班美靜，滿 燕，潘立剛

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院/北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京)/農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測(cè)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；2.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206）

沙門(mén)氏菌（Salmonella）是導(dǎo)致食源性疾病的主要原因之一，可引起胃腸炎和腹瀉疾病，還會(huì)引起動(dòng)物傷寒、副傷寒、霍亂等疾病發(fā)生。沙門(mén)氏菌廣泛存在于自然環(huán)境中，因此在新鮮農(nóng)產(chǎn)品和動(dòng)物飼料生產(chǎn)過(guò)程中的任何環(huán)節(jié)都可能發(fā)生沙門(mén)氏菌污染。在世界各國(guó)發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒中，沙門(mén)氏菌常位列榜首。因此，為防止和減少沙門(mén)氏菌對(duì)人類健康造成危害，建立沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)方法成為食品安全領(lǐng)域日益增長(zhǎng)的需求。

目前，沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法主要有：基于細(xì)菌理化差異的平板菌落計(jì)數(shù)（培養(yǎng)）法、基于抗原與抗體免疫反應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、基于DNA擴(kuò)增的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）（常規(guī)PCR、定量PCR等）。平板菌落培養(yǎng)法是沙門(mén)氏菌檢測(cè)的最傳統(tǒng)、最常用檢測(cè)方法，但其勞動(dòng)強(qiáng)度大、耗時(shí)長(zhǎng)，一般至少需要3～5 d，因此不能用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。ELISA具有特異性強(qiáng)、通量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在沙門(mén)氏菌檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。然而，這是一種多相檢測(cè)方法，需要多次洗滌，可能會(huì)導(dǎo)致交叉污染和假陽(yáng)性，另外，其缺乏足夠的靈敏性，通常有一個(gè)低檢出限104CFU/mL[1]。PCR方法具有高的檢測(cè)靈敏度、時(shí)間短，但其需要復(fù)雜的DNA提取過(guò)程，對(duì)技術(shù)人員要求較高。

近年來(lái)，生物傳感技術(shù)以及納米材料的迅速發(fā)展，推動(dòng)了基于抗原/抗體、核酸適配體、酶、細(xì)胞、仿生受體、噬菌體等傳感元件的光學(xué)、電化學(xué)、表面增強(qiáng)拉曼散射（Surface Eenhanced Raman Scattering，SERS）、石英晶體微量天平（Quartz Crystal Microbalance，QCM）等多種檢測(cè)食源性致病菌的快速、高靈敏檢測(cè)方法的迅速發(fā)展。其中，核酸適配體是一種短的核酸序列，具有特異性強(qiáng)、親和力高、合成速度快、重現(xiàn)性好、修飾方便等優(yōu)點(diǎn)?；诤怂徇m配體的生物傳感器被稱為核酸適配體傳感器，已被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的定量檢測(cè)，且正在逐步取代以抗原/抗體為基礎(chǔ)的免疫生物傳感器。本文就核酸適配體生物傳感技術(shù)在沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 沙門(mén)氏菌核酸適配體

核酸適配體是利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技 術(shù)（systematic evolution of ligandsby exponential enrichment，SELEX）從一種人工合成的寡核苷酸文庫(kù)中篩選得到的能與靶分子高親和性和高特異性性結(jié)合的單鏈寡核苷酸。近年來(lái)，為提高篩選效率、簡(jiǎn)化篩選過(guò)程，開(kāi)發(fā)了多種SELEX新技術(shù)，如親和層析SELEX、毛細(xì)管電泳SELEX、全細(xì)胞SELEX和加尾SELEX技術(shù)等，這些新型篩選技術(shù)極大促進(jìn)了核酸適配體在各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用[2]。

