蔡時(shí)可，梅 瑜，顧 艷，謝梅新，王繼華

（廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】走馬胎（Ardisia gigantifolia）又名大葉紫金牛，為紫金?？疲∕yrsinaceae）紫金牛屬（Ardisia）多年生小灌木植物，其干燥根及根莖是我國傳統(tǒng)中藥材，藥用歷史悠久，具有很高的藥用價(jià)值，是一種藥用和觀賞價(jià)值極高的野生植物，主要分布于廣西、廣東、江西和福建等地，具有很大的開發(fā)潛力[1-2]。走馬胎味辛、性溫，具有祛風(fēng)濕、壯筋骨和活血祛痕的功效，廣泛應(yīng)用于跌打損傷、風(fēng)濕骨痛、產(chǎn)后血痕和癰疽潰瘍的治療[3]。走馬胎主要藥用化學(xué)成分為三萜皂苷類、巖白菜素類、香豆素類、甾醇類和揮發(fā)油類等，其中三萜皂苷類和巖白菜素類在抗腫瘤、抗氧化、抗血栓等方面具有重要意義，也是目前研究的熱點(diǎn)[4-5]。走馬胎也是民間食療的原材料，保健產(chǎn)品的開發(fā)不斷擴(kuò)展[6]。目前，市場上的走馬胎主要來源于野生采挖，隨著需求量的增大，導(dǎo)致貨源緊缺，近年來市場上有用杜鵑花科和馬鞭草科植物的根或莖加工混充[7-8]。而且，過度的采挖使野生資源日益缺乏、枯竭，所以急需開展走馬胎的人工種植[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】走馬胎種群的分布、對(duì)光線的響應(yīng)、合適的種植條件已有研究[6,9-10]，但尚未見走馬胎莖段繁育的報(bào)道，生產(chǎn)上以自然采摘的走馬胎種子作為種源，多混雜，極易造成質(zhì)量不穩(wěn)定[6]。隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的普及，多種名貴中草藥種苗已由植物工廠進(jìn)行快速繁殖，如崗梅[11]、鐵皮石斛[12-13]、牛大力[14]等。利用走馬胎嫩葉為外植體，誘導(dǎo)出愈傷組織和不定芽分化途徑的培養(yǎng)方法已成功[15]，但利用莖段繁殖并開展工廠化生產(chǎn)走馬胎種苗還未見報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】走馬胎的種苗是限制其發(fā)展的根本原因，本研究對(duì)走馬胎的莖段組織培養(yǎng)參數(shù)，外植體的消毒方法、增殖和生根培養(yǎng)基進(jìn)行探索和優(yōu)化，建立走馬胎的離體培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)體系，為開展工廠化生產(chǎn)提供參，為人工種植提供了種苗基礎(chǔ)緩解當(dāng)前種苗不足的現(xiàn)狀。【擬解決的關(guān)鍵問題】組培苗的工廠化生產(chǎn)影響因素主要是外植體的消毒、增殖效率和移栽成活率，獲得這3個(gè)環(huán)節(jié)的最佳參數(shù)是走馬胎組培苗生產(chǎn)的關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年夏季在廣東南雄選取生長健壯的野生走馬胎植株，在廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 （1）叢芽誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基：在改良MS培養(yǎng)基（在原MS培養(yǎng)基中增加54.8 mg/L FeSO4·7H2O和8 mg/L抗壞血酸）中添加適量的6-BA、KT和IBA。（2）生根培養(yǎng)基：在1/2改良MS培養(yǎng)基中添加適量IBA及NAA。所有培養(yǎng)基附加蔗糖30 g/L、瓊脂5.5 g/L，pH值調(diào)至5.8（±0.2），經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min。培養(yǎng)條件：溫度28（±2）℃，光照度1 900～2 100 lx，光照時(shí)間14 h/d。

1.2.2 外植體消毒 選取健康的走馬胎植株幼嫩的枝條作為外植體，將枝條切成單芽莖段，先用70%酒精浸泡30 s，用無菌水沖洗3次，每次1～3 min；再用含有吐溫的0.1% HgCl2溶液處理5～11 min（設(shè) 5、7、9、11 min 4個(gè)處理），用無菌水洗滌3～5次，每次5 min。用無菌的濾紙上將莖段上的水吸干，得到消毒外植體備用。切除莖段的兩端接觸HgCl2溶液的部位，插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（改良MS+ 6-BA 0.5 mg/L +KT 0.5 mg/L +IBA 0.2 mg/L）中，每個(gè)消毒處理10個(gè)芽，培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計(jì)污染率和萌芽率。

1.2.3 叢芽增殖 將走馬胎不定芽從外植體上切下來，接種于含有不同激素濃度和種類的叢芽增殖培養(yǎng)基，用于繼代增殖，其激素組合見表1，在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)20～25 d，得到走馬胎的無菌叢苗。比較不同激素組合對(duì)走馬胎叢芽增值的效果，統(tǒng)計(jì)10個(gè)芽的增殖情況。培養(yǎng)基以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)添加6-BA、KT和IBA。

