季幸姝,李燕舞,周福生,侯麗穎

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)期刊中心，廣東廣州 510006）

中醫(yī)“肺與大腸相表里”理論，最早源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，是中醫(yī)臟腑表里學(xué)說的重要組成部分，對指導(dǎo)臨床有著不可忽視的重要作用。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的知識，大都認(rèn)為中醫(yī)的“肺和大腸”，基本上與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的肺與腸道相吻合。目前對“肺與大腸相表里”的實驗研究，從肺與大腸生理、病理上的聯(lián)系，可以找到一些散在的、間接的證據(jù)。胚胎發(fā)育期肺與大腸密切的生理關(guān)系顯示，肺、氣管由腸的前腸發(fā)展而來，呼吸道上皮和腺體由原腸內(nèi)胚層分化而成。肺、氣管與腸的結(jié)構(gòu)來源是相同的，這可能成為“肺與大腸相表里”這一理論的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，使該理論從蛋白質(zhì)角度出發(fā)研究其實質(zhì)成為可能。因此，本研究試圖從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的角度，從中醫(yī)腸病及肺的角度，尋找肺腸相關(guān)指標(biāo)，即通過觀察“便秘”模型小鼠的結(jié)腸組織差異表達(dá)蛋白，研究與分析“腸病及肺”，從而揭示“腸病及肺”的病理機(jī)制，以便更好地理解和完善中醫(yī)臟腑表里理論，為臨床治療和中醫(yī)理論客觀化提供依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 NIH小鼠20只，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，顆粒飼料喂養(yǎng)，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。許可證號：SCXK（粵）2008-0002，粵監(jiān)證字2008A021。

1.2 藥品 復(fù)方地芬諾酯片，常州康普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：0903037。

1.3 儀器與試劑 LEICA-UCT型超薄切片機(jī)（德國Leica公司）；JEM-1200EX型透射電鏡（日本電子株式會社）。體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定液、0.1 moL∕L磷酸鹽緩沖液、體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸固定液、乙醇、Spurr樹脂、醋酸鈾、枸櫞酸（上海生化）。

1.4 復(fù)制便秘小鼠模型 實驗隨機(jī)分成2組：正常組、便秘組。按10mg·kg-1含藥標(biāo)準(zhǔn)，將復(fù)方地芬諾酯片加入9 g∕L生理鹽水，每只小鼠灌胃20 mL·kg-1，每日1次。連續(xù)4 d。造模結(jié)束后觀察兩組小鼠排便情況。便秘小鼠首次排黑便時間、6 h內(nèi)的排黑便粒數(shù)及黑便濕質(zhì)量均較正常小鼠明顯減少，表明便秘模型復(fù)制成功。

1.5 肺組織蛋白提取 實驗所用肺組織，分別取自正常對照組和便秘模型組小鼠。肺組織樣品冰凍狀態(tài)放入研磨器中，以堅硬物敲擊研磨棒壓碎組織，在液氮中研磨樣品成粉末狀。用刮勺把組織粉末收集于勻漿器內(nèi)，300 mg組織約需要1 mL裂解液，冰浴中勻漿。1 000 r∕min離心10 min；收集勻漿液于EP管中，液氮反復(fù)凍融3次，每次融開后注意混勻。離心管加入核酸酶（DNA酶、RNA酶），按照每500 mg組織中加入質(zhì)量濃度10 mg∕mL的核酸酶 12 μL、4 μL（或 50 μg∕mL RNase及 200 μg∕mL DNase，）的比例加入，放入冰浴裂解20 min。 15 000 r∕min，4 ℃離心60 min（或40 000 r∕min，4℃離心30 min），收集上清。2-D蛋白定量試劑盒測定每組小鼠肺組織蛋白質(zhì)后，分別取每個樣本的300 μg進(jìn)行組內(nèi)樣本混合，然后再對混合好的模型組和正常對照組樣本分別定量。每次上樣前均予再次定量，以保證上樣量的精確性。

1.6 雙向凝膠電泳（2-DE） 將蛋白樣品進(jìn)行第一向電泳。等電聚焦電泳（IEF）參數(shù)設(shè)置為：30 V、12 h（膠條再水化）；500 V、1 h；1 000 V、1 h；8 000 V、30 min；10 000 V、10 h；500 V、12 h；85 000 Vh收膠。IEF結(jié)束后，在平衡緩沖液中平衡膠條。將膠條轉(zhuǎn)移至12.5%十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）膠面上行第二向電泳，參數(shù)設(shè)置為：2 W∕gel、12 W，50 min后改為17 W∕gel、100 W；直至膠內(nèi)電泳指示劑溴酚藍(lán)跑出凝膠下緣10 min。然后進(jìn)行銀染。

1.7 圖像采集與分析 使用ImageScanner專業(yè)圖像掃描儀對凝膠成像，用PDquest凝膠圖像分析軟件進(jìn)行圖譜分析。凝膠圖像經(jīng)識別、分析后，尋找差異點(diǎn)。選取蛋白斑點(diǎn)豐度差異大于2.5倍的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，且同組2塊凝膠圖譜均出現(xiàn)相同變化，視其為差異蛋白點(diǎn)。

