牟婷婷，李怡萱，李 麗，王祥余，宗緒巖*

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000；2.諾維信（中國）投資有限公司，北京 100085）

以高粱、大米、小麥、糯米等糧谷為原料，經過發(fā)酵蒸酒后殘留的固體混合物就是白酒酒糟。白酒酒糟經過發(fā)酵蒸餾后仍殘留著豐富的成分，比如淀粉，蛋白質、纖維、多糖、氨基酸、維生素和微量元素，還含有豐富的醇類、酯類、酸類、芳香類等發(fā)酵產物[1-7]。其中主要成分為粗淀粉含量在5.71%～11.34%，粗蛋白含量5.00%～13.84%，以及粗脂肪1.31%～3.24%[8]。酒糟的類型主要有兩大類，一類是處于正常生產過程的酒糟，包括糧糟、紅糟、以及上輪留下的母糟；另一類為即將丟棄的酒糟，有面糟和丟糟。據統(tǒng)計，我國白酒釀造行業(yè)每年產生約2 500萬t的丟糟。白酒丟糟中含水量大、酸度高，堆積儲放時極易霉變腐爛，若隨意丟棄或焚燒，會造成嚴重的環(huán)境污染[9]。目前酒糟的研究方向主要是酒糟的利用方面，比如：生產酒糟飼料，生產燃料棒和燃料乙醇，提取纖維素、半纖維素和膳食纖維，酒糟生產生化產品，酒糟釀醋，酒糟再利用釀酒，培養(yǎng)食用菌，提取多酚、類黑精等附加值產物，生產能源和有機酸等方面[10-17]。主要是對丟糟中的粗蛋白和粗纖維的利用研究，而對丟糟中淀粉的研究較少。由于濃香型白酒的特殊工藝是續(xù)糟發(fā)酵，即一部分已經經過發(fā)酵蒸酒后的酒糟拌和部分新糧再進行下輪次的發(fā)酵和蒸酒，如此反復循環(huán)。在丟糟中，一部分淀粉因為被蛋白緊密結合，導致淀粉酶不能直接接觸淀粉，從而不能降解淀粉。本研究通過酸性蛋白酶處理丟糟，降解包裹在淀粉外的蛋白質，使其中的淀粉裸露出來，并采用單因素及正交試驗優(yōu)化淀粉提取條件。本研究將丟糟中抗酶解淀粉轉化為可降解淀粉的方法，以提高丟糟抗酶解淀粉的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丟糟：宜賓今良造制造酒公司；P15酸性蛋白酶（15 010 00 U/g）：百斯杰酶制劑公司；淀粉酶（140 340 U/g）、糖化酶（301 200 U/g）：諾維信酶制劑公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）（＞99.0%）：如吉生物科技；氫氧化鈉、乙醇、鹽酸、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、葡萄糖、磷酸、考馬斯亮藍G250（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

CP124C型電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；UV2400型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；BHS-6型恒溫水浴鍋：寧波市鄞州群安實驗儀器有限公司；Lynx6000型高效落地高速冷凍離心機：美國Thermo Scientiric公司；PL4-00型打漿機：咸陽易安機電工程有限公司；

1.3 實驗方法

1.3.1 丟糟前處理

取適量丟糟，加入適量蒸餾水倒入打漿機進行打磨，使丟糟高粱殼中殘留的淀粉脫落，打磨結束后，將酒糟液過20目篩，以去除酒糟中的稻殼，再將過篩后的酒糟液進行離心，5 000 r/min，5 min，離心3次，保存離心后的沉淀，備用。

1.3.2 提取條件優(yōu)化單因素試驗

酶解溫度的確定：稱取經前處理的丟糟5.0 g，按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，充分攪拌形成懸濁液，以0.1 mol/L氫氧化鈉溶液或0.1 mol/L鹽酸溶液調節(jié)懸濁液pH至3.0，加入0.02 mL/g的酸性蛋白酶，酶解時間為60 min，分別在酶解溫度為35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃條件下對懸濁液進行酶解。酶解結束后，立即5 000 r/min，5 min冷凍離心3次，棄除沉淀，并立即檢測上清液中的淀粉和蛋白含量。

