李國(guó)祥 鄧杰 曾磊 史伯安 雷福厚

摘?要?以腰果酚、松香、球形硅膠為主要原料，制備了SiO2/松香-腰果酚核殼型高效液相色譜柱，可高效分離天麻素。將腰果酚進(jìn)行酯化改性，封閉酚羥基，然后以腰果酚酯為單體、改性松香為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，將三者混合并均勻涂敷到硅膠表面，通過(guò)自由基聚合反應(yīng)成功制備了一種核（SiO2）-殼（膜）型液相色譜固定相。采用紅外光譜、掃描電鏡和透射電鏡對(duì)固定相進(jìn)行了表征。采用濕法裝柱，并選用苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷和對(duì)甲氧基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作為天麻素的競(jìng)爭(zhēng)分子，以乙腈-0.05% H3PO4（3∶97，V/V）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流速0.3 mL/min，初步研究了固定相在室溫下對(duì)天麻素的分離性能。此固定相的粒徑約為5 μm，且粒徑分布均一，殼（膜）厚約75 nm，對(duì)天麻素具有良好的拆分性能，對(duì)2種競(jìng)爭(zhēng)分子的分離度（Rs）分別為7.43和12.35。本方法簡(jiǎn)單高效，為天麻素的分離純化提供了新思路。

關(guān)鍵詞?腰果酚; 松香; 核殼型固定相; 天麻素; 液相色譜

1?引 言

天麻素的化學(xué)名為4-羥甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，是中藥天麻的有效活性成分之一，具有良好的鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗衰老及增強(qiáng)免疫力等功效[1，2]，廣泛用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。從植物天麻中分離提取天麻素是獲取天麻素的重要方法。目前，分離純化天麻素的方法主要有柱色譜法[3，4]（包括硅膠層析法和分子印跡柱色譜法）和大孔吸附樹(shù)脂純化法[5]。這些方法雖然能較好地分離純化天麻素，但也存在明顯的不足。一方面，糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致粗提液濃稠粘黏，操作困難，耗時(shí)較長(zhǎng)，有機(jī)溶劑消耗量大，柱層析的效率較低[3，6]; 另一方面，許多大孔吸附樹(shù)脂主要是由苯乙烯和二乙烯基苯合成，分離純化過(guò)程中可能有毒性原料殘留在天麻素中，嚴(yán)重威脅天麻素類(lèi)藥品和保健食品的安全[7～9]。因此，開(kāi)發(fā)低毒、高效地分離純化天麻素的方法意義重大。

高效液相色譜法（HPLC）因其簡(jiǎn)單、高效等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物分離純化[10，11]。該方法的關(guān)鍵是制備選擇性好、來(lái)源豐富、價(jià)格低廉的色譜固定相。傳統(tǒng)的液相色譜固定相一般是以球形硅膠為原料，通過(guò)涂敷或鍵合的方式，在硅膠表面引入具有高選擇性的物質(zhì)[12，13]。對(duì)分離天然藥物而言，涂敷型固定相的性能優(yōu)于鍵合型固定相，但涂覆型固定相難以涂敷均勻，且受流動(dòng)相的影響，具有易溶脹、流失的缺陷[14]。因此，采用既能涂覆均勻、又能防止溶脹流失的方法對(duì)于制備涂覆型固定相非常關(guān)鍵。

松香是天然無(wú)毒、價(jià)格低廉的林產(chǎn)品，主要由樹(shù)脂酸組成（圖1A）。樹(shù)脂酸是一類(lèi)分子式為C19H29COOH的同分異構(gòu)體的總稱(chēng)，主要成分為樅酸（圖1B），分子中獨(dú)特的氫化菲環(huán)結(jié)構(gòu)使其具有較好的力學(xué)剛性[15]。腰果酚是腰果殼油的主要成分，苯環(huán)上連有羥基，間位連有C15長(zhǎng)鏈，具有不飽和烴的性質(zhì)，有較好的柔韌性[16]。以腰果酚功能單體和松香基交聯(lián)劑合成的腰果酚-松香基聚合物具有豐富的立體結(jié)構(gòu)，能選擇性識(shí)別大分子物質(zhì)，這對(duì)色譜分離非常重要[17，18]。本研究組前期工作中，以松香為原料合成出了松香基液相色譜固定相，并成功分離了小檗堿、紫杉醇等生物堿及5種芳香烴[15，19，20]?；谇捌诘难芯拷Y(jié)果，本研究將封閉羥基的腰果酚涂敷于球形硅膠表面作為功能單體，以改性松香為交聯(lián)劑，采用微乳液表面聚合法合成腰果酚-松香基聚合物，在硅膠表面形成一層均勻的膜，得到核（SiO2）-殼（膜）型結(jié)構(gòu)的液相色譜固定相，并用于高效分離天麻素。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Nicolet公司）; Zeiss Supra 55 Sapphire掃描電鏡（德國(guó)蔡司公司）; Tecnai-G2-F30 FEI透射電鏡（美國(guó)FEI公司）; Z0050716型裝柱機(jī)（美國(guó)Scientific Systems公司）; 不銹鋼色譜柱（4.6 mm×250 mm，大連伊力特分析儀器有限公司）; LC-15C分析型高效液相色譜儀（日本島津公司）。

