汪小又，劉鑫龍，李翀

（西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715）

導(dǎo)向分子，又被稱為功能性配體，主要通過識(shí)別其分布于某些細(xì)胞表面的對(duì)應(yīng)受體來介導(dǎo)藥物更有效地蓄積于靶部位。其介導(dǎo)藥物的方式主要包括：1）配體與小分子藥物形成偶聯(lián)物（liganddrug conjugates）；2）配體修飾于藥物載體表面構(gòu)建靶向遞藥系統(tǒng)（targeted drug delivery systems）。蛋白-蛋白相互作用在生命體活動(dòng)中占據(jù)了主導(dǎo)地位，其本質(zhì)則是多肽片段之間的相互識(shí)別，因此，多肽往往具有不亞于蛋白的靶受體高親和力；同時(shí)，多肽相對(duì)分子質(zhì)量較小，組織滲透性強(qiáng)，合成與修飾的技術(shù)成熟且生產(chǎn)成本相對(duì)較低，這些優(yōu)勢使得多肽成為得到最為廣泛研究和開發(fā)的一類導(dǎo)向分子。目前，一些多肽-藥物偶聯(lián)物（peptide-drug conjugates）和多肽介導(dǎo)的靶向遞藥系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的不同階段[1-3]（見表1）。

多肽類導(dǎo)向分子的研究主要包括：1）針對(duì)感興趣的靶受體、靶細(xì)胞乃至靶組織，如何獲得對(duì)應(yīng)的多肽導(dǎo)向分子；2）在已有多肽的基礎(chǔ)上如何進(jìn)一步優(yōu)化以更好地勝任導(dǎo)向分子的“角色”。與直接發(fā)揮藥效的多肽藥物略有差異的是，多肽導(dǎo)向分子需長時(shí)間暴露于生理環(huán)境下以持續(xù)發(fā)揮靶向功能，其穩(wěn)定性、潛在免疫原性等性質(zhì)尤為值得關(guān)注。此外，導(dǎo)向分子的提出最初主要源于腫瘤靶向治療的需求，目前已逐步拓展到許多重要疾病治療領(lǐng)域。本文對(duì)近年來多肽類導(dǎo)向分子在來源、優(yōu)化以及應(yīng)用方面的新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 多肽類導(dǎo)向分子的來源新進(jìn)展

天然發(fā)現(xiàn)、分子文庫篩選和化學(xué)設(shè)計(jì)構(gòu)成了多肽類導(dǎo)向分子的3類主要來源。近年來，經(jīng)天然發(fā)現(xiàn)的可用作導(dǎo)向分子的多肽種類正在不斷增加；對(duì)現(xiàn)有多肽文庫進(jìn)行優(yōu)化（上游）和提高對(duì)篩選多肽的分析、鑒別效率（下游）提高了靶蛋白優(yōu)質(zhì)多肽配體的獲取效率；同時(shí)，計(jì)算科學(xué)的突飛猛進(jìn)使得多肽、蛋白的化學(xué)設(shè)計(jì)研究正在發(fā)生革命性的變化。

表 1 含有多肽導(dǎo)向分子的部分在研藥物Table 1 Some peptide targeting molecule-containing drugs under development

1.1 天然發(fā)現(xiàn)的多肽類導(dǎo)向分子

自然界向藥物設(shè)計(jì)工作者提供了大量具有豐富三維結(jié)構(gòu)以及較強(qiáng)生物活性的多肽分子，這同樣也構(gòu)成了多肽類導(dǎo)向分子來源的“寶庫”[4]。特別是來源于天然生物毒素、富含二硫鍵的多肽（具有2對(duì)及以上的二硫鍵）。這類多肽因多對(duì)二硫鍵的連接和固定而具有了高級(jí)結(jié)構(gòu)，盡管其氨基酸數(shù)量相對(duì)較少（一般不超過50個(gè)），也常被稱為微型蛋白（miniature protein）。這類多肽/微型蛋白與靶受體結(jié)合能力強(qiáng)，生物穩(wěn)定性較之于線性多肽大幅提升，近年來作為潛在的導(dǎo)向分子受到廣泛關(guān)注。

蜂毒明肽（apamin）是目前已知氨基酸數(shù)量最少的、能穿透血腦屏障（blood-brain barrier, BBB）的富二硫鍵多肽毒素。其具有18個(gè)氨基酸，經(jīng)2對(duì)二硫鍵連接后具有經(jīng)典的ɑ螺旋結(jié)構(gòu)。小電導(dǎo)鈣激活型鉀通道蛋白1-3（small conductance calciumactivated potassium channel，SK1-3）是其受體。鑒于脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）在臨床上幾乎無藥可治且往往導(dǎo)致肢體嚴(yán)重的功能障礙，造成患者長期的身心嚴(yán)重傷害與巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，筆者課題組以蜂毒明肽為導(dǎo)向分子，構(gòu)建了脊髓靶向的聚合物膠束遞藥系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒明肽同樣能夠高效通過血-脊髓屏障，介導(dǎo)藥物蓄積于損傷部位，實(shí)現(xiàn)了較好的治療目標(biāo)[5]。Oller-Salvia等[6]對(duì)蜂毒明肽中涉及腦靶向性、細(xì)胞毒性、蛋白酶抗性的序列進(jìn)行了分析和研究，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建了性能更好的衍生肽MiniAp-4作為介導(dǎo)腦部靶向遞藥的導(dǎo)向分子。