在沙門(mén)氏菌核酸適配體的篩選（表1）方面，WANG等[3]利用全細(xì)胞SELEX技術(shù)，篩選得到了鼠傷寒沙門(mén)氏菌的ssDNA核酸適配體，Kd值為6.33（±0.58）nmol/L。Lee等[4]利用傳統(tǒng)全細(xì)胞SELEX技術(shù)篩選得到鼠傷寒沙門(mén)氏菌的RNA適配體，這種RNA核酸適配體具有抗RNA酶的作用，其Kd值約為20 nmol/L。近年來(lái)，Li等[5]建立了一種基于石英晶體微天平（QCM）的SELEX技術(shù)，并篩選得到鼠傷寒沙門(mén)氏菌的ssDNA核酸適配體，Kd值為58.5 nmol/L。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，通過(guò)傳統(tǒng)的SELEX篩選技術(shù)得到的ssDNA核酸適配體的親和力要高于RNA核酸適配體；而通過(guò)新型基于QCM的SELEX技術(shù)得到的ssDNA核酸適配體的親和力要高于傳統(tǒng)SELEX篩選技術(shù)，且新型篩選方法速度快、效率高、成本低。近年來(lái)，利用上述SELEX篩選技術(shù)得到的核酸適配體，科學(xué)家們已經(jīng)建立了多種新型核酸適配體生物傳感檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)中。本文基于核酸適配體的生物傳感技術(shù)在沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行了詳細(xì)概述，并對(duì)這些檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)對(duì)比（表2）。

2 核酸適配體生物傳感技術(shù)在沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 比色檢測(cè)

比色法（Colorimetry）是通過(guò)比較或測(cè)量有色物質(zhì)溶液顏色深度來(lái)確定待測(cè)組分含量的方法。作為一種最簡(jiǎn)單的傳感檢測(cè)方法，已被廣泛應(yīng)用于沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)。

表1 沙門(mén)氏菌核酸適配體篩選Table 1 Screening of Salmonella aptamer

表2 適配體生物傳感技術(shù)在沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)中的應(yīng)用情況比較Table 2 Comparison of application of aptamer biosensor technology in the quantitative detection of Salmonella

2.1.1 鹽誘導(dǎo)金納米顆粒聚集 金納米顆粒（Gold nanoparticles，GNPs）在分散和聚集狀態(tài)下具有不同的外觀顏色，根據(jù)這一特性，科學(xué)家們建立了多種基于鹽誘導(dǎo)GNPs聚集的比色生物傳感檢測(cè)方法。如MA等[6]將沙門(mén)氏菌核酸適配體包被于GNPs表面，當(dāng)樣品中含有目標(biāo)分子沙門(mén)氏菌時(shí)，適配體與沙門(mén)氏菌專一性結(jié)合，致使適配體從GNPs-適配體復(fù)合物的表面脫離，釋放出GNPs。當(dāng)加入NaCl時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致GNPs的聚集，GNPs溶液的顏色由紅色變成紫色甚至深藍(lán)色。該方法得到沙門(mén)氏菌的檢測(cè)范圍為102～107CFU/mL，最低檢測(cè)限為56 CFU/mL。WU等[7]利用相同的檢測(cè)原理，實(shí)現(xiàn)了沙門(mén)氏菌和大腸桿菌的定量檢測(cè)，最低檢測(cè)限為105CFU/mL。該檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單、快速、成本低的優(yōu)點(diǎn)，但其檢測(cè)靈敏度相對(duì)比較低。

2.1.2 銀還原放大比色信號(hào) 為進(jìn)一步提高靈敏度，Yuan等[8]提出了一種銀還原的比色生物傳感檢測(cè)方法。通過(guò)生物素親和素的相互作用，沙門(mén)氏菌的適配體被固定于微孔板；另外，巰基修飾的適配體被固定于GNPs。當(dāng)沙門(mén)氏菌存在于樣品中，形成適配體-沙門(mén)氏菌-適配體-GNPs三明治復(fù)合物；然后，利用銀放大溶液增強(qiáng)比色信號(hào)，肉眼即可對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行定量檢測(cè)，得到沙門(mén)氏菌的最低檢測(cè)限為7 CFU/mL。這種銀還原放大比色信號(hào)的方法，可大大提高沙門(mén)氏菌的檢測(cè)靈敏度，具有簡(jiǎn)單、快速、無(wú)需檢測(cè)儀器的優(yōu)點(diǎn)。