酶解pH的確定：稱取經前處理的丟糟5.0 g，按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，充分攪拌形成懸濁液，酶解溫度為65 ℃，酶添加量為0.02 mL/g，酶解時間為60 min，分別在pH值分別為2、3、4、5、6條件下對懸濁液進行酶解。酶解結束后，立即在5 000 r/min、5 min條件下冷凍離心3次，棄除沉淀，并立即檢測上清液中的淀粉和蛋白含量。

酶解時間的確定：稱取經前處理的丟糟5.0 g，按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，充分攪拌形成懸濁液，酶解溫度為65 ℃，酶添加量為0.02 mL/g，pH=3.0，酶解時間分別為60 min、90 min、120 min、150 min、180 min條件下對懸濁液進行酶解。酶解結束后，立即在5 000 r/min、5 min條件下冷凍離心3次，棄除沉淀，并立即檢測上清液中的淀粉和蛋白含量。

酶添加量的確定：稱取經前處理的丟糟5.0 g，按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，充分攪拌形成懸濁液，酶解溫度為65 ℃，酶解時間為60 min，pH=3.0，酶添加量分別為0.01 mL/g、0.02 mL/g、0.03 mL/g、0.04 mL/g、0.05 mL/g下對懸濁液進行酶解。酶解結束后，立即在5 000 r/min、5 min條件下冷凍離心3次，棄除沉淀，并立即檢測上清液中的淀粉和蛋白含量。

1.3.3 提取條件優(yōu)化正交試驗

以淀粉提取率為評價指標，對影響因素酶解溫度、酶解pH、酶解時間、酶添加量進行L9（34）正交設計，正交試驗因素與水平見表1。

表1 提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.4 測定方法

（1）淀粉含量的測定

采用DNS法測定淀粉含量[18]。

葡萄糖標準曲線的制作：準確稱取0.100 0 g葡萄糖標準品，用蒸餾水溶解后定容至100 mL，配制成質量濃度1 mg/mL；分別移取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL的質量濃度1 mg/mL葡萄糖標準溶液于25 mL具塞比色管中，分別添加蒸餾水至2.0 mL，再加入1.5 mL DNS溶液，沸水浴5 min，立即在流水中冷卻，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25 mL，搖勻，在波長540 nm處測定其吸光度值。以葡萄糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，制作葡萄糖標準曲線，得到標準曲線回歸方程為y=0.584 9x+0.003 9，相關系數R2=0.998。

丟糟樣品中淀粉含量測定：提取液定容至100 mL，調節(jié)提取液的pH至5.6，放入88 ℃恒溫水浴鍋中，加入0.2%淀粉酶，酶解反應1h，提取液中的淀粉經淀粉酶酶解成多糖；再調節(jié)提取液的pH至4.5，放入65 ℃恒溫水浴鍋中，加入0.2%糖化酶，酶解反應1 h，提取液中的多糖經糖化酶酶解成葡萄糖。取0.5 mL上清液按照葡萄糖標準曲線的方法在540 nm處測其吸光度值，通過葡萄糖標準曲線回歸方程計算出0.5 mL中樣品的淀粉含量，淀粉提取率計算公式如下：

式中：X為淀粉提取率，%；m1為0.5 mL提取液中淀粉的含量，mg；V為提取液的總體積，mL；m2為濕丟糟的質量，g；n為濕酒糟的含水量，%。

（2）蛋白含量的測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量[19]。

牛血清蛋白標準曲線的制作：準確稱取0.1000 g牛血清蛋白標準品，用蒸餾水溶解后定容至100 mL，配制成質量濃度1 mg/mL；分別移取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL的質量濃度1 mg/mL牛血清蛋白標準溶液于10 mL具塞比色管中，分別添加蒸餾水至1.0 mL，再加入5 mL考馬斯亮藍溶液，蓋上塞子，放置2 min后，立即在波長595 nm處測定其吸光度值。以牛血清蛋白含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，制作牛血清蛋白標準曲線，得到標準曲線回歸方程為y=0.794 6x-0.026 4，相關系數R2=0.998 5。

丟糟樣品中蛋白含量測定：移取0.5 mL上清液按照蛋白標準曲線的制作中的方法在595 nm處測其吸光度值，通過標準曲線回歸方程計算出0.5 mL樣液中的蛋白含量，蛋白提取率計算公式如下：