與蜂毒明肽相比，蝎氯毒素（chlorotoxin）的體積要大得多，其共有36個(gè)氨基酸和4對(duì)二硫鍵。蝎氯毒素靶點(diǎn)為膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)的氯離子通道-3（choloride channel-3，CLC-3），基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP2）和annexinA2等，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有良好選擇性，因此蝎氯毒素已被設(shè)計(jì)為攜帶131I用于治療惡性膠質(zhì)瘤和黑色素瘤的罕見病藥物，并獲得美國FDA批準(zhǔn)[7]。Díaz-Perlas等[8]開發(fā)了基于蝎氯毒素的腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)和輔助診斷及手術(shù)的影像學(xué)探針。來自海洋腹足綱軟體動(dòng)物芋螺的芋螺毒素（conotoxin）是二硫鍵密度最高的一類多肽。Mei等[9-10]以ɑ7煙堿乙酰膽堿受體（alpha7 nicotinic acetylcholine receptor，ɑ7-nAChR）的配體 ——ɑ-conotoxin ImI為導(dǎo)向分子，分別構(gòu)建了能高效靶向非小細(xì)胞肺癌A549和乳腺癌MCF-7的遞藥系統(tǒng)。

1.2 多肽文庫技術(shù)

部分情況下，目標(biāo)受體缺乏適宜配體，或已有配體不適合直接用作導(dǎo)向分子，此時(shí)可利用文庫技術(shù)尋找適宜的導(dǎo)向分子。通過生物或化學(xué)的手段構(gòu)建大容量的隨機(jī)多肽庫，不僅可篩選出針對(duì)特定靶蛋白的多肽配體，還能進(jìn)一步拓展到針對(duì)特定靶細(xì)胞乃至靶組織的多肽導(dǎo)向分子。發(fā)展至今，多肽文庫技術(shù)的種類已趨于穩(wěn)定，包括基于生物的噬菌體展示肽庫、細(xì)菌表面展示、核糖體展示、mRNA展示等和基于化學(xué)的一珠一化合物（one-bead-onecompound）技術(shù)等。近年來，研究者們對(duì)篩選過程的上、下游給予了更多關(guān)注，在上游優(yōu)化多肽文庫，從源頭上提高所篩多肽的性能，在下游提高鑒別候選多肽的效率和速度以大幅減少費(fèi)用和時(shí)間成本。

1.2.1 多肽文庫的優(yōu)化 經(jīng)常規(guī)文庫篩選出的大多為線性多肽和單二硫鍵環(huán)肽，生物穩(wěn)定性不足，一些單二硫鍵環(huán)肽也易在病理微環(huán)境下被還原成線性小肽，后續(xù)應(yīng)用受到很大限制。基于富二硫鍵多肽穩(wěn)定性強(qiáng)且具有豐富的高級(jí)結(jié)構(gòu)，Crook等[11]構(gòu)建了一個(gè)半胱氨酸密集型多肽文庫。該文庫建立在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面（稱為mammalian cell display），充分發(fā)揮了哺乳動(dòng)物細(xì)胞能表達(dá)/分泌種類豐富（超過1 400種）的富二硫鍵蛋白模板（scaffold）的功能，與之對(duì)應(yīng)的是，常用來展示線性多肽的大腸埃希菌（E. coli）或釀酒酵母（S. cerevisiae）因僅能表達(dá)/分泌約不到50種的富二硫鍵蛋白而無法用于構(gòu)建這種富二硫鍵多肽文庫。

噬菌體展示雙環(huán)肽庫也是近年來涌現(xiàn)出的多肽文庫優(yōu)化新思路。雙環(huán)肽具有2個(gè)氨基酸序列環(huán)，中間由一個(gè)連接體進(jìn)行調(diào)控。與單環(huán)肽相比，雙環(huán)肽的結(jié)構(gòu)受到更多的約束，因此其對(duì)靶親和力往往更強(qiáng)，對(duì)蛋白酶的耐受力也更強(qiáng)。雙環(huán)肽文庫的構(gòu)建主要是通過在含有3個(gè)半胱氨酸的直鏈肽庫上引入能與巰基反應(yīng)的連接體，連接體同時(shí)與3個(gè)巰基共價(jià)連接后就形成了雙環(huán)結(jié)構(gòu)（見圖1）。目前，雙環(huán)肽文庫已被用于人表面生長因子受體2（Her2）、尿激酶型纖溶酶原激活因子、凝血因子ⅩⅡa等多個(gè)疾病相關(guān)蛋白的多肽配體篩選中，所得多肽配體對(duì)靶親和力有的已達(dá)到皮摩爾水平，展示出良好的應(yīng)用前景[12-14]。