2.1.3 磁納米顆粒對(duì)GNPs的高消光系數(shù)特性 磁納米顆粒（Magnetic Nanoparticles,MNPs）除具有較大的比表面積、豐富的功能基團(tuán)外，還具有良好的磁響應(yīng)強(qiáng)度及對(duì)GNPs的高消光系數(shù)等優(yōu)良特性[9]。根據(jù)這一特性，DUAN等[10]將巰基修飾適配體和生物素修飾適配體分別固定在于GNPs和MNPs表面；當(dāng)沙門(mén)氏菌目標(biāo)物存在于樣品中時(shí)，適配體與沙門(mén)氏菌高專一性結(jié)合，形成GNPs-適配體-沙門(mén)氏菌-適配體-磁珠復(fù)合物；磁分離后，GNPs在懸浮液中的含量降低，因此懸浮液顏色變淺，相應(yīng)其UV吸光度也會(huì)降低。利用該方法得到沙門(mén)氏菌的檢測(cè)范圍為25～105CFU/mL，最低檢測(cè)限為10 CFU/mL。與上述微孔板中銀還原方法相比，這種在磁納米顆粒上進(jìn)行核酸適配體的固定、磁納米復(fù)合物的分離純化等過(guò)程都相對(duì)比較簡(jiǎn)單、快速，且降低交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。

2.1.4 酶催化 MNPs除具有高消光系數(shù)的特性外，還具有酶催化活性。Park等[11]利用MNPs的催化活性以及無(wú)標(biāo)記核酸適配體，構(gòu)建了一種核酸適配體生物傳感檢測(cè)方法。首先，表面帶負(fù)電荷的核酸適配體被吸附到表面帶正電荷的MNPs上，這種吸附作用會(huì)阻礙MNPs的催化活性；當(dāng)沙門(mén)氏菌目標(biāo)物存在時(shí)，適配體從磁珠上脫離，MNPs的催化活性恢復(fù)，導(dǎo)致底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）溶液顏色變成藍(lán)色，這種顏色變化可通過(guò)肉眼進(jìn)行觀察，最后得到沙門(mén)氏菌的最低檢測(cè)限為7.5×105CFU/mL。這種檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，但靈敏度低。

為提高檢測(cè)靈敏度，一些具有酶催化活性的納米復(fù)合材料也被應(yīng)用于核酸適配體生物傳感檢測(cè)方法的構(gòu)建。如Wu等[12]構(gòu)建了一種ZnFe2O4還原的氧化石墨烯（ZnFe2O4-rGO）納米結(jié)構(gòu)，這種新型納米結(jié)構(gòu)具有過(guò)氧化氫酶的催化活性，可催化過(guò)氧化氫對(duì)TMB的氧化，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物；利用修飾有ZnFe2O4-rGO的適配體作為信號(hào)探針，生物素修飾適配體被固定于微孔板，作為捕獲探針；當(dāng)沙門(mén)氏菌目標(biāo)物存在時(shí)，形成微孔板-適配體-沙門(mén)氏菌-適配體-的ZnFe2O4-rGO復(fù)合物三明治結(jié)構(gòu)；ZnFe2O4-rGO催化底物TMB產(chǎn)生顏色變化，最后得到沙門(mén)氏菌的最低檢測(cè)限為11 CFU/mL，檢測(cè)范圍為 11～1.10×105CFU/mL。由此可見(jiàn)，復(fù)合納米材料應(yīng)用于生物傳感檢測(cè)方法中，可大大提高沙門(mén)氏菌的檢測(cè)靈敏度。

2.1.5 過(guò)氧化氫還原Au3+Au3+可被過(guò)氧化氫還原成紅色非聚集Au原子。Zhu等[13]將沙門(mén)氏菌核酸適配體固定于微孔板，當(dāng)樣品中含有目標(biāo)物沙門(mén)氏菌時(shí)，將會(huì)被核酸適配體捕獲；然后再次加入生物素修飾的適配體，形成雙適配體夾心結(jié)構(gòu)；最后加入親和素修飾的過(guò)氧化氫酶后，過(guò)氧化氫酶催化過(guò)氧化氫的降解，因此，導(dǎo)致晶體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)減慢，形成聚集的納米顆粒，溶液顏色變成藍(lán)色；當(dāng)樣品中不含沙門(mén)氏菌時(shí)，過(guò)氧化氫則不被降解，Au3+在高濃度過(guò)氧化氫條件下，被快速還原形成非聚集的球型納米顆粒，溶液變成紅色。利用該方法實(shí)現(xiàn)了沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)，檢測(cè)范圍為101～106CFU/mL，最低檢測(cè)限為10 CFU/mL。該方法具有快速、高靈敏度、低成本、高專一性以及高準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)。