表1 不定芽不同誘導(dǎo)激素組合Table 1 Different hormones combination for adventitious bud induction

1.2.4 生根誘導(dǎo) 從增殖的叢芽上切下帶有2～3個(gè)芽的莖段，插入生根培養(yǎng)基中，深度約0.5 cm左右。培養(yǎng)基以1/2改良MS為基礎(chǔ)，添加不同濃度的NAA和IBA，濃度組合配制見表2。生根誘導(dǎo)培養(yǎng)40～50 d，統(tǒng)計(jì)20株的根數(shù)量和長度。

1.2.5 種植 取根長0.5 cm以上、苗高3 cm以上的走馬胎再生植株進(jìn)行煉苗、移栽。在室內(nèi)煉苗培養(yǎng)3～7 d，再用自來水沖洗干凈根部的培養(yǎng)基，0.1%多菌靈溶液中浸泡10 min，最后將苗種在消毒過的泥炭土中，保持環(huán)境濕度。

表2 根誘導(dǎo)激素配方Table 2 Different hormones combinnation for rooting induction

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法對(duì)外植體消毒效果

經(jīng)過消毒處理后的走馬胎莖段外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10 d后，大部分腋芽逐漸開始恢復(fù)、出現(xiàn)萌動(dòng)，少部分出現(xiàn)褐化，長出細(xì)菌和真菌，對(duì)污染率、萌芽率和死亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（表3）表明，走馬胎外植體進(jìn)行消毒處理5～10 min，均能獲得無菌的外植體，但成功率有差異。真菌是主要的污染源，其分布在腋芽內(nèi)而消毒液無法滲入，導(dǎo)致消毒不徹底[1]。隨著消毒時(shí)間的延長，HgCl2溶液接觸外植體的面積越大，消毒也越徹底，污染率略有下降，但其對(duì)外植體的傷害卻迅速增加，主要表現(xiàn)在外植體中出現(xiàn)真菌的數(shù)量越來越少，但萌芽率逐漸降低，萌芽時(shí)間滯后，而且褐化、死亡率則不斷上升。走馬胎外植體污染率在20%～60%之間，其中消毒9和11 min 的污染率較低，為20%；消毒11 min對(duì)走馬胎的毒害最為嚴(yán)重，萌芽率為30%，比處理10 min低100%；消毒時(shí)間7～9 min，獲得無菌外植體的成功率可達(dá)到40%～60%，滿足在生產(chǎn)上的需求。在本研究中處理1～4均能得無菌外植體，結(jié)合萌芽率和污染率等綜合分析，70%酒精預(yù)處理30 s 結(jié)合0.1% HgCl2處理7～9 min的消毒方法比較合適走馬胎外植體的消毒。

表3 不同方法對(duì)外植體消毒的效果Table 3 Effect of explants disinfection by different methods

2.2 走馬胎叢芽誘導(dǎo)與增殖效果

通過對(duì)叢生芽繼代、增殖培養(yǎng)，能在短期內(nèi)迅速提高種苗的數(shù)量，增值效率的高低決定種苗生產(chǎn)的成本，是進(jìn)行組培苗工廠化育苗的關(guān)鍵。從表4、圖1可以看出，6-BA、KT和IBA的激素組合都能誘導(dǎo)走馬胎不定芽增殖，增殖效率與培養(yǎng)基中6-BA濃度正相關(guān)，隨著濃度的升高，走馬胎的增殖效率增加，在6-BA濃度2 mg/L時(shí)增殖系數(shù)達(dá)到12左右。但是此時(shí)組培苗的不定芽數(shù)目較多，導(dǎo)致過于密集和細(xì)弱，質(zhì)量不高，不適合進(jìn)行下一代的增殖。加入KT和IBA可以改善苗的均勻性，以1 mg/L NAA、1 mg/L KT和0.05 mg/L IBA的組合較適合走馬胎的增殖。

表4 不同激素組合和濃度對(duì)不定芽增殖的影響Table 4 Effect of different hormones combination and concentration on adventitious bud proliferation

圖1 走馬胎離體增殖結(jié)果Fig.1 Buds proliferation in vitro of Ardisia gigantifolia

2.3 生根培養(yǎng)效果

將含有2～3個(gè)芽的莖段接入生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行組培苗的生根誘導(dǎo)。在培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)生根率和根的長度。結(jié)果（表5圖2）表明，采用IBA和NAA的激素組合均能誘導(dǎo)走馬胎的生根，但是和其他草本植物相比，走馬胎的生根較慢，且多為主根，側(cè)根較少。在低濃度的激素水平下，隨著激素濃度的增加根的數(shù)量也相應(yīng)增加，根長增長。添加0.2 mg/L NAA和0.3 mg/L IBA的處理能促進(jìn)根的數(shù)量、提高根的質(zhì)量，但是隨著NAA和IBA濃度的增加，走馬胎誘導(dǎo)生根的時(shí)間也增加。表明NAA濃度增加，根數(shù)量也增加，但直徑略變小，其中0.5 mg/L NAA處理比0.1 mg/L NAA處理誘導(dǎo)的根數(shù)量增加1.25倍，長度增加46.15%，而根直徑?jīng)]有明顯的差異。結(jié)合出根時(shí)間和根的質(zhì)量，以0.2 mg/L NAA和0.3 mg/L IBA誘導(dǎo)的組培苗根系較好，適合后期的移栽。

