杜盼盼+耿志明+任雙

摘要：建立了豬蹄（耳）表皮中脫氫松香酸的高效液相色譜分析方法。樣品中的脫氫松香酸經(jīng)乙腈提取離心后，采用高效液相色譜-熒光檢測器進(jìn)行檢測。色譜柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：2 mmol/L磷酸溶液-甲醇（體積比14 ∶86）；流速：1 mL/min；激發(fā)波長225 nm，發(fā)射波長288 nm。結(jié)果表明：線性范圍0.05～2 mg/L，檢出限為0.05 μg/g，定量限為0.15 μg/g。在0.5～5 μg/g的添加范圍內(nèi)回收率為84.5%～98.9%。實(shí)際樣品檢測結(jié)果顯示，部分生熟豬蹄（耳）制品檢出脫氫松香酸，含量1.01～2.04 μg/g。本研究建立的分析方法方便、快捷，具有良好的靈敏度和準(zhǔn)確性，可用于豬蹄（耳）表皮組織中脫氫松香酸的檢測。

關(guān)鍵詞：豬蹄；豬耳；高效液相色譜；脫氫松香酸；松香

中圖分類號： TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0309-03

松香是以松樹為原料加工得到的非揮發(fā)性天然樹脂，廣泛應(yīng)用于化妝品、藥品、食品包裝材料以及造紙、建筑等領(lǐng)域[1-3]。松香酸和脫氫松香酸是松香的主要成分[4]。研究表明，松香酸、脫氫松香酸及其氧化產(chǎn)物是皮膚接觸過敏原[5-6]，對魚類的生長發(fā)育具有不利影響[7]，會降低方形網(wǎng)紋溞生殖能力[8]、導(dǎo)致人體上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞生物活性顯著下降[9]，以及人體紅細(xì)胞和多核性白細(xì)胞壞死[10-11]。松香具有良好的黏附性，曾廣泛用于畜禽屠宰加工的二次脫毛工序。2009年，我國明令禁止在畜禽屠宰中使用松香脫毛，但小企業(yè)、小作坊畜禽屠宰加工時(shí)違法使用松香脫毛的現(xiàn)象依然十分嚴(yán)重。在使用松香脫毛時(shí)，松香主要成分松香酸和脫氫松香酸，通過畜禽胴體表皮毛孔殘留在表皮組織中，并且后續(xù)加工方式（腌制、蒸煮、烘烤等）難以將其有效去除[12]。消費(fèi)者食用以松香脫毛加工畜禽肉為原料的食品，可能會對人體健康帶來安全隱患。

有關(guān)松香酸和脫氫松香酸的分析方法主要有氣相色譜法（GC）[13-14]、高效液相色譜法（HPLC）[15-16]、酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[17]等，分析的對象主要包括中藥材[18]、包裝材料、化妝品以及造紙企業(yè)廢水等。畜禽肉制品中松香殘留的安全隱患已引起人們的關(guān)注，張?zhí)K珍等分別建立了水禽表皮組織中松香酸和脫氫松香酸含量的高效液相-紫外（HPLC-UV）檢測方法，并對白條鴨以及鹽水鴨、烤鴨等制品中松香酸和脫氫松香酸的含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)相當(dāng)高比例的樣本中同時(shí)含有松香酸和脫氫松香酸[19-20]。

豬頭、豬蹄的加工曾廣泛采用松香脫毛，小作坊違法使用松香加工豬頭、豬蹄的現(xiàn)象仍時(shí)有報(bào)道[21]。本研究在前期建立的肉鴨表皮組織中脫氫松香酸殘留HPLC-UV檢測方法[20]的基礎(chǔ)上，以豬蹄（耳）為對象，建立豬蹄（耳）表皮中脫氫松香酸的高效液相-熒光（HPLC-FLD）檢測法，并對市場上銷售的生熟豬蹄（耳）表皮中的脫氫松香酸含量進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬蹄（耳）購自南京天環(huán)食品有限公司，將8個(gè)未脫毛的豬蹄采用人工脫毛和松香脫毛，然后分別將其中2個(gè)人工脫毛和松香脫毛的豬蹄煮熟。人工脫毛和松香脫毛的豬蹄分別作為陰性樣本和陽性樣本。豬耳的處理同上。所有樣本取表皮組織，剁碎，混合均勻，-20 ℃條件下保存。

調(diào)查樣本豬蹄（耳）購于附近生豬肉商販、鹵肉店和大型超市。所有樣本取表皮組織，剁碎，混合均勻，-20 ℃條件下保存。

脫氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%），加拿大TRC公司；乙腈（色譜純），美國默克公司；甲醇（色譜純），美國默克公司；超純水由ULUPURE純水儀制備，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters高效液相色譜（配有e2475可變波長熒光檢測器FLD及Empower色譜工作站），美國沃特世公司；高速冷凍離心機(jī)，德國Herolab公司；KQ-300DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平，意大利BEL公司；XW-80A微型渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廠；純水儀，西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 稱取適量脫氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶于乙腈，配制成100 mg/L的脫氫松香酸儲備液。吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇稀釋配制成濃度為0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L的脫氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)品的系列工作溶液。