2.2 熒光檢測(cè)

2.2.1 傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料 WANG等[14]利用適配體修飾的NaYF4:Ce/Tb納米顆粒和一個(gè)熒光DNA標(biāo)簽，構(gòu)建了一種均一的時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。其中，適配體功能化的NaYF4:Ce/Tb納米顆粒作為能量供體，標(biāo)記有羧基熒光素（5-Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）的互補(bǔ)寡核苷酸（cDNA）作為受體。當(dāng)樣品中不存在沙門(mén)氏菌時(shí)，適配體與cDNA雜交，光子能量從NaYF4:Ce/Tb納米顆粒轉(zhuǎn)移到FAM。通過(guò)這種方法得到沙門(mén)氏菌的線性檢測(cè)范圍為102～106CFU/mL，最低檢測(cè)限為25 CFU/mL。Duan等[15]通過(guò)抗-ε-亞基抗體-生物素-親和素-生物素-核酸適配體連接臂，將鼠傷寒沙門(mén)氏菌的核酸適配體與色素細(xì)胞中的F0F1-ATP酶的“旋轉(zhuǎn)子”ε-亞基偶聯(lián)，F(xiàn)-DHPE熒光探針標(biāo)記于色素細(xì)胞的表面，建立了一種新型核酸適配體生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)，其線性檢測(cè)范圍為10～104CFU/mL，最低檢測(cè)限為10 CFU/mL。盡管這些方法具有高的檢測(cè)靈敏度，但其操作比較繁瑣、耗時(shí)。

近年來(lái)，微流控芯片技術(shù)作為一種極具潛力的分析平臺(tái)，具有集成化、微型化、高通量及自動(dòng)化檢測(cè)的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的定量檢測(cè)中。如ZHANG等[16]建立了一種微芯片毛細(xì)管電泳耦合激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)（MCELIF），SYBR Gold標(biāo)記的核酸適配體與沙門(mén)氏菌專一性結(jié)合后，利用核酸適配體-沙門(mén)氏菌復(fù)合物與核酸適配體的質(zhì)荷比的不同，通過(guò)MCE將復(fù)合物與核酸適配體分離開(kāi)，實(shí)現(xiàn)了牛奶樣品中沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)，得到了沙門(mén)氏菌的最低檢測(cè)限為3.37×102CFU/mL。這種微流控芯片檢測(cè)方法具有高度的集成化、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。

盡管上述基于傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料的檢測(cè)方法具有較高的檢測(cè)靈敏度，但這些傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料的熒光強(qiáng)度相對(duì)較低，易漂白，對(duì)環(huán)境變化靈敏度高。為克服這些問(wèn)題，一些具有高熒光強(qiáng)度、高穩(wěn)定性的熒光納米發(fā)光材料，如量 子 點(diǎn)（Quantum Dot，QDs）、 碳 點(diǎn)（Carbon Dots，CDs)、上轉(zhuǎn)換納米發(fā)光材料（Up-conversion Nanoparticles，UCNPs）等作為傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料的替代標(biāo)簽，被用于新型核酸適配體熒光生物傳感器的構(gòu)建中。

