的4-二甲基氨基苯甲醛可將水的表面張力由72 mN/m降低至35 mN/m，對十六烷、正己烷和甲苯等乳化活性良好[11]。

國內(nèi)外目前關(guān)于Fe2+和Mn2+促產(chǎn)生物表面活性劑與相關(guān)酶的活性尚無關(guān)聯(lián)研究，同時(shí)谷氨酰胺合成酶是無機(jī)氮同化過程中的關(guān)鍵酶，Mn2+為其輔因子[12]，谷草轉(zhuǎn)氨酶在三羧酸循環(huán)和糖異生代謝中起著重要作用，F(xiàn)e2+對其有很好的激活作用[13]，本研究通過向培養(yǎng)基中添加不同濃度的FeSO4和MnSO4并測定發(fā)酵過程中菌體生長和生物表面活性劑產(chǎn)量等指標(biāo)，考察FeSO4和MnSO4對蒼白桿菌發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響，并通過酶活性與生物表面活性劑生成的關(guān)聯(lián)，判斷Fe2+和Mn2+對生物表面活性劑合成的影響本質(zhì)，以期為高產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵條件控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）：由大連工業(yè)大學(xué)微生物資源與生物催化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離，在-80℃條件下保存于20%甘油中。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；硝酸鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸三鐵、硫酸亞鐵、硫酸錳、苯酚、3,5-二硝基水楊酸、葡萄糖（均為分析純）：天津市天河化學(xué)試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L；調(diào)pH 至7.0。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L；調(diào)pH至7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖10 g/L，磷酸氫鉀3.4 g/L，磷酸氫鈉1.5 g/L，硝酸鈉4 g/L，酵母浸粉0.2 g/L；調(diào)pH至7.0。

上述培養(yǎng)基均于115 ℃條件滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型精密pH計(jì)、722S型分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；JZY-180界面張力儀：河北省承德市材料試驗(yàn)機(jī)廠；DNP電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海金宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BS-ZF振蕩培養(yǎng)箱：金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與培養(yǎng)

取一環(huán)于-80 ℃保存的Ochrobactrumsp.接種于斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h后，4 ℃保存?zhèn)溆茫蝗∫画h(huán)保存的菌種接于新的斜面培養(yǎng)基上，在30 ℃培養(yǎng)48 h后，得活化菌種；取2環(huán)活化后的菌體接種于100 mL種子培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)48 h，得種子液。

1.3.2 MnSO4和FeSO4對菌體產(chǎn)生物表面活性劑的影響

將MnSO4添加于發(fā)酵培養(yǎng)基中，使MnSO4終濃度分別為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L。將FeSO4添加于發(fā)酵培養(yǎng)基中，使FeSO4終濃度分別為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L；不添加MnSO4和FeSO4為空白對照組，以8%接種量將種子液接于上述培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)7 d，按時(shí)取樣并測量相關(guān)指標(biāo)，研究MnSO4和FeSO4對生物表面活性劑合成的影響。

1.3.3 測定方法

菌體密度：采用比濁法[14]。以發(fā)酵上清液為空白，在波長600 nm處測定發(fā)酵液光密度OD600nm值。

糖含量：采用苯酚-硫酸法測定發(fā)酵液總糖含量[15]。采用3,5-二硝基水楊酸法測定發(fā)酵液還原糖含量[16]。

谷氨酰胺合成酶活性[17]：將細(xì)胞用10 mL提取緩沖液重懸破碎，于4 ℃、3 000 r/min離心5 min，取上清（粗酶液）。將反應(yīng)液（1.6 mL）、粗酶液（0.7 mL）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）溶液（0.7 mL）混勻，于30 ℃條件下水浴保溫0.5h，加入顯色劑1 mL，搖勻，靜置5min；于4 ℃、2 000 r/min離心5 min，取上清測定波長540nm處的光密度值。谷氨酰胺合成酶活力的定義：在30 ℃條件下，上清液OD540nm值每小時(shí)增加0.01為一個(gè)酶活力單位（U/mg）。