式中：Y為蛋白提取率，%；m1為0.5 mL提取液中蛋白的含量，mg；v為提取液的總體積，mL；m2為濕丟糟的質量，g；n為濕酒糟的含水量，%。

（3）含水量的測定

含水量測定采用恒質量法[20]。

2 結果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化單因素試驗結果分析

2.1.1 酶解溫度的確定

溫度在酶促反應中有相當重要的影響。當溫度適當升高時，在酶促反應中會起到催化作用，會加快反應速率；當溫度超過一定范圍時，過高的溫度會抑制酶的活性，甚至會使酶失活，從而會降低其反應速率。所以，要找到酶促反應的最適溫度非常重要。但是，這個最適溫度不是固定值，不是酶的特征參數。反應體系中的多種因素都會對它造成不同程度的影響，需要在不同的反應體系中加以優(yōu)化[21]。

圖1 酶解溫度對丟糟液中蛋白和淀粉提取率的影響Fig.1 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of protein and starch from distiller's grain

選定酶解條件為：pH=3.0，加酶量0.02 mL/g，料液比為1∶10（g∶mL），丟糟分別于35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃條件下對懸濁液水解60 min，考察不同酶解溫度對丟糟淀粉及蛋白提取率的影響，結果見圖1。由圖1可知，酶解溫度在35～65 ℃時，蛋白和淀粉提取率隨溫度增加而上升，在酶解溫度在65～75 ℃時，蛋白和淀粉提取率開始下降。原因是隨著溫度的升高，酸性蛋白酶的活性逐漸上升，包裹在淀粉外的蛋白質逐漸被降解，更多的淀粉裸露出來，所以在蛋白質及淀粉提取率也逐漸增加，當酶解溫度＞65 ℃后，酸性蛋白酶活性降低，蛋白質及淀粉提取率也略有減少。因此，確定最佳酶解溫度為65 ℃。

2.1.2 酶解pH的確定

溶液pH對整個反應體系都有重要的影響。主要的影響有三方面，其一，當反應體系的pH過高或過低時，酶活性中心的構象會改變，甚至整個酶分子結構改變而使酶失活；其二，酶活性中心常含有可離解的基團，pH會直接影響這些基團的解離程度；其三，pH也會對底物造成一定的影響。所以，確定最適pH值有利于進一步提高酶一底物（ES）的反應速率[19]。

選定酶解條件為：酶解時間60 min，酶解溫度65 ℃。加酶量0.02 mL/g，料液比為1∶10（g∶mL），分別于酶解pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0條件下對懸濁液進行水解，考察不同酶解pH值對丟糟淀粉及蛋白提取率的影響，結果見圖2。由圖2可知，當酶解pH值為2.0～3.0時，酸性蛋白酶活性逐漸增加，懸濁液的蛋白提取率顯著增加，淀粉提取率也隨之增加，當酶解pH=3.0時，懸濁液中蛋白和淀粉提取率達到最大值，當溶液酶解pH＞3.0時，懸濁液的蛋白和淀粉提取率呈現緩慢下降的趨勢。因此，確定最佳酶解pH值為3.0。

圖2 酶解pH對丟糟液中蛋白和淀粉提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis pH on extraction rate of protein and starch from distiller's grain

2.1.3 酶解時間的確定

選定酶解條件為：酶解溫度65 ℃，加酶量0.02 mL/g，料液比為1∶10（g∶mL），酶解pH=3.0，分別于酶解時間為60 min、90 min、120 min、150 min、180 min條件下對懸濁液進行水解，考察不同酶解時間對丟糟淀粉及蛋白提取率的影響，結果見圖3。由圖3可知，當酶解時間為60～120 min時，懸濁液的蛋白和淀粉提取率隨之明顯的增加，當酶解時間＞120 min后，溶液中的蛋白和淀粉提取率趨于穩(wěn)定。隨著酶解時間的延長，酸性蛋白酶與懸濁液中的蛋白質發(fā)生酶促反應，被分解的蛋白質含量累積增加，淀粉含量也隨之增加。但當酶解時間繼續(xù)延長時，蛋白含量和淀粉含量的增幅較平穩(wěn)，其原因可能是懸濁液中的底物蛋白質已經被降解完全了，即使延長酶解時間，蛋白提取率沒有明顯的增加，所以淀粉也未有明顯增幅；也可能是酸性蛋白酶的添加量有限，酶的活性已經逐漸衰弱了。因此，確定最佳酶解時間為120 min。