2.2.2 量子點(diǎn)（QDs） QDs具有寬的激發(fā)波長(zhǎng)范圍、窄的發(fā)射峰、寬大的斯托克斯位移、高熒光強(qiáng)度及光穩(wěn)定性，已成為最最理想的熒光替代標(biāo)簽[17]。Hamula等[18]利用發(fā)射波長(zhǎng)分別在535、585 nm處的QDs作為光學(xué)標(biāo)簽，并將其分別與副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的適配體偶聯(lián)，建立了一種雙色流式細(xì)胞傳感分析方法，最終得到副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的最低檢測(cè)限為5×103CFU/mL。Xu等[19]首先分別利用修飾有大腸桿菌0157:H7、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗體的免疫磁珠從食品樣本中分離出4種目標(biāo)菌，然后利用發(fā)射波長(zhǎng)不同的4種量子點(diǎn)（528、572、621、668 nm）分別標(biāo)記4種食源性致病菌的適配體，利用該標(biāo)記的適配體專一性識(shí)別磁珠上的捕獲的目標(biāo)菌。利用該方法得到大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌純菌樣的最低檢測(cè)限分別為80、100、47、160 CFU/mL；得到牛肉樣品中4種菌的最低檢測(cè)限分別為320、350、110、750 CFU/mL。與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料相比，這些基于QDs的核酸適配體生物傳感檢測(cè)方法改善了熒光淬滅現(xiàn)象，具有更高的檢測(cè)靈敏度；此外，還能同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種食源性致病菌的高通量檢測(cè)。除這些優(yōu)勢(shì)外，由于QDs的激發(fā)光仍然在紫外-可見(jiàn)光區(qū)，因此，被測(cè)生物樣品同樣會(huì)被激發(fā)，熒光背景值偏高，檢測(cè)靈敏度仍會(huì)受到一定程度影響。

2.2.3 碳點(diǎn)（CDs） CDs是指粒徑小于10 nm的碳納米顆粒，是一類新型的光致發(fā)光納米材料。CDs具有熒光量子產(chǎn)率高、合成簡(jiǎn)單、毒性低、原材料來(lái)源廣泛、生物相容性好、熒光性能優(yōu)等優(yōu)點(diǎn)，受到科學(xué)家們的廣泛關(guān)注[20]。近年來(lái)，Wang等[21]以檸檬酸為碳源，采用水熱法，成功合成了CDs，并利用該CDs建立了一種基于aptamer-CDs的核酸適配體生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了蛋殼和自來(lái)水中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)，得到沙門(mén)氏菌的線性范圍為103～105CFU/mL，最低檢測(cè)限為50 CFU/mL。該方法具有簡(jiǎn)單、快速、高靈敏的特點(diǎn)，可用于其他食源性致病菌的定量檢測(cè)。

2.2.4 上轉(zhuǎn)換納米發(fā)光材料（UCNPs） UCNPs具有高的化學(xué)穩(wěn)定性，不易被光漂白，不受外界環(huán)境（如濕度、酸度等）和被測(cè)物樣品的影響的優(yōu)點(diǎn)，此外，其使用近紅外光（980、880 nm）作為激發(fā)光源，發(fā)射光在可見(jiàn)光區(qū)域分布，且具有單激發(fā)多譜帶發(fā)射，具有低的熒光背景值的優(yōu)異特性，特別適合作為復(fù)雜生物樣本中的熒光標(biāo)記物[22]。因此，UCNPs為核酸適配體熒光生物傳感方法的構(gòu)建提供了新的領(lǐng)域。Wu等[23]利用藍(lán)、綠、紅3種UCNPs分別作為金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌核酸適配體的熒光標(biāo)記，同時(shí)利用互補(bǔ)鏈功能化的磁珠進(jìn)行分離純化，建立了一種基于多色UCNPs的熒光傳感器，實(shí)現(xiàn)了3種食源性致病菌的多重檢測(cè)，得到金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的最低檢測(cè)限分別為25、10、15 CFU/mL。這種基于UCNPs的核酸適配體熒光生物傳感檢測(cè)方法具有高靈敏、簡(jiǎn)單、高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。

2.2.5 無(wú)標(biāo)記熒光核酸適配體傳感器 以上描述的熒光標(biāo)記核酸適配體傳感器，都需要熒光基團(tuán)或熒光納米材料對(duì)核酸適配體進(jìn)行熒光標(biāo)記，因此，需要對(duì)標(biāo)記后的分子進(jìn)行復(fù)雜的分離和純化，所以這種標(biāo)記方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本昂貴。因此，開(kāi)發(fā)方便、無(wú)需標(biāo)記的核酸適配體熒光傳感器，實(shí)現(xiàn)沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)非常有研究意義。