谷草轉(zhuǎn)氨酶活性[18]：將細(xì)胞用10 mL提取緩沖液重懸破碎，4 ℃條件下3 000 r/min離心5 min，取上清（粗酶液）。將反應(yīng)液（0.5 mL）和粗酶液（0.1 mL）混勻，于30 ℃條件下水浴1 h；再加0.5 mL 2,4-二硝基苯肼，于30 ℃條件下水浴20 min。取出后再加5 mL 0.4 mol/L 氫氧化鈉，反應(yīng)10 min后測定波長500 nm處的光密度值。谷草轉(zhuǎn)氨酶活力的定義：在30 ℃條件下，上清液OD500nm值每小時(shí)增加0.01為一個(gè)酶活力單位（U/mg）。

生物表面活性劑含量測定：采用亞甲基藍(lán)法[19]。取2 mL樣品于分液漏斗，滴加酚酞混勻；逐滴滴加1 mol/L氫氧化鈉至溶液為桃紅色，再滴加0.5 mol/L硫酸至剛好無色，最后加1 mL亞甲基藍(lán)和4 mL二氯甲烷，靜置分層后取有機(jī)相；將有機(jī)相和2 mL洗滌液混勻靜置分層后取有機(jī)相，重復(fù)洗滌2次后，收集有機(jī)相測定光密度值。以O(shè)D652nm值為縱坐標(biāo)（y），以十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）標(biāo)準(zhǔn)品含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.082 4x+0.003 2，R2=0.996 9。

2 結(jié)果與分析

2.1 MnSO4對菌體生長和生物表面活性劑產(chǎn)生的影響

不同MnSO4濃度條件下菌體的生長及代謝變化見圖1。由圖1（a）可知，菌體在對照組和添加0.1～0.4 mmol/L MnSO4發(fā)酵組分別在發(fā)酵2 d、4 d、6 d、6 d和7 d達(dá)最大生長。最大生長量依次為0.4 mmol/L＞對照組＞0.3 mmol/L＞0.1 mmol/L和0.2 mmol/L，說明加入較高濃度MnSO4（0.4 mmol/L）會明顯促進(jìn)菌體平穩(wěn)生長。這與朱玲燕等[20]對Bacillus subtilisBS-37進(jìn)行MnSO4優(yōu)化的結(jié)果一致。

由圖1（b）和圖1（c）可知，所有發(fā)酵組均在發(fā)酵1 d達(dá)最大pH，隨后有不同幅度升降。在發(fā)酵前4 d，添加0.1 mmol/L和0.2 mmol/L MnSO4的發(fā)酵組pH變化幅度與對照組基本一致，隨后比對照組變化平穩(wěn)。添加0.3 mmol/L和0.4 mmol/L MnSO4的發(fā)酵組在整個(gè)發(fā)酵期間的pH變化幅度均高于對照組?？梢?，低濃度MnSO4有助于發(fā)酵液pH平穩(wěn)變化。

由圖1（d）可知，在發(fā)酵過程中，添加0.3 mmol/L MnSO4的發(fā)酵組耗糖速度低于其他發(fā)酵組。由圖1（e）可知，添加0.4 mmol/L MnSO4的發(fā)酵組在發(fā)酵前4 d耗糖速度高于對照組，并在發(fā)酵4 d耗糖量與對照組持平，隨后耗糖速度低于對照組。添加0.1 mmol/L和0.2 mmol/L MnSO4的發(fā)酵組在發(fā)酵前6 d耗糖速度高于對照組，隨后對照組耗糖速度加快并在發(fā)酵終點(diǎn)耗糖量高于所有發(fā)酵組。可見，高濃度MnSO4會抑制菌體耗糖，低濃度MnSO4會促進(jìn)菌體耗糖。

圖1 在不同MnSO4濃度下發(fā)酵的菌體生長（a）、培養(yǎng)pH值（b）、糖濃度（c）、谷氨酰胺合成酶活（d）及生物表面活性劑含量（e）Fig.1 Cell growth (a),culture pH (b),sugar content (c),glutamine synthase activity (d) and biosurfactant content (e) under different concentrations of MnSO4during fermentation

表1 不同濃度MnSO4對谷氨酰胺合成酶活性及生物表面活性劑產(chǎn)量的差異顯著性分析Table 1 Significant analysis on the differences of glutamine synthase activity and biosurfactant yield at different MnSO4concentrations