1.2.2 多肽文庫篩選的新策略 眾所周知，天然多肽大多由天然L型氨基酸（除甘氨酸無旋光異構(gòu)體）組成，也被稱為L型多肽，易被體內(nèi)蛋白酶識(shí)別并降解；而由L型氨基酸的對(duì)映異構(gòu)體——D型氨基酸所組成的D型多肽難以被蛋白水解酶識(shí)別，具有良好的生物穩(wěn)定性。然而，通過多肽文庫直接大量篩選全D型多肽并非易事：通過化學(xué)合成大容量的全D型多肽庫，其成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于L型多肽的獲得，而基于生物的噬菌體展示、細(xì)菌展示等文庫技術(shù)，因無法表達(dá)非天然的D型多肽序列而不能用于直接篩選D型多肽配體。

圖 1 噬菌體雙環(huán)肽文庫的構(gòu)建Figure 1 Construction of a phage bicyclic peptide library

美國麻省理工學(xué)院Schumacher等[15]提出了鏡像噬菌體展示肽庫的技術(shù)，其步驟為：首先通過化學(xué)全合成得到天然靶蛋白（L型）的鏡像分子——D型靶蛋白，然后利用噬菌體肽庫篩選得到能特異性結(jié)合D型靶蛋白的配體（L型多肽），最后合成所得配體的鏡像分子——D型多肽。由于L型多肽配體能特異性結(jié)合D型靶蛋白，基于鏡像對(duì)稱關(guān)系，D型多肽配體也能特異性結(jié)合L型靶蛋白，故該D型多肽為天然靶蛋白的鏡像配體。這一工作與其說是一種新技術(shù)，不如說是一種新策略，是在未改變常規(guī)多肽文庫的前提下，僅通過對(duì)靶蛋白和配體的依次構(gòu)型轉(zhuǎn)換就實(shí)現(xiàn)了D型多肽的高效篩選，所得的D型多肽配體特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)。這一策略先后在抑制原癌蛋白（p53-MDM2）、弱化HIV侵襲力（gp41外膜蛋白）和阻止β-淀粉樣多肽自聚等方面的D型功能多肽篩選上得到成功的應(yīng)用[16-18]。成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)分子-14（Fn14）是近年來發(fā)現(xiàn)的胰腺癌新靶標(biāo)，更有意義的是，F(xiàn)n14也在腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞上高表達(dá)。Fn14的胞外區(qū)長50個(gè)氨基酸，含有3對(duì)二硫鍵，筆者課題組合成了全D型的Fn14胞外區(qū)并基于鏡像噬菌體肽庫的策略篩選得到針對(duì)Fn14的多肽配體，這也是首個(gè)報(bào)道的經(jīng)鏡像噬菌體展示得到的多肽導(dǎo)向分子[19-20]。針對(duì)難滲透型的胰腺癌BxPC3模型，該D型多肽介導(dǎo)脂質(zhì)體藥物能夠高效靶向病灶并能有效滲透到瘤深處，表現(xiàn)出良好的療效。

1.2.3 候選多肽高效分析鑒定 新一代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）在基因組裝配、基因表達(dá)定量和元基因組分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。因其功能強(qiáng)大，近幾年來也逐漸被應(yīng)用于噬菌體肽庫測序。傳統(tǒng)Sanger測序是勞動(dòng)密集型，僅限于鑒別少于102個(gè)，極少數(shù)情況下約103個(gè)配體。相反，NGS平臺(tái)能夠一次表征高達(dá)106～ 108個(gè)序列。't Hoen等[21]以噬菌體七肽肽庫篩選針對(duì)KS483成骨細(xì)胞的多肽導(dǎo)向分子，并以此為例系統(tǒng)比較了傳統(tǒng)測序方式和NGS在噬菌體展示上的區(qū)別。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于新一代技術(shù)的深度測序極大地簡化了對(duì)共有基序（consensus motifs）的鑒定，僅需一輪篩選即可，從而避免了需要反復(fù)輪次的篩選和擴(kuò)增，也能通過檢測低豐度的克隆來改善配體選擇的效率并極大地阻止了假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。

1.3 多肽的化學(xué)設(shè)計(jì)

多肽的化學(xué)設(shè)計(jì)通常并不能和天然多肽蛋白割裂開來，這是因?yàn)榇蠖嘟?jīng)化學(xué)設(shè)計(jì)獲得的多肽仍來源于天然配體或蛋白-蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域。往往在已有序列和結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，計(jì)算機(jī)化學(xué)能夠輔助確定關(guān)鍵氨基酸和作用區(qū)域（氨基酸長度）等信息，并能在一定程度上指導(dǎo)對(duì)所得多肽的進(jìn)一步優(yōu)化。Zhan等[22]通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)從蛇毒蛋白candoxin中第2個(gè)loop區(qū)域中截取了長為16個(gè)氨基酸的多肽，該多肽保留了candoxin能與BBB上α7-nAChR特異性結(jié)合的功能，能夠作為介導(dǎo)腦靶向遞藥的導(dǎo)向分子。