雖然SYBR、PicoGreen和AccuBlue等傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料具有弱的熒光強(qiáng)度，但與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合后，會(huì)產(chǎn)生高的熒光強(qiáng)度，而與ssDNA結(jié)合后，卻沒(méi)有明顯熒光強(qiáng)度變化。DUAN等[24]利用這一特性，建立了一種基于AccuBlue染料的無(wú)標(biāo)記適配體熒光傳感器，實(shí)現(xiàn)了鼠傷寒沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)。其檢測(cè)原理為：當(dāng)沙門(mén)氏菌目標(biāo)物存在于樣本中，核酸適配體與沙門(mén)氏菌專一性結(jié)合，導(dǎo)致cDNA從cDNA-aptamer雙鏈中脫離，因而導(dǎo)致AccuBlue的釋放，熒光強(qiáng)度降低。利用該方法得到了沙門(mén)氏菌的線性檢測(cè)范圍為50～106CFU/mL，最低檢測(cè)限為25 CFU/mL。近年來(lái)，Srinivasan等[25]也利用相同的實(shí)驗(yàn)原理，利用SYBR Green I作為熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了鼠傷寒沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)，最低檢出限為733 CFU/mL。此外，Srinivasan等[25]也建立了另外一種檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的無(wú)標(biāo)記熒光核酸適配體傳感檢測(cè)方法，該方法利用羅丹明B（Rhodamine B,RB）和GNPs之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence Rresonance Eenergy Transfer，F(xiàn)RET）進(jìn)行沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)。其檢測(cè)原理為：當(dāng)適配體與GNPs與RB混合后，由于FRET，RB熒光被大大淬滅；當(dāng)核酸適配體被吸附到GNPs的表面，以保護(hù)GNPs受鹽誘導(dǎo)發(fā)生聚集現(xiàn)象，而這時(shí)存在的GNPs會(huì)導(dǎo)致RB熒光猝滅。當(dāng)沙門(mén)氏菌目標(biāo)物存在時(shí)，適配體與目標(biāo)物專一性結(jié)合，導(dǎo)致GNPs不穩(wěn)定，發(fā)生鹽誘導(dǎo)聚集，進(jìn)而導(dǎo)致淬滅的RB熒光的恢復(fù)。利用這種方法實(shí)現(xiàn)了沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)，檢測(cè)范圍為1 530～96 938 CFU/mL，最低檢出限為464 CFU/mL。此外，Zhang等[26]建立了一種基于三重觸發(fā)序列可再生鏈取代放大-驅(qū)動(dòng)熒光Ag納米團(tuán)簇的聚集的新型無(wú)標(biāo)記、無(wú)修飾、無(wú)DNA萃取的熒光檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了鼠傷寒沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)，線性檢測(cè)范圍為102～107CFU/mL，最低檢測(cè)限為50 CFU/mL。上述這些無(wú)標(biāo)記熒光核酸適配體生物傳感檢測(cè)方法，不需對(duì)標(biāo)記的復(fù)合物進(jìn)行分離純化，其構(gòu)建過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單、快速，大大降低了檢測(cè)成本。

2.3 表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）檢測(cè)

SERS已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、醫(yī)學(xué)診斷、食品安全等多個(gè)研究領(lǐng)域。SERS技術(shù)具有快速、高靈敏檢測(cè)食源性致病菌的潛力，可為食品安全提供保障。常見(jiàn)的表面增強(qiáng)拉曼散射基質(zhì)有銀納米粒子（AgNPs）、GNPs等重金屬納米材料[27-29]。ZHANG等[30]建立了一種GNPs增強(qiáng)的SERS核酸適配體生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的同時(shí)檢測(cè)。修飾有拉曼分子4-巰基苯甲酸（p-MBA）、5，5’-二硫基（2-硝基苯甲酸）和適配體的GNPs作為信號(hào)探針；固定有沙門(mén)氏菌和葡萄球菌適配體的Fe3O4磁性金納米顆粒（Magnetic Gold Nanoparticles, MGNPs）作為捕獲探針。沙門(mén)氏菌和葡萄球菌目標(biāo)物加入到反應(yīng)體系后，被捕獲探針和信號(hào)探針上的適配體所捕獲，形成三明治結(jié)構(gòu)。最終得到沙門(mén)氏菌和葡萄球菌的的最低檢測(cè)限分別為15、35 CFU/mL。該檢測(cè)方法利用MGNPs進(jìn)行分離純化，因此簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，且具有高靈敏、高專一性的優(yōu)點(diǎn)；但該方法約需3 h才能實(shí)現(xiàn)沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)，因此檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。

