尚遠宏，田金鳳

（攀枝花學院 生物與化學工程學院，四川 攀枝花 617000）

果酒是以水果為原料，經(jīng)過微生物發(fā)酵等多道工序調配而成的含有水果風味和一定酒精度的飲品，基本保留水果營養(yǎng)成分，易于人體吸收[1]。經(jīng)常飲用果酒能夠改善心腦血管功能，促進機體新陳代謝及血液循環(huán)，預防腦血管、動脈硬化和高血壓等疾病[2-3]。

芒果（Mangifera indica）為漆樹科芒果屬的多年生植物[4]，其果實素有熱帶果王之稱[5-8]。凱特芒果種植占攀枝花市芒果種植總面積的70%[9]，其果實含有大量的維生素、有機酸、蛋白質、糖類等對人體有益的營養(yǎng)成分。然而，由于種植面積的擴大和產(chǎn)量的增長，加之芒果自身不易保藏，有明顯的季節(jié)性特征[10]，產(chǎn)后損失嚴重，出現(xiàn)鮮果供過于求的現(xiàn)象，影響果農增收[11]。野拔子（Elsholtzia rugulosaHemsl.）蜂蜜被稱為“金牌蜜”，屬于天然營養(yǎng)佳品，受到了很多人的青睞，為蜜中上品[12]，分布于云貴川，花期在10月下旬至12月上旬，主要開花流蜜期30～40 d[13]。野拔子蜂蜜營養(yǎng)豐富，含有氨基酸、蛋白質、花粉、維生素、微量元素等多種活性物質，食用價值高[12]。同時，蜂蜜在果酒中可替代白砂糖的碳源補充、調節(jié)糖度和減少褐變反應。因此，研制的果酒結合芒果獨特的風味特性和野拔子蜂蜜較高的食療價值的特點，能解決攀枝花芒果的銷售問題，發(fā)展前景廣闊。

芒果發(fā)酵酒的研究報道眾多[14-18]，但是芒果蜂蜜果酒的研發(fā)卻鮮有報道。本研究充分利用攀枝花本地芒果和野拔子資源豐富的優(yōu)勢，以凱特芒果和野拔子蜂蜜作為原料制備芒果蜂蜜果酒。采用單因素及響應面試驗研究凱特芒果野拔子蜂蜜果酒發(fā)酵工藝，以期得到既美味可口又營養(yǎng)豐富的果酒，滿足人們對食品要求提高的消費觀念。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果膠酶（酶活10 000 U/g）：山東西亞化學工業(yè)有限公司；檸檬酸（食品級）：濰坊英軒實業(yè)有限公司；安琪專用葡萄酒酵母：安琪酵母股份有限公司；凱特芒果：市售；野拔子蜂蜜：百草嶺蜂業(yè)責任有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

BDV-325414167電子天平：捷久計量衡器（上海）有限公司；PHS-550數(shù)顯酸度計：杭州陸恒生物科技有限公司；A115038糖度計：上海邦西儀器科技有限公司；0.1分度酒精計：武強縣精創(chuàng)儀器儀表廠；ZTS-1P烘箱：昆山臺順測試科技有限公司；LRH-250-2振蕩培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；ZDHW數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；PHX智能生化恒溫培養(yǎng)箱：寧波萊?？萍加邢薰尽?/p>

1.3 方法

1.3.1 芒果蜂蜜果酒的加工工藝流程及操作要點

原料預處理：選用無腐爛、病蟲害的成熟度好的芒果，清洗，瀝干后去皮去核。

打漿出汁：去皮去核后的芒果榨汁，添加果膠酶（4 g/L）和纖維素酶（0.4 g/L），40 ℃酶解90 min，90 ℃滅酶3 min[11]，冷卻至室溫，過濾后得到原汁。

調整成分：用適量野拔子蜂蜜調整初始糖度為20%，用檸檬酸調整pH值為3.6，加入50 mg/L偏重亞硫酸鉀以殺菌并提高穩(wěn)定性，使果酒醇正香濃[19]。

酵母活化：將安琪酵母加入10%（V/V）的野拔子蜂蜜溶液中，混合均勻，置于35 ℃的恒溫水浴活化60 min，待觀察其產(chǎn)氣泡豐富時，即可作為菌種使用。