圖3 酶解時間對丟糟液中蛋白和淀粉提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on extraction rate of protein and starch from distiller's grain

2.1.4 酶添加量的確定

一般來說，在反應過程中，隨著酶添加量的增加，反應速率應隨之增加。但當底物濃度不變，而酶添加量持續(xù)增加時，產物得率不會隨著酶添加量的增加有明顯的增加，因為此時底物已被徹底分解，酶量的增加對產物得率沒有明顯的作用，同時，對于實際生產，還會增加不必要的成本。而且酶添加量過大，快速促進酶促反應，產生大量的分解物，有可能對酶產生反饋抑制，就會降低反應速率[20]。

選定酶解條件為：溫度65 ℃，料液比為1∶10（g∶mL），pH=3.0，酶解時間60 min，分別于酶添加量為0.01 mL/g、0.02 mL/g、0.03 mL/g、0.04 mL/g、0.05 mL/g條件下對懸濁液進行水解，考察不同酶添加量對丟糟淀粉及蛋白提取率的影響，結果見圖4。由圖4可知，當酶添加量為0.01～0.02 mL/g時，蛋白及淀粉提取率均隨之增大，當酶添加量為0.02 mL/g時，蛋白與淀粉提取率達到最大值，當酶添加量＞0.02 mL/g之后，蛋白和淀粉提取率均有輕微的下降趨勢。當酶添加量增加時，可以增加酶濃度，促進蛋白分解速率，從而使更多與蛋白結合的淀粉被釋放，使淀粉酶可以直接接觸淀粉而被分解利用，所以，酸性蛋白酶的添加量增加，就間接使懸濁液中的淀粉含量增加。而當酶添加量持續(xù)增加后，蛋白含量與淀粉含量反而有輕微的減少，原因一可能是酶濃度過大，產生了大量的水解物，而對酶產生了抑制作用，所以蛋白含量有所減少，從而使淀粉含量有所降低。因此，確定最佳酶添加量為0.02 mL/g。

圖4 蛋白酶添加量對丟糟液中蛋白和淀粉提取率的影響Fig.4 Effect of protease addition on extraction rate of protein and starch from distiller's grain

2.2 提取條件優(yōu)化正交試驗結果分析

在單因素試驗基礎上，以淀粉提取率、蛋白提取率為評價指標，對影響因素酶解溫度、酶解pH、酶解時間、酶添加量進行L9（34）正交設計，正交試驗結果見表2，極差分析結果見表3，方差分析結果見表4。

表2 提取條件優(yōu)化正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3 正交試驗結果極差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experiment results

由表3可知，以極差R來判斷各因素的主次順序，影響淀粉提取率的主要因素是酶解溫度，其次是酶解pH，然后是酶解時間，影響最小的因素是酶添加量；影響蛋白提取率的主要因素是酶解pH，其次是酶解溫度，然后是酶解時間，影響最小的因素是酶添加量。以淀粉提取率和蛋白提取率為考察指標，最佳提取條件組合均為A3B3C2D2，即酶解溫度為75 ℃，酶解pH=4，酶解時間為120 min，酶添加量為0.02 mL/g。在此最佳提取條件下進行3次平行驗證試驗，淀粉提取率為24.26%，蛋白提取率為12.21%。

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表4可知，以淀粉提取率為考察指標，酶解溫度、酶解pH、酶解時間、酶添加量對提取率有極顯著的影響（P＜0.01）；以蛋白提取率為考察指標，酶解溫度、酶解pH、酶解時間對提取率有極顯著的影響（P＜0.01），酶添加量對提取率無顯著影響（P＞0.05）。

3 結論

通過單因素及正交試驗，得到最佳提取條件為酶解溫度75 ℃，酶解pH4，酶解時間120 min，酶添加量0.02 mL/g。在此優(yōu)化條件下，淀粉的提取率為24.26%，蛋白質提取率為12.21%。通過酸性蛋白酶提取丟糟中的淀粉，提高了丟糟中淀粉的利用率。加入酸性蛋白酶可以提高丟糟酒的出酒率，提高丟糟的經濟效益。