表皮生長因子受體（EGFR）廣泛表達(dá)于肺癌、乳腺癌、膀胱癌等多種癌細(xì)胞表面，是重要的抗腫瘤靶標(biāo)之一。然而，以EGFR的抗體為導(dǎo)向分子介導(dǎo)載藥系統(tǒng)抗腫瘤的表現(xiàn)并不理想，為此，Song等[23]基于Mekler-Idlis氨基酸配對(duì)理論，以EGFR結(jié)構(gòu)域1（domain I）為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了132條小肽配體并從中優(yōu)選出序列為Leu-Ala-Arg-Leu-Leu-Thr的六肽。以該多肽為導(dǎo)向分子能實(shí)現(xiàn)對(duì)EGFR高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌H1299體外和體內(nèi)的高效靶向。華盛頓大學(xué)的Baker等[24-26]近年來專注于微型蛋白的化學(xué)設(shè)計(jì)，他們在已有的富二硫鍵多肽/微型蛋白基礎(chǔ)上引入非經(jīng)典結(jié)構(gòu)，豐富了具有良好熱穩(wěn)定性和耐酶降解的模板庫，在此基礎(chǔ)上，他們構(gòu)建了數(shù)量高達(dá)2萬種以上、經(jīng)從頭設(shè)計(jì)（de novodesign）的微型蛋白虛擬庫，先后在流感病毒A H1血凝素、白細(xì)胞介素（IL）2受體等靶蛋白上進(jìn)行了配體的篩選，通過化學(xué)設(shè)計(jì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到的微型蛋白配體不僅能與相應(yīng)受體高度特異性結(jié)合，同時(shí)還表現(xiàn)出高度穩(wěn)定性以及較低的免疫原性。

計(jì)算及信息科學(xué)的快速發(fā)展也為多肽導(dǎo)向分子的化學(xué)設(shè)計(jì)帶來新的理念。與傳統(tǒng)依靠經(jīng)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法不同，Manavalan等[27]開發(fā)了一種基于機(jī)器學(xué)習(xí)多層次篩選細(xì)胞穿膜肽（cell-penetrating peptide，CPP）的預(yù)測方法。細(xì)胞穿膜肽能夠攜帶生物大分子乃至遞藥系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，也是一類重要的多肽導(dǎo)向分子。通過計(jì)算包括氨基酸組成、二肽組成、氨基酸指數(shù)、成分轉(zhuǎn)變-分布系數(shù)和理化性質(zhì)等信息，該方法首先可預(yù)測未知肽是否是CPP，其次可以預(yù)測細(xì)胞對(duì)于該肽的攝取效率。其所創(chuàng)建計(jì)算方法的篩選精確率達(dá)72.5%，明顯優(yōu)于其他現(xiàn)行的CPP預(yù)測方法。為了方便科研工作者使用，作者還設(shè)計(jì)了可公開訪問的web服務(wù)器：www.thegleelab.org/MLCPP。

2 多肽類導(dǎo)向分子優(yōu)化方法與策略的新進(jìn)展

在獲取多肽導(dǎo)向分子的初始階段中，多肽與靶標(biāo)的親和力和選擇性是最受關(guān)注的目標(biāo)。盡管如前所述，多肽文庫或化學(xué)設(shè)計(jì)技術(shù)的進(jìn)步已從源頭上提升了初篩多肽的質(zhì)量，但不可否認(rèn)的是，線性小肽仍是初篩階段的主要產(chǎn)物。這就需要研究者在兼顧親和力的同時(shí)，對(duì)候選多肽進(jìn)行優(yōu)化以滿足復(fù)雜生理環(huán)境下的應(yīng)用需求。本部分主要對(duì)多肽導(dǎo)向分子的穩(wěn)定性、免疫原性和功能集成3個(gè)方面的優(yōu)化研究進(jìn)行探討。

2.1 穩(wěn)定性優(yōu)化

穩(wěn)定性是多肽導(dǎo)向分子發(fā)揮功能的前提。復(fù)雜多變的病理生理環(huán)境如多種水解酶的水解以及pH變化等，會(huì)使多肽導(dǎo)向分子結(jié)構(gòu)斷裂、構(gòu)象改變并被迅速清除，難以持續(xù)發(fā)揮靶向功能。為了維持導(dǎo)向分子結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，研究者們近年來發(fā)展了嫁接、硒化、逆序、訂書肽等多種技術(shù)與方法。