發(fā)酵：果汁在無菌條件下，接種活化后的0.10%酵母菌，然后在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵10 d。

過濾澄清：虹吸上層酒液至無菌玻璃容器中，于冰箱冷藏澄清1 d，過濾，得到澄清有光澤的果酒。

調配：在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了酸，為使酸度適當降低，澄清處理過的芒果蜂蜜果酒可用酒石酸鉀鈉（或碳酸鈉）適當?shù)恼{節(jié)[11]，65 ℃巴氏殺菌30 min[20]，得到酒味協(xié)調，風味更加突出的果酒。

1.3.2 芒果蜂蜜果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

分別調整酵母添加量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）、發(fā)酵溫度（20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃）、初始pH值（3.2、3.4、3.6、3.8、4.0）、發(fā)酵時間（6 d、8 d、10 d、12 d、14 d）、初始糖度（16%、18%、20%、22%、24%），按1.3.1項下的操作要點，進行單因素發(fā)酵試驗，以酒精度及感官評分為評價標準，確定各單因素對芒果蜂蜜果酒的影響。

1.3.3 響應面法優(yōu)化芒果蜂蜜果酒發(fā)酵工藝

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

參考相關文獻[11，14]，并在單因素試驗的基礎上，選擇果漿的初始pH值為3.6和發(fā)酵時間為10 d，利用Box-Behnken試驗設計對酵母添加量（A），初始糖度（B）及發(fā)酵溫度（C）3個主要因素進行優(yōu)化，以酒精度（Y1）和感官評分（Y2）為響應值進行響應面試驗。試驗設計因素與水平見表1。

1.3.4 感官評分

參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對芒果蜂蜜果酒進行感官評分[21]，選10名食品專業(yè)人員分別對芒果蜂蜜果酒產(chǎn)品的色澤、香氣、澄清度、滋味、典型性進行感官評分，滿分100分，具體感官評分標準見表2。

表2 果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of wine

1.3.5 芒果蜂蜜果酒質量指標的檢測

酒精度：參照國標GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》中的酒精計法[22]；糖度、酸度：分別采用糖度計和酸度儀進行測定；總酸（以酒石酸計）：電位滴定法[21]；總糖（以葡萄糖計）測定：直接滴定法[21]。細菌總數(shù)、大腸桿菌的測定：參照國標GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》[23]；致病菌的測定：參照國標GB 29921—2013《食品中致病菌限量》[24]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)為3次重復實驗的平均值。采用Origin 7.5作圖，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 酵母添加量對芒果蜂蜜果酒的影響

圖1 酵母添加量對芒果蜂蜜酒感官評分和酒精度的影響Fig.1 Effect of yeast inoculum on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由圖1可知，隨著酵母接種量的增加，酒精度和感官評分先快速升高后迅速降低，當選擇0.04%作為酵母添加量時，發(fā)酵產(chǎn)生的果酒酒精度低，感官評分較低，說明酵母添加量過少，發(fā)酵速度慢，發(fā)酵不徹底；當接種量為0.10%時，芒果蜂蜜酒酒精度出現(xiàn)最大值為（11.3±0.2）%vol，但再繼續(xù)增加酵母接種量，出現(xiàn)果漿中糖分過多而促進了酵母菌的生長繁殖，反而不利于發(fā)酵，酒精度隨之下降，同時，接種量為0.06%時，果酒感官評分達到最大值為（79.1±0.5）分，之后繼續(xù)增加酵母接種量，酒體含糖下降，酸度升高，可能是接種密度過大，導致發(fā)酵液中溶氧不足，從而抑制了酵母的生長，不利于香氣物質的形成，口感變差。因此，考慮果酒的口感，選擇最適酵母添加量為0.06%。