表5 不同激素對(duì)走馬胎根誘導(dǎo)的效果Table 5 Effect of different hormones on rooting induction of Ardisia gigantifolia

圖2 走馬胎離體誘導(dǎo)生根情況Fig.2 Rooting in vitro of Ardisia gigantifolia

2.4 煉苗及移栽

生根誘導(dǎo)培養(yǎng)40～60 d，走馬胎幼苗的根長0.7 cm、株高3 cm左右。通過練苗，組培苗葉片變厚，質(zhì)地變硬。在移栽5 d后植株挺拔，成活率在85%以上。

3 討論

隨著人口的增長和社會(huì)對(duì)中醫(yī)藥事業(yè)的重視，中藥材的需求日益增加，但是大量的中藥材還沒有開展人工栽培，大多以自然采挖為主，導(dǎo)致野生資源被掠奪性開發(fā)，資源瀕臨枯竭，同時(shí)也很難滿足現(xiàn)代中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的需求[2]。近年來，中藥農(nóng)業(yè)逐漸興起，特別是在中草藥的人工馴化、選育和標(biāo)準(zhǔn)化種植，不斷提升了中草藥的質(zhì)量，緩解中藥原料短缺，將產(chǎn)生良好的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益[3-4]。走馬胎作為一種藥用歷史悠久中藥材，同時(shí)兼具觀賞價(jià)值，但由于其生長緩慢，繁殖系數(shù)較低，建立走馬胎種苗的人工快速繁殖技術(shù)可縮短育苗周期，保障種苗的質(zhì)量，促進(jìn)走馬胎規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化種植，徹底市場緊缺的困境[5]，同時(shí)，也有效保護(hù)野生走馬胎的種子資源，有助于走馬胎資源的穩(wěn)定。

持續(xù)提供大量的種苗是進(jìn)行規(guī)模化種植的基礎(chǔ)，在走馬胎生產(chǎn)上具有重要的意義[6]。目前植物組織培養(yǎng)快速繁殖在技術(shù)上非常成熟，在種苗生產(chǎn)中，種性穩(wěn)定，保持母本優(yōu)良性狀是進(jìn)行工廠化生產(chǎn)的前提，器官發(fā)生途徑的變異要較愈傷組織途徑低，因而在生產(chǎn)上大多采用莖段繁殖[7]。在生產(chǎn)中，無菌外植體的獲得和高增殖效率是制約組培快繁的兩個(gè)主要因素[8]。HgCl2在外植體消毒中應(yīng)用最為廣泛，但是受到環(huán)境保護(hù)的限制，酒精、84消毒液和次氯酸鈉等消毒劑的應(yīng)用頻率開始增加[9-11]。在中草藥植物的組培中，材料纖維化程度、表面是否有絨毛、蠟質(zhì)，特別是生理狀態(tài)等因素都會(huì)影響外植體消毒的效果[12-14]。走馬胎和其他木本植物植物一樣，嫩莖在0.1%HgCl2處理7～9 min進(jìn)行消毒較適合。6-BA和KT是在增殖過程中常用的細(xì)胞分裂素，在生根誘導(dǎo)方面則主要為生長素。不同的植物對(duì)激素的敏感性存在較大差異，一般通過梯度設(shè)計(jì)得到適合的配方[15,16]。本試驗(yàn)結(jié)合以往的研究，通過設(shè)置6-BA和KT的濃度，得到走馬胎的增殖體系。生長素中的NAA和IBA較為穩(wěn)定，常用與生根誘導(dǎo)，兩者的配合使用可以大大改善根的形態(tài)，誘導(dǎo)得到健壯的走馬胎的根[17]。組織培養(yǎng)快繁技術(shù)能提供大量優(yōu)質(zhì)的走馬胎種苗，滿足市場需求，保護(hù)野生資源不受破壞，促進(jìn)其在中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中更好的應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究建立的走馬胎組培苗生產(chǎn)技術(shù)體系，包括嫩莖經(jīng)過70%酒精處理30 s結(jié)合0.1% HgCl2處理7～9 min的消毒方法，優(yōu)化了改良MS培養(yǎng)基+ 6-BA 1.0 mg/L+KT1 mg/L +IBA 0.05 mg/L的不定芽的增殖培養(yǎng)基和1/2改良MS培養(yǎng)基+ NAA 0.2 mg/L +IBA 0.3 mg/L的生根培養(yǎng)基配方。通過建立走馬胎的離體培養(yǎng)與快速繁殖方法，能夠開展工廠組培苗的生產(chǎn)，為人工種植提供充足的種苗，滿足生產(chǎn)需求。