何藝平，陳 杰，高鑫鳳，許繼國(guó)

（1.廣州市畜牧科學(xué)研究所，廣東 廣州 510550；2.南昌師范學(xué)院生物技術(shù)研究所/江西省地方雞種遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)科學(xué)院家禽分子育種技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330022；3.江豐實(shí)業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 510450；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】通過(guò)有意識(shí)的育種，家養(yǎng)動(dòng)物群體聚集了豐富的具有性狀效應(yīng)（phenotypic effects）的變異[1]。作為全球生物多樣性重要組成部分的家養(yǎng)動(dòng)物，不僅為人類提供了穩(wěn)定的動(dòng)物蛋白來(lái)源及許多有用的動(dòng)物產(chǎn)品，其性狀多樣性還是研究基因型性狀之間關(guān)系的重要資源。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的變異常常具有病理性性狀，而家養(yǎng)動(dòng)物中具有性狀效應(yīng)的變異大部分不具有病理性性狀，是遺傳學(xué)研究的重要組成部分[2-3]。家雞的色素沉著性狀作為家養(yǎng)動(dòng)物性狀多樣性的代表，備受生物學(xué)家和育種工作者關(guān)注。研究色素性狀的遺傳對(duì)于探討禽類起源、演化、生產(chǎn)以及開展實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究等方面都具有重要意義。

【前人研究進(jìn)展】目前，在家雞中已經(jīng)鑒定到了11個(gè)致因突變與羽色性狀相關(guān)，涉及10個(gè)基因[4-14]，其中2個(gè)為伴性遺傳（銀色羽和蘆花羽基因座位）[11,14]，10個(gè)為常染色體遺傳的基因座位。白麻羽性狀（亦稱為珍珠白）是文昌雞存在的一種較為典型的性狀，與黃麻羽性狀相比其主要特點(diǎn)是不能合成嗜黑素，并且不改變羽衣中真黑素和嗜黑素的相對(duì)分布（圖1）。關(guān)于文昌雞白麻羽的遺傳規(guī)律以及其形成的分子機(jī)制未見報(bào)道。根據(jù)白麻羽的性狀特征和遺傳方式以及Gunnarsson等[11]研究基礎(chǔ)，我們推測(cè)其是由銀色羽位點(diǎn)突變所致。

【本研究切入點(diǎn)】本研究首先檢測(cè)了已知的銀色羽突變位點(diǎn)與白麻羽性狀的關(guān)系，結(jié)果顯示其并非致因突變。之后通過(guò)正反交試驗(yàn)探明了白麻羽性狀的伴性隱性遺傳規(guī)律。結(jié)合白麻羽性狀不能合成嗜黑素、不改變色素相對(duì)分布的特點(diǎn)以及其伴性遺傳的特征，我們首先猜測(cè)其很可能是位于銀色羽基因座位上一個(gè)新的等位基因，因此重新篩查了銀色羽對(duì)應(yīng)的SLC45A2基因的多態(tài)性，并驗(yàn)證了多態(tài)位點(diǎn)與白麻羽性狀之間的關(guān)系。從性狀來(lái)看，與野生型相比，白麻羽個(gè)體發(fā)生的是嗜黑素（黃色-紅色）合成障礙而并非嗜黑素和真黑素（褐色-黑色）的相對(duì)分布變化，因此我們猜測(cè)很可能是由于SLC45A2基因外顯子區(qū)域的錯(cuò)義突變或者無(wú)義突變導(dǎo)致了嗜黑素合成障礙[11]。因此，本研究首先驗(yàn)證了外顯子區(qū)域的錯(cuò)義或者無(wú)義突變與白麻羽性狀的關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探索白麻羽性狀的遺傳規(guī)律，并找出對(duì)應(yīng)的致因突變。研究結(jié)果可為白麻羽群體在育種中的利用以及相應(yīng)性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供依據(jù)。

圖1 白麻羽文昌雞（左）和黃麻羽文昌雞（右）Fig.1 Wenchang chicken with white-partridge feathers（Left）and Wenchang chicken with yellow-partridge feathers（Right）

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試雞只來(lái)源于廣州市江豐實(shí)業(yè)股份有限公司育種場(chǎng)，其中白麻羽和黃麻羽公雞各1只，白麻羽和黃麻羽母雞各15只。禽血DNA抽提試劑盒購(gòu)買自廣州飛揚(yáng)生物科技有限公司。分子試驗(yàn)部分所用離心機(jī)、PCR等儀器設(shè)備來(lái)源于廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 正反交試驗(yàn) 分別用1只白麻羽公雞與15只黃麻羽母雞雜交，以及1只黃麻羽公雞與15只白麻羽母雞雜交。記錄每只種蛋后代對(duì)應(yīng)的父母本，入孵出雛后佩戴翅號(hào)，并且記錄其父母本信息，6周齡時(shí)統(tǒng)計(jì)公母雞羽色分布。