近年來(lái)，Ma等[31]構(gòu)建了一種基于多刺狀金納米顆粒（Spiny Gold Nanoparticles, SGNPs）的SERS核酸適配體傳感檢測(cè)方法。SGNPs依次經(jīng)4-巰基苯甲酸（p-MBA）和巰基化修飾適配體（SH-Aptamer）進(jìn)行功能化修飾，其中p-MBA作為拉曼信號(hào)分子，巰基修飾的適配體作為SERS探針。此外，被固定在孔板上的生物素修飾的適配體用以專一性識(shí)別和捕獲沙門(mén)氏菌。該方法得到了沙門(mén)氏菌的檢測(cè)范圍為101～105CFU/mL，最低檢測(cè)限為4 CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間約1 h。該檢測(cè)方法具有超高的檢測(cè)靈敏度和選擇性，還具有低成本、快速、簡(jiǎn)易操作等優(yōu)點(diǎn)，且檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較短。

Xu等[32]利用DNA組裝的金納米二聚體（Gold Nanodimer，GNDs），建立了一種SERS適配體傳感檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)。其中，適配體（ssDNA1）功能化的35 nm的GNPs作為捕獲探針；Cy3修飾的互補(bǔ)鏈（ssDNA2）功能化的15 nm的GNPs作為信號(hào)探針。拉曼信號(hào)探針與捕獲探針經(jīng)互補(bǔ)的ssDNAs的雜交，形成不對(duì)稱的GNDs。沙門(mén)氏菌目標(biāo)物加入后與適配體專一性結(jié)合，從二聚體復(fù)合物中解離，因此，拉曼信號(hào)強(qiáng)度下降。最后得到沙門(mén)氏菌的檢測(cè)范圍在102～107CFU/mL，最低檢測(cè)限為35 CFU/mL。該檢測(cè)方法具有高靈敏、穩(wěn)定、均一的優(yōu)點(diǎn)，且其檢測(cè)時(shí)間也相對(duì)較短。

2.4 電化學(xué)檢測(cè)

電化學(xué)生物傳感器具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、攜帶方便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種潛在的POCT分析平臺(tái)，被廣泛應(yīng)用于沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)中。其中，電化學(xué)阻抗法可用于檢測(cè)分析物與固定在電極表面的探針?lè)肿酉嗷プ饔煤箅姌O界面性質(zhì)變化，可提供一種快速、靈敏和無(wú)損的分析平臺(tái)。近年來(lái)，出現(xiàn)了多種利用電化學(xué)阻抗法檢測(cè)沙門(mén)氏菌的研究報(bào)道。GE等[33]通過(guò)結(jié)合誘導(dǎo)GNPs表面核酸適配體的取代以及滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling Circle Amplification, RCA），建立了一種超高靈敏的電化學(xué)阻傳感檢測(cè)方法，并將其用于沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)中。沙門(mén)氏菌與核酸適配體的異質(zhì)識(shí)別和特異性結(jié)合，會(huì)釋放引物結(jié)合部分，導(dǎo)致在核酸適配體傳感器表面錨定多個(gè)圓形模板；RCA反應(yīng)產(chǎn)生具有多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的長(zhǎng)DNA分子產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可以與適配體傳感器表面的生物素化的檢測(cè)探針雜交，以輸出酶放大的電化學(xué)信號(hào)。該方法得到沙門(mén)氏菌的線性檢測(cè)范圍為2×101～2×108CFU/mL，最低檢測(cè)限為16 CFU/mL。該檢測(cè)方法不需要精密的溫度循環(huán)儀器，具有快速、穩(wěn)健、低成本、高靈敏、高專一性的優(yōu)點(diǎn)。

Muniandy等[34]建立了一種基于還原的氧化石墨烯二氧化鈦（Reduced Graphene Oxide Titanium Dioxider,GO-TiO2）納米復(fù)合材料的適配體傳感器，并將其用于沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)。通過(guò)靜電作用，無(wú)標(biāo)記的適配體被固定于rGO-TiO2納米復(fù)合材料表面，當(dāng)DNA適配體與沙門(mén)氏菌細(xì)胞結(jié)合后，會(huì)對(duì)電極表面電子的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生阻礙；電極表面電導(dǎo)率的改變通過(guò)電分析方法進(jìn)行表征；最后得到沙門(mén)氏菌的檢測(cè)范圍為101～108CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間約1 h。該方法具有高靈敏、高選擇性、快速、穩(wěn)健的優(yōu)點(diǎn)。