由圖1（d）、圖1（e）和表1可知，加入MnSO4的發(fā)酵組酶活性比對照組高。其中添加0.4 mmol/L MnSO4的發(fā)酵組谷氨酰胺合成酶活性與對照組均有明顯差異（P＜0.05）。所有發(fā)酵組的生物表面活性劑產(chǎn)量均在發(fā)酵7 d達(dá)最大值，且加入MnSO4的發(fā)酵組生物表面活性劑增加量高于對照組。其中添加0.3 mmol/L MnSO4的發(fā)酵組在發(fā)酵結(jié)束時(shí)生物表面活性劑含量最大，但與添加其他濃度MnSO4的發(fā)酵組無明顯差異（P＞0.05）。生物表面活性劑的生成與谷氨酰胺合成酶活性變化一致，在發(fā)酵前3 d，加入MnSO4的發(fā)酵組酶活性快速升高，其生物表面活性劑含量增加較快；在發(fā)酵3～6 d，加入MnSO4的發(fā)酵組酶活性降低，其生物表面活性劑含量增長緩慢；在發(fā)酵6～7 d，加入0.1 mmol/L、0.3 mmol/L和0.4 mmol/L MnSO4的發(fā)酵組酶活性升高，而生物表面活性劑含量開始快速增加?？梢?，MnSO4可顯著提高谷氨酰胺合成酶的活性并促進(jìn)菌體發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑（P＜0.05）[10]。

綜上所述，MnSO4有利于菌體生長，并且可以提高谷氨酰胺合成酶活性同時(shí)促進(jìn)生物表面活性劑生成。高濃度MnSO4抑制菌體耗糖，而低濃度MnSO4促進(jìn)菌體耗糖，其中添加0.3 mmol/L MnSO4以最低耗糖量達(dá)最大生物表面活性劑含量。因此，0.3 mmol/L MnSO4更適合生物表面活性劑的合成。

2.2 FeSO4對菌體生長和生物表面活性劑產(chǎn)生的影響

不同F(xiàn)eSO4濃度條件下菌體的生長及代謝變化見圖2。

圖2 在不同F(xiàn)eSO4濃度下發(fā)酵的菌體生長（a）、培養(yǎng)pH值（b）、糖濃度（c）、谷草轉(zhuǎn)氨酶酶活（d）及生物表面活性劑含量（e）Fig.2 Cell growth (a),culture pH (b),sugar content (c),glutamic-oxaloacetic transaminase activity (d) and biological surfactant content (e) under different concentrations of FeSO4during fermentation

表2 不同濃度FeSO4對谷草轉(zhuǎn)氨酶活性及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of different FeSO4concentrations on glutamicoxaloacetic transaminase activity and biosurfactant productivity

由圖2（a）可知，菌體在對照組和添加0.1～0.4 mmol/L FeSO4發(fā)酵組分別在發(fā)酵2 d、6 d、6 d、5 d和3 d達(dá)最大生長，最大生長量依次為0.1 mmol/L＞對照組＞0.2 mmol/L＞0.3 mmol/L＞0.4 mmol/L，說明加入低劑量FeSO4會促進(jìn)菌體快速大量生長，而高劑量FeSO4對菌體生長有抑制作用。添加0.3 mmol/L和0.4 mmol/L FeSO4的發(fā)酵組菌體生長平穩(wěn)程度優(yōu)于其他發(fā)酵組。可見，低濃度FeSO4有助于菌體大量生長，而高濃度FeSO4有助于菌體平穩(wěn)生長。

由圖2（b）可知，在發(fā)酵過程中添加0.1～0.4 mmol/L FeSO4的發(fā)酵組pH變化幅度小于對照組，其中添加0.3mmol/L和0.4 mmol/L FeSO4的發(fā)酵組pH變化更穩(wěn)定。可見，F(xiàn)eSO4有助于穩(wěn)定發(fā)酵液pH，且FeSO4濃度越高pH變化越穩(wěn)定。這與WEI Y H等[21]用0～10 mmol/L FeSO4優(yōu)化Bacillus subtilisATCC 21332時(shí)的現(xiàn)象一致。