1.2.2 DNA抽提 翅下靜脈采血，放于裝有抗凝劑的1.5 mL離心管中。根據(jù)OMEGA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行血樣DNA抽提。

1.2.3 多態(tài)位點(diǎn)篩選 根據(jù)候選基因SLC45A2序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），選用3個(gè)白麻羽純合子和6個(gè)黃麻羽純合子作為模板，對(duì)候選基因SLC45A2外顯子區(qū)域進(jìn)行重測(cè)序，引物位置設(shè)計(jì)在外顯子兩側(cè)100 bp左右。利用DNAStar中的SepMan軟件讀取測(cè)序結(jié)果，并進(jìn)行SNP篩選。

表1 供試引物信息Table 1 Information of the primers for trials

1.2.4 候選位點(diǎn)驗(yàn)證 以白麻羽文昌雞、黃麻羽文昌雞、固始雞、霸王山雞、清遠(yuǎn)麻雞、杏花雞和紅色原雞DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物（表1），利用測(cè)序的方法對(duì)候選變異位點(diǎn)進(jìn)行分型。

2 結(jié)果與分析

2.1 正反交試驗(yàn)結(jié)果

白麻羽公雞與黃麻羽母雞雜交，后代公雞全部能合成嗜黑素，表現(xiàn)為黃蘆花性狀（黃白相間）；母雞不能合成嗜黑素，全部為白麻羽性狀。黃麻羽公雞與白麻羽母雞雜交，后代公雞和母雞均能夠合成嗜黑素，公雞表現(xiàn)為黃蘆花性狀，母雞表現(xiàn)為黃麻羽性狀（表2）。正反交試驗(yàn)結(jié)果表明，白麻羽性狀呈現(xiàn)伴性隱性遺傳。

表2 正反交試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Result of the reciprocal cross experiment

2.2 SLC45A2多態(tài)性與白麻羽關(guān)系研究

2.2.1SLC45A2多態(tài)位點(diǎn)篩選 根據(jù)白麻羽性狀不能合成嗜黑素且不改變色素相對(duì)分布的特征、伴性遺傳的規(guī)律以及前人關(guān)于雞銀色羽性狀和白虎毛色形成分子機(jī)制的研究結(jié)果[11,15-16]，選取SLC45A2作為候選基因，篩選多態(tài)位點(diǎn)。以白麻羽和黃麻羽性狀個(gè)體的DNA為模板，對(duì)SLC45A2外顯子區(qū)域進(jìn)行重測(cè)序，結(jié)果共篩選到5個(gè)SNP（表3），其中3個(gè)位于外顯子上，2個(gè)為錯(cuò)義突變（SNP1、SNP4），1個(gè)為同義突變（SNP2）。

表3 SLC45A2基因SNPs位點(diǎn)信息Table 3 SNPs location information of SLC45A2 gene

2.2.2 候選位點(diǎn)驗(yàn)證 根據(jù)白麻羽性狀不能合成嗜黑素以及不改變嗜黑素和真黑素相對(duì)分布的特點(diǎn)，推測(cè)與該性狀相關(guān)的突變是錯(cuò)義突變，因此首先排除SNP2、SNP3和SNP5位點(diǎn)；又由于該性狀為隱性性狀，因此與該性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)在白麻羽群體中應(yīng)該呈現(xiàn)純合子，因此排除SNP1位點(diǎn)（利用白麻羽性狀和黃麻羽性狀進(jìn)行SNP篩選時(shí)，SNP1在白麻羽群體中出現(xiàn)了雜合子，數(shù)據(jù)未顯示）。根據(jù)上述分析，我們選取SNP4作為候選位點(diǎn)，以不能合成嗜黑素的白麻羽文昌雞與能合成嗜黑素的黃麻羽文昌雞、固始雞、霸王山雞、清遠(yuǎn)麻雞、杏花雞和紅色原雞為材料，驗(yàn)證SNP4位點(diǎn)與白麻羽性狀的關(guān)系。

采用Sanger測(cè)序的方法對(duì)被檢測(cè)個(gè)體的SNP4位點(diǎn)進(jìn)行分型，結(jié)果顯示，所有能合成嗜黑素的品種均為GG基因型，而不能合成嗜黑素的白麻羽文昌雞均為CC基因型（表4）。上述結(jié)果顯示，SNP4位點(diǎn)（SLC45A2基因編碼區(qū)1154位點(diǎn)）的C等位基因與白麻羽性狀完全連鎖，很可能是白麻羽性狀的致因突變。

表4 SNP4位點(diǎn)在不同性狀群體中的分布情況Table 4 Distribution of SNP4 in different populations