2.1.1 硫-硒環(huán)化策略 多肽分子環(huán)化的研究從上世紀(jì)就已經(jīng)開始，是一種經(jīng)典的穩(wěn)定性優(yōu)化策略。但長期以來的單環(huán)化策略大多僅是將多肽的剛性增強(qiáng)，有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致親和力的損失，部分單環(huán)的穩(wěn)定性也不十分理想。近年來，以富二硫鍵多肽為模板（scaffold）來實(shí)現(xiàn)線性多肽的環(huán)化成為研究熱點(diǎn)。這一過程大致可分為：1）確認(rèn)候選多肽的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)和受體結(jié)合態(tài)結(jié)構(gòu)，線性多肽在游離狀態(tài)下一般結(jié)構(gòu)無序，但當(dāng)其與靶受體結(jié)合時(shí)會(huì)形成相應(yīng)的高級(jí)結(jié)構(gòu)；2）選擇與候選多肽受體結(jié)合態(tài)結(jié)構(gòu)相似的富二硫鍵多肽，作為模板；3）將候選多肽的關(guān)鍵氨基酸“嫁接”到模板肽上。新生成的多肽保留了原有線性多肽的功能并由于多對(duì)二硫鍵的固定，其穩(wěn)定性大幅提高。更值得一提的是，新生成的多肽由于提前形成了活性構(gòu)象，避免了從無序到有序變化的熵消耗，因而其對(duì)靶受體的親和力也得到了補(bǔ)償式的提高（與原線性多肽相比），很好地兼顧了穩(wěn)定性和功能性。筆者課題組曾以部分腫瘤細(xì)胞膜表面和胞內(nèi)均高表達(dá)的原癌蛋白鼠雙微粒體MDM2、MDMX為靶點(diǎn)，將p53與其結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)嫁接到蝎毒素BmBKTx1的α螺旋中，得到了能夠有效抑制p53與MDM2/MDMX 結(jié)合的微型肽[28]。另外，同樣針對(duì)該靶點(diǎn)，經(jīng)噬菌體展示篩選出了線性多肽配體PMI（序列為：TSFAEYWNLLSP），通過端基截取以及丙氨酸掃描等方法發(fā)現(xiàn)PMI與MDM2結(jié)合的活性位點(diǎn)分別為第3位苯丙氨酸（Phe3）、第6位酪氨酸（Tyr6）、第7位色氨酸（Trp7）和第10位亮氨酸（Leu10），而PMI與MDM2結(jié)合時(shí)其構(gòu)象為α螺旋結(jié)構(gòu)。課題組以蜂毒明肽為模板進(jìn)行嫁接，由于其α螺旋結(jié)構(gòu)始于第9位丙氨酸，嫁接方法為將其Ala9/Ala12/Arg13/Gln16分別用Phe/Tyr/Trp/Leu取代。嫁接肽具有良好的靶結(jié)合能力，且其血清半衰期達(dá)到原直鏈短肽的近100倍[29]。

腫瘤等部分疾病存在的還原性病灶微環(huán)境使得經(jīng)二硫鍵加固的環(huán)肽仍有進(jìn)一步提高穩(wěn)定性的需求。一些研究者采用了更為穩(wěn)定的硒硫鍵或二硒鍵代替二硫鍵以增強(qiáng)多肽對(duì)還原性環(huán)境的耐受能力。這個(gè)過程大多采用的是硒代半胱氨酸，也就是自然界第21種天然氨基酸來取代半胱氨酸。Arai等[30]將胰島素分子中半胱氨酸二硫鍵（S-S）替換為硒硫鍵(Se-S)，以獲得具有較長半衰期的胰島素衍生物。硒化胰島素（Se-Ins）維持了與牛胰島素類似的活性，且在胰島素降解酶（insulin degrading enzyme, IDE）的作用下，降解速度明顯減慢（Se-Ins降解半衰期約8 h，牛胰島素降解半衰期僅為約1 h）。筆者課題組將經(jīng)二硫鍵連接的腫瘤靶向環(huán)肽Lyp-1進(jìn)行硒化修飾，得到硒化類似物Syp-1。表面等離子共振結(jié)果證明 Syp-1保持了與靶受體p32的特異性結(jié)合能力，并較之Lyp-1表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的血清穩(wěn)定性以及更優(yōu)的體內(nèi)外效果，Syp-1修飾的載阿霉素脂質(zhì)體對(duì) MDA-MB-435 的體外 IC50為 588 nmol·L-1，與 Lyp-1（1.48 μmol·L-1）相比顯著降低，在體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)中也有相同趨勢[31]。