腰果酚（濟(jì)寧華凱樹(shù)脂有限公司）; 改性松香交聯(lián)劑（廣西民族大學(xué)林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）; 硅膠（蘇州納微科技公司）; 石油醚（沸點(diǎn)60℃～90℃）、3-（異丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（阿拉丁試劑公司）; 天麻素對(duì)照品（≥95.4%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）; 苯基-β-D吡喃葡萄糖苷（>98%）、4-甲氧基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷（>98%）、偶氮二異丁腈（阿拉丁試劑公司）; 乙腈（GR，美國(guó)Fisher Scientific公司）。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2?核殼型固定相的制備和表征

2.2.1?腰果酚酯的制備[21] 稱(chēng)取6 g腰果酚于單口燒瓶中，滴入2.4 g三乙胺，加入55 mL石油醚（沸點(diǎn)60℃～90℃）溶解，加入甲基丙烯酰氯3.3 g，冰水浴下反應(yīng)1.5 h，然后升溫至70℃回流反應(yīng)4 h，抽濾，收集濾液并洗至中性，旋蒸后真空干燥，得到腰果酚酯。

2.2.2?硅膠烷基化?稱(chēng)取5 g硅膠（5 μm）于單口燒瓶中，加入50 mL 10% HCl溶液，在70℃下油浴回流7 h，反應(yīng)結(jié)束后，將硅膠洗至中性，在80℃下真空干燥12 h。稱(chēng)取活化硅膠于單口燒瓶中，加入甲苯、吡啶及3-（異丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷，在80℃下油浴回流反應(yīng)8 h，整個(gè)反應(yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。產(chǎn)物依次用丙酮、甲醇、正己烷洗滌，真空干燥，得到硅烷化硅膠，記為SP0。

2.2.3?核殼型固定相的制備?將腰果酚酯、改性松香交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈配成油相，超聲處理3～4 min，使其均勻分散，將油相溶于氯仿中，得到質(zhì)量體積濃度為5.4%混合溶液。將混合溶液涂覆到硅烷化硅膠上，并置于250 mL單口燒瓶中，稱(chēng)取3 g十二烷基硫酸鈉溶于100 g水中，倒入到單口燒瓶中，加裝球形冷凝管，85℃反應(yīng)2 h，95℃反應(yīng)2.5 h。產(chǎn)物經(jīng)無(wú)水乙醇索氏提洗，過(guò)篩，即得到SiO2/松香-腰果酚核殼型固定相，記為SP1。

2.2.4?形貌以及成分表征?將腰果酚和腰果酚酯在65℃進(jìn)行真空干燥12 h，將干燥后的樣品涂抹到KBr晶片上，采用傅里葉變換紅外光譜儀在4000～450 cm1范圍下掃描; 取少量固定相于樣品管中，加入甲醇超聲，得到均勻分散的懸浮液，用毛細(xì)管取少量滴到導(dǎo)電膠上干燥后固定在銅板上，對(duì)微球進(jìn)行噴鉑處理，在2.5 kV條件下用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）以及透射電子顯微鏡（TEM）進(jìn)行形貌觀察。

2.2.5?裝柱?采用濕法裝柱，用恒壓泵將目標(biāo)固定相填充于不銹鋼色譜空柱（250 mm×4.6 mm），在42 MPa的壓力下裝柱30 min，在21 MPa的壓力下裝柱20 min，待柱壓平衡后，將色譜柱卸下，裝上柱頭及篩板，得到SiO2/松香-腰果酚核殼型固定相色譜柱。

2.3?液相色譜實(shí)驗(yàn)

分別配制濃度為5×104 mol/L天麻素和苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、天麻素和對(duì)甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷的混合樣品溶液，用SiO2/松香-腰果酚核殼型固定相色譜柱分離天麻素及其衍生物。檢測(cè)條件：檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流動(dòng)相為乙腈-0.05% H3PO4溶液（3∶97，V/V），柱溫25℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL。分離度（Rs）依據(jù)公式Rs= 2（t2-t1）/（W1+W2） 計(jì)算，其中，t1、t2分別為相鄰兩峰中前一峰和后一峰的保留時(shí)間; W1、W2分別為此相鄰兩峰的峰寬。