1.3.2 樣品處理 稱取1 g混合均勻的樣品于10 mL離心管中，加入5 mL乙腈，渦旋振搖混合1 min，超聲波充分振蕩15 min，離心機(jī)5000 r/min離心5 min。準(zhǔn)確吸取4 mL上清液，氮吹儀吹干，用2 mL甲醇溶解后，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，待高效液相色譜分析。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：2 mmol/L磷酸溶液-甲醇（體積比14 ∶86）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；激發(fā)波長225 nm，發(fā)射波長 288 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.4 精密度試驗(yàn) 稱取混合均勻的陽性樣本6份，按照上述樣本處理方法處理，進(jìn)行高效液相色譜測定，測定的試驗(yàn)結(jié)果分析計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3.5 回收率試驗(yàn) 稱取陽性豬蹄表皮樣本1 g于10 mL離心管，分別添加0.5、1.0、5.0 μg脫氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)品，在室溫下放置30 min。按照上述樣本處理方法進(jìn)行脫氫松香酸的提取，最后用高效液相色譜進(jìn)行測定，以測定的脫氫松香酸含量減去樣本原有量和添加量的比值計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本處理

在松香酸和脫氫松香酸的HPLC-UV分析方法中，樣本中的松香酸和脫氫松香酸通常采用有機(jī)溶劑（甲醇、乙腈等）提取，通過固相萃?。⊿PE）小柱凈化除去基質(zhì)中的干擾物質(zhì)。脫氫松香酸除了具有紫外吸收外，還具有熒光特性。本試驗(yàn)利用脫氫松香酸具有的熒光特性，采用熒光檢測器進(jìn)行檢測，并觀察了SPE小柱對脫氫松香酸色譜圖的凈化效果。結(jié)果表明，樣本中的脫氫松香酸經(jīng)乙腈提取直接進(jìn)行HPLC-FLD分析，干擾物質(zhì)即可與脫氫松香酸獲得基線分離，SPE小柱未明顯改善脫氫松香酸的分離效果。提取液離心吹干后直接進(jìn)樣分析，節(jié)約成本并縮短了分析時(shí)間。

2.2 色譜條件優(yōu)化

脫氫松香酸的最大紫外吸收峰在200 nm，但在實(shí)際利用紫外檢測器進(jìn)行分析時(shí)，在200 nm分析目標(biāo)物會受到樣品基質(zhì)的干擾，盡管可以通過適當(dāng)增加檢測波長降低基質(zhì)干擾，但也會對靈敏度帶來不利影響。本研究根據(jù)脫氫松香酸的熒光特性，建立其HPLC-FLD檢測方法，并通過激發(fā)波長和發(fā)射波長的掃描，確立脫氫松香酸的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為225 nm和288 nm。

本研究還觀察了3種流動相體系0.1%甲酸溶液-甲醇（體積比2 ∶8）、2%冰醋酸溶液-甲醇（體積比1 ∶9）和不同比例的2 mmol/L磷酸溶液-甲醇，對脫氫松香酸在反相C18柱保留效果的影響。結(jié)果表明，2 mmol/L磷酸-甲醇（體積比14 ∶86）作為流動相時(shí)，脫氫松香酸峰形良好、保留時(shí)間適中。

本研究還觀察了溫度對脫氫松香酸在反相C18柱上的保留效果的影響，發(fā)現(xiàn)溫度對脫氫松香酸的保留時(shí)間有一定影響，但對檢測靈敏度影響不大。結(jié)果表明適宜條件為溫度30℃，在設(shè)定的色譜條件下，脫氫松香酸保留時(shí)間約 10.1 min。圖1和圖2分別是本試驗(yàn)設(shè)定的色譜條件下標(biāo)樣和陽性樣本中脫氫松香酸的色譜圖。

2.3 方法的線性范圍、檢測限和定量限

本研究通過建立脫氫松香酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以外標(biāo)法分析樣品中的脫氫松香酸含量。用流動相分別配制質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L的脫氫松香酸系列工作濃度，進(jìn)行檢測分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線以脫氫松香酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，以峰面積為縱坐標(biāo)y，得到線性回歸方程y=2 804 890x+58 110，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。由此可以看到在0.05～2.0 mg/L范圍內(nèi)，脫氫松香酸質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。按照3倍信噪比（RSN=3）和10倍信噪比（RSN=10）計(jì)算檢測限和定量限，分別為0.05、0.15 μg/g 。

2.4 精密度和回收率試驗(yàn)