2.1.2 初始糖度對芒果蜂蜜果酒的影響

圖2 初始糖度對芒果蜂蜜果酒感官評分和酒精度的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由圖2可知，當初始糖度為16%～18%時，酒中酒精度較低，醇香味較淡，使得果酒的典型性和滋味不突出，對口感有著消極影響，導致發(fā)酵果酒風味不佳，表明此時糖度不足；在初始糖度為20%時，酒樣中酒精度和感官評分高，分別為（11.2±0.2）%vol和（76.2±0.4）分，果酒風味更好，表明此時糖度對發(fā)酵果酒比較適宜；當初始糖度為＞22%之后，發(fā)酵的酒樣中酒精度偏高，果酒口感偏甜，感官評分降低，說明此時的初始糖度過高。因此，選擇最適初始糖度為20%。

2.1.3 發(fā)酵溫度對芒果蜂蜜果酒的影響

圖3 發(fā)酵溫度對芒果蜂蜜酒感官評分和酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由圖3可知，酒精度和感官評分隨發(fā)酵溫度在20～26 ℃范圍的升高而增加，當發(fā)酵溫度在26 ℃時，果酒酒精度和感官評分達到最大值，分別為（12.4±0.1）%vol和（78.8±0.3）分；而后隨發(fā)酵溫度＞26 ℃之后，溫度過高使酵母菌生長速度較快，致酵母衰老加速（活性受到抑制），不能在發(fā)酵后期將發(fā)酵液中的糖有效轉化成酒精，會影響產(chǎn)酒精量，酒精度由此開始緩慢下降，且酒體粗糙，酒質容易氧化，口感變差，感官評分降低。因此，選擇最適發(fā)酵溫度為26 ℃。

2.1.4 發(fā)酵時間對芒果蜂蜜果酒的影響

圖4 發(fā)酵時間對芒果蜂蜜酒感官評分和酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由圖4可知，當經(jīng)過6～8 d發(fā)酵時，酒樣中酒精度較低，感官評分較低，說明發(fā)酵時間較短，發(fā)酵過程不徹底；對于發(fā)酵10 d時，果酒酒樣中的酒精度和感官評分繼續(xù)上升趨勢，表明隨著發(fā)酵時間的增加果酒品質繼續(xù)提高；當發(fā)酵12～14 d時，感官評分降低，酒精度偏高，可能由于出現(xiàn)輕微的酸敗現(xiàn)象（抑制酵母的酒精產(chǎn)生能力并將部分酒精轉化為酸），酵母菌進入衰減階段，菌體沉降死亡，酒體中溶入菌體內容物而影響感官評價值。因此，選擇最適發(fā)酵時間為10 d。同時，考慮到發(fā)酵時間對整個發(fā)酵影響并不明顯，故而在響應面試驗中發(fā)酵時間不作為考察因子進行考慮。

2.1.5 初始pH值對芒果蜂蜜果酒的影響

圖5 初始pH值對芒果蜂蜜酒感官評分和酒精度的影響Fig.5 Effect of initial pH value on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由圖5可知，發(fā)酵時間對發(fā)酵的感官評分影響不大，當pH值為3.2～3.4 時，果酒酒精度較低，感官評分低，口感風味較差，說明pH值過低導致酵母的生長受到了抑制，發(fā)酵速度慢，不利于果酒風味物質的形成。當pH值為3.6時，發(fā)酵生產(chǎn)的果酒酒精度較高，感官評分最高，分別為（10.6±0.2）%vol和（77.5±0.5）分，說明此pH值下發(fā)酵的果酒風味更好，酵母生長不受抑制。當pH值為4.0時，酒精度降低，感官評分較低，說明pH值過高，可能出現(xiàn)雜菌生長較快，影響酵母的正常生長代謝。由此可知，選擇最適初始pH值為3.6。同時，考慮到初始pH值對整個發(fā)酵影響并不明顯，故而在響應面試驗中初始pH值不作為考察因子進行考慮。

2.2 響應面法分析結果

以酵母添加量（A），初始糖度（B）及發(fā)酵溫度（C）為影響因素，以酒精度（Y1）和感官評分（Y2）為響應值，利用Design Expert 8.06響應面軟件的Box-Behnken試驗設計3因素3水平試驗，試驗設計結果與分析見表3，方差分析結果見表4。