另外，Ranjbar等[35]建立了一種基于納米多孔金（Nano-porous Gold, NPG）作為底物的新型鼠傷寒沙門(mén)氏菌電化學(xué)傳感檢測(cè)方法。采用金銅合金，通過(guò)電化學(xué)方法在Au/GCE表面合成NPG；硫醇功能化適配體通過(guò)自組裝被有效的連接到NPG/Au/GCE表面；最后得到鼠傷寒沙門(mén)氏菌的線性檢測(cè)范圍為6.5×102～6.5×108CFU/mL，定量限檢測(cè)限為65 CFU/mL，最低檢測(cè)限為1 CFU/mL。該適配體生物傳感器具有高靈敏、高選擇性、高重現(xiàn)性的優(yōu)點(diǎn)，該方法具有可區(qū)分活菌細(xì)胞和死菌細(xì)胞的重要優(yōu)勢(shì)。

此外，無(wú)標(biāo)記的方法也被應(yīng)用于電化學(xué)核酸適配體生物傳感方法的構(gòu)建中。如Sheikhzadeh等[36]研制了一種基于聚[吡咯-3-羧基-吡咯]共聚物和適配體的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)阻抗生物傳感器，并用于鼠傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。適配體與沙門(mén)氏菌的相互作用對(duì)聚[吡咯-3-羧基吡咯]共聚物內(nèi)在的共軛及其隨后的電性能的影響，通過(guò)阻抗進(jìn)行測(cè)定。該方法得到沙門(mén)氏菌的檢測(cè)范圍為102～108CFU/mL，定量檢測(cè)限為100 CFU/mL，最低檢測(cè)限為3 CFU/mL。該無(wú)標(biāo)記電化學(xué)核酸適配體生物傳感檢測(cè)方法，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，具有簡(jiǎn)單、快速（約45 min）、低成本、高靈敏的優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，基于比色、熒光、SERS、電化學(xué)等的適配體生物傳感技術(shù)已經(jīng)引起人們的極大關(guān)注，并已被廣泛應(yīng)用于沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)中。與沙門(mén)氏菌傳統(tǒng)檢測(cè)方法比較，適配體生物傳感技術(shù)具有高靈敏、高專一性、快速等優(yōu)點(diǎn)。目前，比色和熒光檢測(cè)法是適配體生物傳感檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛的方法。在熒光傳感檢測(cè)方法中，多種新型納米材料，如量子點(diǎn)、碳點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子等，都被廣泛應(yīng)用于沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)中。其中，不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)還被用于多種食源性致病菌的高通量檢測(cè)中。雖然這些方法具有特異優(yōu)勢(shì)，但也存在需要對(duì)適配體進(jìn)行標(biāo)記的弊端。因而，又出現(xiàn)了多種免標(biāo)記適配體傳感檢測(cè)方法的建立。

核酸適配體生物傳感技術(shù)在沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)中存在著巨大挑戰(zhàn)。首先，樣品基質(zhì)的復(fù)雜性。目標(biāo)物的提取和純化相對(duì)比較復(fù)雜繁瑣，且適配體會(huì)非特異性地與樣品基質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致錯(cuò)誤或不精確的結(jié)果的出現(xiàn)。其次，食源性致病菌的多樣性。樣品基質(zhì)中往往會(huì)存在多種食源性致病菌，而目前現(xiàn)有的適配體生物傳感檢測(cè)方法的檢測(cè)對(duì)象還比較單一，因此高通量檢測(cè)也是目前的一大挑戰(zhàn)。最后，目前應(yīng)用于沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)的核酸適配體生物傳感技術(shù)，還僅限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，不能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)實(shí)地的快速檢測(cè)。因此，開(kāi)發(fā)與這些生物傳感技術(shù)相匹配的便攜式檢測(cè)儀器，實(shí)現(xiàn)沙門(mén)氏菌的實(shí)時(shí)實(shí)地快速檢測(cè)是另一重大挑戰(zhàn)。