本方法的精密度通過陽性樣本的日內(nèi)和日間試驗(yàn)來評價(jià)。其中，生豬蹄陽性樣本日內(nèi)試驗(yàn)脫氫松香酸的平均含量為1.83 μg/g，精密度RSD為4.4%；日間試驗(yàn)脫氫松香酸的平均含量為1.80 μg/g，精密度RSD為5.5%。 熟豬蹄陽性樣本日內(nèi)試驗(yàn)脫氫松香酸的平均含量為1.62 μg/g，精密度RSD為3.1%；日間試驗(yàn)脫氫松香酸的平均含量為1.58 μg/g，精密度RSD為4.4%。生豬耳陽性樣本日內(nèi)試驗(yàn)脫氫松香酸的平均含量為1.93 μg/g，精密度RSD為3.1%；日間試驗(yàn)脫氫松香酸的平均含量為1.96 μg/g，精密度RSD為4.6%。熟豬耳陽性樣本日內(nèi)試驗(yàn)脫氫松香酸的平均含量為1.68 μg/g，精密度RSD為4.2%；日間試驗(yàn)脫氫松香酸的平均含量為 1.73 μg/g，精密度RSD為4.6%。試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的豬蹄（耳）表皮脫氫松香酸含量測定方法具有較好的精密度。

為驗(yàn)證本研究建立的豬蹄（耳）表皮中脫氫松香酸含量檢測方法的準(zhǔn)確度，本試驗(yàn)采用合適的陰性樣本進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。在陽性添加回收試驗(yàn)中，生熟豬蹄脫氫松香酸的回收率范圍為84.5%～92.8%。，生熟豬耳脫氫松香酸的回收率范圍為86.7%～98.9%。試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的豬耳豬蹄表皮脫氫松香酸含量測定方法具有較好的準(zhǔn)確度。

2.5 實(shí)際樣本分析

本研究選取一般鹵肉店、品牌鹵肉店、超市等26個(gè)豬耳豬蹄樣本，按照“1.3.2”節(jié)樣本預(yù)處理后分析表皮組織中的殘留脫氫松香酸含量，結(jié)果見表2。生豬肉商販采集的樣本包括8個(gè)生豬蹄，其中1個(gè)生豬蹄檢出脫氫松香酸，含量1.33 μg/g，陽性率12.5%，一般鹵肉店9個(gè)加工過的熟食豬蹄或豬耳（熟食制品），4個(gè)熟食制品檢出脫氫松香酸，含量1.01～2.04 μg/g，陽性率為44.4%；品牌鹵肉店和超市采集的9個(gè)樣本均未檢出脫氫松香酸。

從上述結(jié)果可以看出，農(nóng)貿(mào)市場生豬肉商販中的生豬蹄只有少量采用松香進(jìn)行脫毛處理，但一般鹵肉店家庭作坊生產(chǎn)制作的熟食制品的陽性率高達(dá)44.4%，表明這些作坊在加工熟食制品前仍然采用松香脫毛處理，這也與新聞媒體有關(guān)家庭作坊違法使用松香生產(chǎn)熟食制品的報(bào)道基本一致。品牌鹵肉店和超市采集的樣本中未檢出脫氫松香酸，表明正規(guī)企業(yè)生產(chǎn)加工生熟豬蹄和豬耳等制品時(shí)不使用松香進(jìn)行二次脫毛處理，產(chǎn)品質(zhì)量值得信賴。與張?zhí)K珍等報(bào)道的鴨肉生熟制品[19-20]相比，本試驗(yàn)中陽性樣本豬蹄、豬耳的脫氫松香酸含量相對較低。豬耳豬蹄的表皮毛孔比鴨鵝表皮致密得多，這可能是其脫氫松香酸含量相對較低的原因，但超過四成的家庭作坊生產(chǎn)制作的豬蹄（耳）等熟食制品檢出松香殘留，可能帶來的食品安全隱患值得關(guān)注。

3 結(jié)論

本研究建立了豬蹄（耳）表皮組織中脫氫松香酸含量的HPLC-FLD檢測方法，樣品中的脫氫松香酸經(jīng)乙腈和超聲波振蕩提取，以2 mmol/L磷酸溶液-甲醇（體積比14 ∶86）為流動相，在反相C18柱進(jìn)行分離，用熒光檢測器進(jìn)行檢測。線性范圍0.05～2 mg/L，檢測限和定量限分別為0.05 μg/g和0.15 μg/g。在0.5～5 μg/g的添加回收試驗(yàn)中，生熟豬蹄的平均回收率為89.2%；生熟豬耳的平均回收率為93.2%。對農(nóng)貿(mào)市場中的生豬肉商販、鹵肉店和超市中的生熟豬蹄和豬耳進(jìn)行了采樣分析。結(jié)果表明，農(nóng)貿(mào)市場采集的部分生熟豬蹄（耳）中檢出脫氫松香酸。本研究建立的豬蹄（耳）表皮中脫氫松香酸的高效液相色譜檢測方法，可用于生熟豬蹄、豬耳制品中脫氫松香酸殘留的測定，也可用于生熟豬蹄、豬耳制品生產(chǎn)過程中違法使用松香二次脫毛的監(jiān)管，對于確保食品質(zhì)量安全具有一定意義。

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