2.1.2 逆序策略 逆序策略，也稱為逆反化（retroinverso isomerization），是指將某些常規(guī)多肽的L型氨基酸全部替換成D型氨基酸，并將氨基酸序列顛倒，這樣得到的D型多肽與原來的多肽具有相似的側(cè)鏈拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)，因而可以替代原來的L型多肽。這種策略可以根據(jù)已有的L型多肽快速獲得具有高度穩(wěn)定性的全D型多肽。BBB是藥物遞送入腦的重要生理屏障，BBB上的乙酰膽堿受體（nAChR）等受體介導(dǎo)的穿細(xì)胞通路是跨越該屏障的重要途徑，然而該穿細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)通路涉及溶酶體，極易對(duì)相關(guān)導(dǎo)向分子造成酶解，影響其遞送效果。因此，要實(shí)現(xiàn)有效的跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)，需要導(dǎo)向分子在溶酶體中穩(wěn)定，這對(duì)導(dǎo)向分子的穩(wěn)定性提出了很高要求。Wei等[32]在其前期通過化學(xué)設(shè)計(jì)獲得nAChR特異性結(jié)合的L型多肽配體CDX的基礎(chǔ)上，經(jīng)逆序設(shè)計(jì)獲得了對(duì)應(yīng)的D肽分子DCDX。較LCDX而言，DCDX不僅提升了L型肽原有的活性，還將其血清穩(wěn)定性提高了近50倍，同時(shí)還大大提高了其在胞內(nèi)溶酶體中的穩(wěn)定性，使其在整個(gè)遞送過程中維持活性，有效跨越BBB。將DCDX修飾于脂質(zhì)體表面后，與原有L型肽相比，其在腦膠質(zhì)瘤模型上表現(xiàn)出更強(qiáng)的腦靶向能力和顯著更優(yōu)的治療效果。值得注意的是，逆序策略并非能任意使用，例如活性結(jié)構(gòu)為α螺旋結(jié)構(gòu)的多肽就不適用。逆序策略可以和篩選D型多肽的鏡像噬菌體展示技術(shù)在一定程度上互補(bǔ)[33-34]。

2.1.3 訂書肽策略 與將多肽分子進(jìn)行環(huán)化而提高結(jié)構(gòu)剛性不同，訂書肽技術(shù)（peptide stapling）旨在保護(hù)多肽結(jié)構(gòu)中α螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)。α螺旋是蛋白類分子常見的結(jié)構(gòu)，其中，在蛋白-蛋白相互作用區(qū)域的α螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白類分子的活性和功能常有重要意義。然而許多較短的多肽和微型蛋白類分子中，由于缺乏其他部位空間結(jié)構(gòu)的支撐和限制，其α螺旋結(jié)構(gòu)通常難以穩(wěn)定維持其原本的構(gòu)象和活性。因此，研究者們選用處于α螺旋中同一平面的2個(gè)氨基酸進(jìn)行訂合，從而對(duì)該α螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行加固。目前的多肽訂合反應(yīng)可分為2種：1）單組分訂合法：同一多肽分子中不同氨基酸側(cè)鏈直接鍵合；2）雙組分訂合法，通過一個(gè)具有雙功能的連接物，對(duì)不同氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行橋聯(lián)（見圖2）。

圖 2 單組分和雙組分訂合法Figure 2 One- and two-component stapling

Dietrich等[35]使用訂書肽策略設(shè)計(jì)了針對(duì)β-連環(huán)蛋白和T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)-結(jié)合因子轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用的抑制劑，從而抑制腫瘤相關(guān)的Wnt信號(hào)通路。同時(shí)，為了使目標(biāo)多肽能進(jìn)入細(xì)胞并達(dá)到作用部位，作者借鑒了部分穿膜肽疏水、帶正電的特點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，最終使用訂書肽策略設(shè)計(jì)的NLS-StAx-h蛋白-蛋白相互作用抑制劑具有較好的選擇性和較高的穩(wěn)定性，還具有較高的細(xì)胞攝取量，能夠有效抑制腫瘤Wnt信號(hào)通路相關(guān)的生長和遷移。

訂書肽策略也很快應(yīng)用到多肽導(dǎo)向分子的設(shè)計(jì)上。RGD序列在腦部腫瘤遞藥領(lǐng)域被廣泛研究，其整合素受體同時(shí)存在于新生血管和腫瘤細(xì)胞，具有促穿透和靶向的雙重功能，但部分小鼠大腦內(nèi)皮細(xì)胞的整合素受體表達(dá)并不高，膠質(zhì)瘤早期完整的BBB對(duì)遞藥仍造成限制。為了進(jìn)一步提高導(dǎo)向分子對(duì)BBB的穿透能力，同時(shí)維持其靶向腫瘤細(xì)胞的能力，Ruan等[36]設(shè)計(jì)了訂書肽型的環(huán)狀RGD（sRGD），在線性RGD序列的兩端分別引入R8、S5交聯(lián)氨基酸并利用烯烴復(fù)分解反應(yīng)成環(huán)，提高其穿透屏障的能力。將sRGD修飾在載紫杉醇的PEG-PLA膠束上后，能夠有效提高藥物對(duì)BBB的穿透能力，同時(shí)維持了后續(xù)介導(dǎo)藥物靶向腦腫瘤的能力。在小鼠U87腦膠質(zhì)瘤模型上，基于訂書肽策略設(shè)計(jì)的sRGD修飾的載紫杉醇膠束與普通環(huán)肽cRGD修飾相比，將荷瘤小鼠半數(shù)生存期從29 d延長至39.5 d。