3 討論

SLC45A2基因編碼區(qū)1154位點(diǎn)與文昌雞白麻羽性狀完全連鎖，可能是銀色羽基因座上的一個(gè)新的等位基因。Gunnarsson等研究發(fā)現(xiàn)，具有相似性狀的國(guó)外品種是由于SLC45A2基因上的突變位點(diǎn)〔C.C1039A（L347M）〕導(dǎo)致的[11]。在白麻羽文昌雞中雖然不存在該突變，但SLC45A2基因編碼區(qū)1154位點(diǎn)突變卻與白麻羽性狀呈完全連鎖的關(guān)系，可能該突變是一個(gè)新的銀色羽等位基因，而且這一突變很可能是致因突變，其原因有3個(gè)方面：（1）試驗(yàn)結(jié)果顯示，該突變與文昌雞白麻羽性狀完全連鎖，并未在能夠合成嗜黑素的品種中發(fā)現(xiàn)該突變；（2）白麻羽性狀的特點(diǎn)是不能夠合成嗜黑素，可能是由于基因編碼區(qū)內(nèi)發(fā)生錯(cuò)義突變導(dǎo)致的，本研究中鑒定到的突變符合上述條件；（3）本試驗(yàn)結(jié)果與白虎（不能合成嗜黑素但是可以合成真黑素）中的研究相似，白虎的形成也是由于SLC45A2基因上的一個(gè)錯(cuò)義突變（A477V）導(dǎo)致的[15]。

由于動(dòng)物的毛色是由真黑素和嗜黑素兩種色素在毛發(fā)中的相對(duì)分布導(dǎo)致的[16-18]，因此我們有理由相信大部分羽毛性狀是由于調(diào)控區(qū)的調(diào)節(jié)突變影響了參與色素合成的基因表達(dá)而導(dǎo)致的。大部分羽色多樣性都是由嗜黑素和真黑素組成，其不同只是表現(xiàn)為嗜黑素和真黑素的相對(duì)分布，嗜黑素和真黑素合成能力并沒有差別[19]。本研究中白麻羽性狀相對(duì)于黃麻羽性狀，其典型特征是不能合成嗜黑素，并且不改變色素的相對(duì)分布。因此，我們首先推測(cè)其很可能是編碼區(qū)的錯(cuò)義或者無(wú)義突變導(dǎo)致基因無(wú)法行使正常的功能而導(dǎo)致的。本試驗(yàn)結(jié)果較好地支持了這一猜測(cè)。

本研究在候選位點(diǎn)驗(yàn)證時(shí)，選取了能合成嗜黑素的品種為相對(duì)性狀，在被測(cè)的群體中顯示SLC45A2基因編碼區(qū)1154位點(diǎn)在能合成嗜黑素的群體中不攜帶C等位基因。囿于條件限制，被用于驗(yàn)證的6個(gè)群體5個(gè)在我國(guó)的廣東省和海南省，這降低了驗(yàn)證的效力。未來(lái)可擴(kuò)大驗(yàn)證樣本的取樣范圍，進(jìn)一步驗(yàn)證SLC45A2基因編碼區(qū)1154位點(diǎn)與白麻羽性狀的關(guān)系。另外，還需要在細(xì)胞層面以及通過(guò)基因編輯的方式對(duì)SLC45A2基因編碼區(qū)1154位點(diǎn)進(jìn)行功能驗(yàn)證以及分析其對(duì)于白麻羽性狀形成的機(jī)制。SLC45A2基因突變導(dǎo)致白麻羽性狀的分子機(jī)理尚不清楚，因此還需要進(jìn)一步研究。目前有關(guān)SLC45A2只影響嗜黑素的合成而不影響真黑素的合成的原因并沒有十分系統(tǒng)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，但眾多研究結(jié)果提供了一些啟示，很可能是SLC45A2基因的錯(cuò)義突變減少了機(jī)體全身黑色素的生物合成，但是高表達(dá)的EDN3維持了某些區(qū)域真黑素的合成[15]。

4 結(jié)論

本研究以分離出的白麻羽個(gè)體與黃麻羽個(gè)體進(jìn)行正反交試驗(yàn)，結(jié)果顯示白麻羽突變表型相對(duì)于野生型的黃麻羽為伴性隱性遺傳。根據(jù)白麻羽表型伴性隱性遺傳方式、白麻羽表型不能合成嗜黑素的表型特征（一般為基因功能缺失造成）和前人研究結(jié)果，我們選取SLC45A2基因外顯子區(qū)域的錯(cuò)義突變作為候選致因突變進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，SLC45A2基因編碼區(qū)1154多態(tài)位點(diǎn)能將白麻羽群體與非白麻羽群體分開。綜合上述結(jié)果，得出初步結(jié)論，SLC45A2基因編碼區(qū)1154多態(tài)位點(diǎn)很可能是導(dǎo)致白麻表型的致因突變。該突變與白麻表型形成之間的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。