3?結(jié)果與討論

3.1?SiO2/松香-腰果酚核殼型固定相的制備

腰果酚酯的制備過(guò)程原理如圖2所示。在堿性條件下，甲基丙烯酰氯分子中的酰氯鍵斷裂，與腰果酚的羥基發(fā)生取代反應(yīng)，形成一個(gè)新的酯鍵。產(chǎn)物的紅外光譜如圖3所示。在3500～3000 cm1范圍內(nèi)的吸收峰主要是羥基的吸收峰。與腰果酚相比，腰果酚酯在此范圍內(nèi)的吸收峰消失，且在1710 cm1處有CO雙鍵的吸收峰，這是酯基的特征吸收峰，說(shuō)明已成功合成了腰果酚酯，封閉了腰果酚的羥基。

硅烷化硅膠的紅外光譜如圖4所示。3440 cm1處是硅膠表面的羥基吸收峰，942 cm1為SiOH的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰。與硅膠相比，硅烷化硅膠在3440 cm1處羥基的吸收峰明顯變小，942 cm1的SiOH的吸收峰完全消失，且在1708 cm1處出現(xiàn)了酯基的CO雙鍵的吸收峰，說(shuō)明已經(jīng)成功對(duì)硅膠進(jìn)行了硅烷化改性。

將腰果酚酯涂敷在經(jīng)3-（異丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷改性的球形硅膠表面，在設(shè)計(jì)條件下，在硅烷化硅膠表面發(fā)生原位聚合，形成一層均勻的薄膜。SiO2/松香-腰果酚核殼型固定相的表面形貌如圖5所示。由圖5A和圖5C可知，SP0和SP1固定相均具有良好的球形結(jié)構(gòu)，粒徑約5 μm，分布較均一; 與SP0相比，SP1固定相表面較為粗糙，存在明顯的附著物; 比較圖5B和圖5D可知，表面附著的是一層均勻的薄膜，厚度約75 nm。上述結(jié)果表明，已成功制備了SiO2/松香-腰果酚核殼型結(jié)構(gòu)的材料。

3.2?對(duì)天麻素的分離性能

為了研究SiO2/松香-腰果酚核殼型固定相對(duì)天麻素的分離性能，選擇與天麻素分子結(jié)構(gòu)非常相似的2種天麻素衍生物苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷和對(duì)甲氧基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作為競(jìng)爭(zhēng)分子，其結(jié)構(gòu)如圖6所示。

以乙腈-0.05%磷酸（3∶97，V/V）為流動(dòng)相，流速0.3 mL/min，柱溫25℃的條件下考察了SP1固定相對(duì)天麻素及其衍生物的分離性能。圖7A為天麻素和苯基β-D吡喃葡萄糖苷混合物在SP1色譜柱上的分離譜圖，天麻素和苯基β-D吡喃葡萄糖苷在SP1色譜柱上完全實(shí)現(xiàn)了基線分離，分離度Rs=7.43，表明SP1色譜柱對(duì)天麻素和苯基β-D吡喃葡萄糖苷具有較好的拆分性能。圖7B為天麻素和對(duì)甲氧基苯基β-D吡喃葡萄糖苷混合物的色譜圖，天麻素和對(duì)甲氧基苯基β-D吡喃葡萄糖苷在SP1色譜柱上也可以實(shí)現(xiàn)完全基線分離，分離度Rs=12.35，同樣表明了SP1色譜柱對(duì)天麻素和對(duì)甲氧基苯基β-D吡喃葡萄糖苷也具有較好的拆分能力。天麻素和2種競(jìng)爭(zhēng)分子的分離度均大于6。較高的分離度表明，在本實(shí)驗(yàn)的色譜條件下，SiO2/松香-腰果酚核殼型液相色譜固定相能高效分離天麻素及其衍生物，為天麻素的分離純化提供了一種新的方法和思路。

4?結(jié) 論

以腰果酚和松香2種可再生資源為原料，在改性球形硅膠表面通過(guò)原位聚合，成功制備了一種SiO2/松香-腰果酚酯核殼型液相色譜固定相。此固定相對(duì)天麻素具有較好的分離選擇性，能完全基線分離天麻素及其競(jìng)爭(zhēng)分子。此固定相制備方法簡(jiǎn)單易行，原料豐富易得，對(duì)實(shí)現(xiàn)天麻素的高效分離純化提供了新的途徑，有較好的應(yīng)用前景。

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