2.2 免疫原性優(yōu)化

傳統(tǒng)認(rèn)為，潛在免疫原性低是多肽較之大分子作為導(dǎo)向分子的可能優(yōu)勢之一。然而新近以來研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)部分多肽導(dǎo)向分子與具有長循環(huán)功能的遞藥系統(tǒng)相結(jié)合后，其表現(xiàn)出較為明顯的免疫原性，這關(guān)乎整個(gè)遞藥系統(tǒng)在體內(nèi)的靶向效率以及安全性，今后需要重點(diǎn)關(guān)注。Wang等[37]發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的多肽導(dǎo)向分子c(RGDyK)修飾的脂質(zhì)體在體內(nèi)具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，甚至可誘發(fā)機(jī)體過敏性死亡。同時(shí)，環(huán)化和脂質(zhì)體修飾均明顯增強(qiáng)了c(RGDyK)最終的免疫原性，因此Wang等認(rèn)為導(dǎo)向分子的構(gòu)象和物理性質(zhì)均可能對(duì)其免疫原性有較大影響。

Guan等[38]發(fā)現(xiàn)其前期設(shè)計(jì)的腦靶向多肽導(dǎo)向分子DCDX具有一定正電荷且肽鏈相對(duì)較長，導(dǎo)致修飾于脂質(zhì)體表面后表現(xiàn)出一定的免疫原性，能與IgM發(fā)生吸附引起機(jī)體免疫反應(yīng)并快速排出體外。為此，作者通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)對(duì)DCDX進(jìn)行優(yōu)化，將其氨基酸序列大幅縮減到8個(gè)氨基酸并盡量去掉了帶正電荷的氨基酸，所得D8多肽吸附IgM的量明顯下降，有效降低了制劑在體內(nèi)的免疫原性，增加其靶向效率。該工作表明，多肽配體修飾的脂質(zhì)體，其表面蛋白冠吸附與配體的穩(wěn)定性、電荷、大小、疏水性等性質(zhì)密切相關(guān)，應(yīng)盡量設(shè)計(jì)正電荷少、鏈短的多肽導(dǎo)向分子以調(diào)節(jié)表面蛋白冠吸附，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)其免疫原性的優(yōu)化。

2.3 導(dǎo)向分子的功能集成

經(jīng)過篩選的多肽導(dǎo)向分子往往具有較高的親和力，然而部分復(fù)雜的疾病往往會(huì)對(duì)導(dǎo)向分子的功能提出更多要求。除了對(duì)單一靶標(biāo)的親和力之外，在不同疾病的治療中，還可能要求導(dǎo)向分子同時(shí)具有多種不同的性質(zhì)，例如能協(xié)助跨生理屏障（如BBB、口服吸收屏障等）并靶向病灶、對(duì)多個(gè)不同靶標(biāo)均具有靶向性等。為同時(shí)滿足上述多種需求，有許多研究使用了多個(gè)功能不同的導(dǎo)向分子平行修飾，共同作用，然而進(jìn)行復(fù)雜的多重修飾將對(duì)成藥性造成不利影響，這提示多功能集成是多肽導(dǎo)向分子的發(fā)展需求之一。

iRGD（CRGDKGPDC）是由9個(gè)氨基酸構(gòu)成的環(huán)肽，該片段含有能特異性結(jié)合整合素的RGD片段。與經(jīng)典RGD相同，iRGD能與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)的整合素受體αvβ3和αvβ5特異性結(jié)合，促進(jìn)藥物對(duì)該屏障的穿透。在結(jié)合整合素受體后，iRGD還能被酶切割激活，激活后該片段能與神經(jīng)纖維毛蛋白受體1和2（neuropilin-1，neuropilin-2）受體結(jié)合，激活CendR通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取[39]。因此，iRGD作為導(dǎo)向分子不需多重修飾，即可同時(shí)達(dá)到促血管穿透并靶向腫瘤的多重功能，故受到廣泛關(guān)注。Liu等[40]將iRGD修飾在聚乳酸-羥基乙酸共聚物/殼聚糖納米粒上，對(duì)卡莫司汀及其敏化劑進(jìn)行遞送，能夠有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，并在小鼠模型上實(shí)現(xiàn)了對(duì)BBB更強(qiáng)的穿透能力，以及在腦腫瘤部位更多的富集，取得了較好的治療效果。