對獲得的數(shù)據(jù)利用分析軟件Design-Expert進行多元回歸方程擬合，得酒精度（Y1）和感官評分（Y2）二次多項回歸模型方程為：

表3 Box-Behnken試驗設計結果與分析Table 3 Results and analysis of Box-Behnken experiments design

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4方差分析結果可知，以響應曲面法建立的二次回歸模型方程，其2個模型均極顯著（P＜0.01），且失擬項均不顯著（P＞0.05），說明此2個模型是可靠的。酒精度和感官評分的校正決定系數(shù)R2為97.40%和99.44%，說明該模型的擬合程度較好，采用響應曲面法優(yōu)化建立的芒果蜂蜜發(fā)酵工藝回歸方程（模型）是有效的。以酒精度為響應值時，一次項C和交互項AB影響顯著（P＜0.05），A、A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），由F檢驗可以得到因子貢獻率為A＞C＞B；以感官評分為響應值時，一次項C、交互項AB、AC、BC和二次項A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），由F檢驗可以得到因子貢獻率為C＞A＞B。

各因素對指標影響的響應面及等高線結果見圖6。由圖6可知，在Y1模型中BC、AC交互作用不顯著，因此只對AB交互作用進行分析，保持發(fā)酵溫度不變時，酒樣中酒精度隨著初始糖度與酵母量的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且等高線呈現(xiàn)橢圓形，存在極值，曲面較為陡峭，交互作用顯著。在Y2模型中等高線最小橢圓的中心點為響應面的最高點，即感官評分最高，等高線的形狀為橢圓形，曲面傾斜度越高，坡度越陡，各因素對感官評分的影響越顯著，說明AC、BC、AB交互作用顯著。

應用響應面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進行分析，選擇酒精度和感官評分的重要性均為5，分別選擇酒精度和感官評分的最大響應值，尋找最優(yōu)響應結果為酵母添加量0.06%，初始糖度19.99%，發(fā)酵溫度25.96 ℃。此優(yōu)化條件下發(fā)酵后果酒酒精度預測值為11.23%vol，感官評分預測值為83.37分。為驗證試驗結果的真實性，考慮實際的操作情況，將發(fā)酵工藝參數(shù)調整為酵母添加量0.06%，初始糖度20%，發(fā)酵溫度26 ℃，在此發(fā)酵工藝條件下，進行6次驗證試驗，芒果蜂蜜果酒的感官評分實際值為83.20分，酒精度實際值為11.25%vol，結果與預測值相差微小，證明該回歸模型可靠，可以應用響應面，優(yōu)化芒果蜂蜜果酒發(fā)酵工藝可行。

圖6 初始糖度、酵母添加量和發(fā)酵溫度交互作用影響芒果蜂蜜酒感官評分和酒精度的響應面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of interaction between initial sugar,yeast inoculum and fermentation temperature on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

2.3 芒果蜂蜜果酒的質量指標檢測結果

采用最佳發(fā)酵條件得到芒果蜂蜜果酒，其酒精度為11.0%vol，總糖（以葡萄糖計）為12.3 g/L，總酸（以酒石酸計）為6.2 g/L；細菌總數(shù)（21 CFU/mL）≤50 CFU/mL，大腸桿菌（1 MPN/100 mL）≤3 MPN/100 mL，致病菌未檢出。結果表明該芒果蜂蜜果酒的理化指標及微生物指標均符合國家標準[25]。

3 結論

以凱特芒果和野拔子蜂蜜為原料，通過單因素試驗，結合響應面分析法優(yōu)化芒果蜂蜜果酒釀造工藝條件，得到最佳優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)為酵母添加量為0.06%，初始糖度為20%，發(fā)酵溫度為26 ℃。在此發(fā)酵工藝條件下，得到芒果蜂蜜果酒的感官評分為83.0分，酒精度為11.0%vol，其芒果蜂蜜酒呈橙黃色，酒體澄清透明，酒香濃郁，口感柔和，帶有淡淡的芒果風味。該研究不僅開發(fā)一款營養(yǎng)豐富的休閑果酒，也得到較優(yōu)的芒果蜂蜜果酒發(fā)酵工藝參數(shù)，為其生產(chǎn)化提供了一定參考意義。