由圖2（c）可知，在發(fā)酵前3 d所有發(fā)酵組耗糖速度基本一致，添加FeSO4的發(fā)酵組還原糖濃度高于對照組。隨后添加0.1 mmol/L和0.2 mmol/L FeSO4發(fā)酵組的耗糖速度快于對照組，并在發(fā)酵終點(diǎn)耗糖量基本一致。而添加0.3 mmol/L和0.4 mmol/L FeSO4發(fā)酵組的耗糖速度基本不變，在整個(gè)發(fā)酵過程中，還原糖濃度始終高于對照組?？梢?，添加0.1～0.4mmol/LFeSO4能抑制菌體耗糖，添加量越大，耗糖量越少。

由圖2（d）和表2可知，在發(fā)酵過程中，所有發(fā)酵組的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均有提高，其中加入FeSO4的發(fā)酵組高于對照組。添加0.1 mmol/L和0.2 mmol/L FeSO4的發(fā)酵組分別在發(fā)酵3 d和4 d達(dá)最大酶活，添加0.3 mmol/L和0.4 mmol/L FeSO4的發(fā)酵組在發(fā)酵3 d達(dá)最大酶活并高于加入0.1 mmol/L和0.2 mmol/L FeSO4的發(fā)酵組，并在發(fā)酵3 d和4 d不同濃度的酶活均有明顯差異（P＜0.05）。可見，添加FeSO4可提高谷草轉(zhuǎn)氨酶的酶活。低濃度FeSO4有助于酶活平穩(wěn)變化，但對酶活提升幅度較?。桓邼舛菷eSO4可快速大幅度提高酶活，但酶活平穩(wěn)程度較差。

由圖2（e）和表3可知，加入FeSO4發(fā)酵組的生物表面活性劑含量比対照度高，添加0.1mmol/L、0.2mmol/L和0.3mmol/L FeSO4發(fā)酵組的生物表面活性劑含量分別在發(fā)酵2 d、1 d和4 d達(dá)到最高，隨后有不同程度升降，降低的原因可能是生成的生物表面活性劑被菌體利用或分解。而添加0.4 mmol/L FeSO4發(fā)酵組的發(fā)酵全過程生物表面活性劑含量穩(wěn)定增加，且在發(fā)酵終點(diǎn)高于其他發(fā)酵組，并有明顯差異（P＜0.05）。可見，添加0.1～0.4 mmol/L FeSO4可以促進(jìn)菌體生成生物表面活性劑，隨著FeSO4濃度升高，產(chǎn)物生成的穩(wěn)定性提高，終產(chǎn)量增大，但生成速度降低。

綜上所述，添加0.1～0.4 mmol/L FeSO4可以有效提高谷氨酰胺合成酶活性以及生物表面活性劑產(chǎn)量。且高濃度FeSO4的菌體生長、發(fā)酵液pH變化以及生物表面活性劑產(chǎn)量均較低濃度FeSO4發(fā)酵的效果平穩(wěn)。其中加入0.4 mmol/L FeSO4可達(dá)最大生物表面活性含量。因此，0.4 mmol/L FeSO4更適用于生物表面活性劑的合成。

3 結(jié)論

添加不同濃度MnSO4（0.1～0.4 mmol/L）有助于提高谷氨酰胺合成酶活性和生物表面活性劑產(chǎn)量，添加0.3 mmol/L MnSO4比對照的耗糖量減少9.3%，菌體生長和發(fā)酵液pH變化較平穩(wěn)，生物表面活性劑產(chǎn)量（2.21 mg/L）提高8.6倍。添加不同濃度的FeSO4（0.1～0.4 mmol/L）可提高谷草轉(zhuǎn)氨酶活性和生物表面活性劑產(chǎn)量，添加0.4 mmol/L FeSO4比對照的耗糖量低，并在菌體生長和發(fā)酵液pH平穩(wěn)變化的前提下生物表面活性劑積累快速且產(chǎn)量（1.75 mg/L）提高了7.5倍。本研究可為蒼白桿菌發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的條件優(yōu)化控制提供參考。