受到iRGD功能集成的啟示，研究者們針對(duì)特定疾病需求，在針對(duì)單一靶點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，對(duì)多個(gè)多肽或微型蛋白進(jìn)行了序列拼接，或直接進(jìn)行多功能的從頭設(shè)計(jì)，最終達(dá)到在一個(gè)導(dǎo)向分子上按需進(jìn)行功能集成的優(yōu)化目的。例如，遞送藥物到病灶的過程中，可能需要克服多重生理屏障，要求導(dǎo)向分子集成跨不同生理屏障的能力，Belhadj等[41]針對(duì)腦部腫瘤遞送中的BBB和血-腦腫瘤屏障，將RGD環(huán)肽和對(duì)羥基苯甲酸偶聯(lián)為一個(gè)Y字型的集成導(dǎo)向分子，該導(dǎo)向分子既能發(fā)揮RGD環(huán)肽識(shí)別血-腦腫瘤屏障和膠質(zhì)瘤的功能，又能發(fā)揮對(duì)羥基苯甲酸穿透BBB的能力。例如，將針對(duì)病灶不同靶點(diǎn)的導(dǎo)向分子進(jìn)行集成后，相對(duì)單靶向的導(dǎo)向分子，其對(duì)病灶常具有更高的敏感性，尤其是在病灶具有異質(zhì)性的情況下，其優(yōu)勢更為明顯。胃泌素釋放肽受體（gastrin-releasing peptide receptor, GRPR）和神經(jīng)肽Y1受體（neuropeptide Y1 receptor，Y1）在乳腺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞膜上都會(huì)過表達(dá)，為進(jìn)一步提高導(dǎo)向分子對(duì)腫瘤的靶向能力，研究者們據(jù)此設(shè)計(jì)了若干集成的多肽配體。Ghosh等[42]將GRPR靶向配體和Y1靶向配體相拼接，設(shè)計(jì)了一種可實(shí)現(xiàn)對(duì)于GRP和Y1受體雙靶向的多肽導(dǎo)向分子探針t-BBN/BVD15-DO3A，并在T-47D和MCF-7這2種乳腺癌細(xì)胞模型上證明了該集成導(dǎo)向分子的親和力。隨后，該課題組對(duì)該集成導(dǎo)向分子的血清穩(wěn)定性和體外代謝降解情況進(jìn)行了研究，通過研究發(fā)現(xiàn)雙靶向多肽分子在血清中穩(wěn)定性顯著增加，具有進(jìn)一步應(yīng)用的潛力[43]。

3 發(fā)展趨勢與展望

上述多肽導(dǎo)向分子的來源及優(yōu)化部分實(shí)際上已涉及到大量的應(yīng)用，因此本部分僅對(duì)多肽導(dǎo)向分子的應(yīng)用趨勢進(jìn)行簡述。隨著相關(guān)領(lǐng)域的快速發(fā)展，多肽導(dǎo)向分子的應(yīng)用已不再僅限于靶向病灶細(xì)胞本身。以多肽導(dǎo)向分子應(yīng)用較多的腫瘤為例，導(dǎo)向分子的靶點(diǎn)一方面從單純的靶向病灶延伸到遞送過程中跨越各種臟器、組織乃至胞內(nèi)的生理屏障，另一方面，目標(biāo)也從腫瘤細(xì)胞延伸到更加復(fù)雜的腫瘤相關(guān)微環(huán)境，包括腫瘤新生淋巴管、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞甚至病理pH條件等[44-46]。

當(dāng)然，多肽導(dǎo)向分子針對(duì)的疾病種類也從腫瘤延伸到了更大范圍。例如，在匱乏新抗生素類藥物的背景下，通過導(dǎo)向分子介導(dǎo)藥物靶向病原微生物應(yīng)該是和開發(fā)全新的小分子實(shí)體藥物具有同等重要性。一些具有一定抗菌能力的抗菌肽同時(shí)也能扮演導(dǎo)向分子的功能，多肽-抗生素偶聯(lián)物也開始引起關(guān)注[47-49]。而通過多肽文庫同樣也能篩選出針對(duì)具體病原微生物的識(shí)別分子，從而有效介導(dǎo)靶向治療[50]。

盡管本身不是發(fā)揮藥效的主要部分，導(dǎo)向分子的重要性并不亞于藥效部分。針對(duì)新藥研究的新技術(shù)和新策略同樣可用于對(duì)多肽導(dǎo)向分子的性能優(yōu)化。為平衡復(fù)雜疾病治療需求和設(shè)計(jì)從簡的成藥性考量，功能集成的多肽導(dǎo)向分子將是今后發(fā)展和值得深入研究的重要方向。例如，針對(duì)不同靶點(diǎn)的多功能導(dǎo)向分子，其不同功能片段之間的比例、距離、連接段的剛性、對(duì)不同靶點(diǎn)的結(jié)合與解離動(dòng)力學(xué)，以及結(jié)合后引發(fā)的一系列生理變化，甚至部分目標(biāo)靶點(diǎn)之間的相互作用等，這些作用時(shí)機(jī)、作用動(dòng)力學(xué)、生理功能等許多方面的問題，都是今后研究中值得考慮的因素。

疾病相關(guān)的靶受體大多具有內(nèi)源性配體，有的甚至還存在內(nèi)源性抗體。目前，多肽導(dǎo)向分子和上述內(nèi)源性成分在相同靶受體上的識(shí)別位點(diǎn)往往是重疊的，這就可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性的干擾或抑制。隨著多肽蛋白相關(guān)生物學(xué)、化學(xué)及計(jì)算科學(xué)等的不斷強(qiáng)力融合，針對(duì)目標(biāo)蛋白更加“隨心所欲”地獲取多肽配體已變得可能[26]。通過避開靶受體的正位來設(shè)計(jì)能識(shí)別其“別位”的多肽配體，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源性競爭的高效規(guī)避，從而在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用[51-52]。