1.8 質(zhì)譜圖的獲取 用Spot Handling Workstation對染色的凝膠處理，取AnchorChip靶點(diǎn)樣后在質(zhì)譜上進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離—串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF∕TOF）分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）和利用LIFT軟件將對4個強(qiáng)度最大峰肽段進(jìn)行串級質(zhì)譜分析。

1.9 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析 使用Biotools軟件檢索，以MASCOT為搜索引擎在NCBInr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，參數(shù)設(shè)置為：檢索種屬為Rattus；數(shù)據(jù)檢索的方式為combined；最大允許漏切位點(diǎn)為1；酶為胰蛋白酶。質(zhì)量誤差范圍設(shè)置：PMF 50 ppm，MS∕MS 0.5 Da。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠肺組織蛋白質(zhì)差異表達(dá) 正常對照組和便秘模型組銀染小鼠肺組織蛋白質(zhì)2-DE圖像如圖1、2。選取3個明顯差異蛋白質(zhì)點(diǎn)（蛋白表達(dá)量均相差2.5倍以上），其中BD1、BD3為下調(diào)蛋白，BU3為上調(diào)蛋白。差異蛋白點(diǎn)放大，如圖3。

圖1 正常小鼠肺組織蛋白2-DE分離圖像及差異蛋白分布Figure 1 Two-dimensional electrophoresis（2-DE）separation image of total proteins in lung tissues of normal mice and distribution of the differential proteins

圖2 便秘小鼠肺組織蛋白2-DE分離圖像及差異蛋白分布Figure 2 2-DE separation image of total proteins in lung tissues of cough mice and distribution of the differential proteins

圖3 BD1、BD3、BU3差異蛋白點(diǎn)放大圖Figure 3 The amplified plot in various differential protein spots

2.2 搜索數(shù)據(jù)庫鑒定差異蛋白質(zhì) 將2組小鼠肺組織差異蛋白質(zhì)的PMF，通過Mascot搜索軟件匹配到swissprot數(shù)據(jù)庫中，BD1、BD3、BU3分別鑒定為細(xì)胞色素c氧化酶亞基5A（COX5A）、過氧化物氧化還原酶2（Prdx-2）和肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2（MLC-2）。各蛋白鑒定信息詳見表1。

3 討論

本研究通過數(shù)據(jù)庫檢索分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，便秘小鼠肺組織3個差異表達(dá)蛋白質(zhì)COX5A、Prdx-2、MLC-2都能在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫獲得匹配信息，前二者為氧化—抗氧化系統(tǒng)蛋白，后者為細(xì)胞骨架蛋白。便秘小鼠肺組織COX5A、Prdx-2表達(dá)量均降低，而MLC-2表達(dá)量升高。從中可以看出，氧化—抗氧化系統(tǒng)失衡可能是腸病及肺的發(fā)病機(jī)制之一。

有研究認(rèn)為，腸道不僅是人體內(nèi)最大的貯菌所和內(nèi)毒素庫，而且是觸發(fā)全身炎性介質(zhì)釋放的啟動器，腸道內(nèi)細(xì)菌或內(nèi)毒素的移位，和胃腸道相關(guān)淋巴組織及其他腸黏膜細(xì)胞產(chǎn)生促炎反應(yīng)釋放大量促炎介質(zhì)關(guān)系密切，它們共同的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，是腸道的缺血再灌注損傷；腸道缺血再灌注損傷后的直接結(jié)果，是損害腸黏膜屏障和激發(fā)腸道促炎反應(yīng)[1]。

各種致病因素在肺內(nèi)造成的損傷都可激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，引起各種介質(zhì)釋放，如細(xì)胞因子、趨化因子、血小板活化因子（PAF）等，同時這些介質(zhì)也會造成中性粒細(xì)胞的活化并釋放出活性氧簇（ROS），導(dǎo)致肺內(nèi)“炎癥”過程發(fā)生。這一過程固然對殺死各種病原體十分重要，但亦會引起肺內(nèi)的氧化應(yīng)激[2]，使細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死并破壞微血管的屏障功能。

其中肺組織線粒體在氧化應(yīng)激中起著舉足輕重的作用。由于線粒體呼吸鏈?zhǔn)钦婧思?xì)胞代謝能量三磷酸腺苷（ATP）的主要來源，是有氧呼吸的關(guān)鍵途徑，大量消耗的氧直接與線粒體呼吸鏈的電子傳遞體系相聯(lián)系，因此在有氧代謝過程中大量的ROS會持續(xù)不斷地產(chǎn)生。而線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要發(fā)生器，故極易遭ROS攻擊而損傷，尤其是在低氧情況下需加強(qiáng)線粒體呼吸鏈功能時[3，4]。細(xì)胞色素c氧化酶（cytochrome oxidase，COX）就是線粒體的標(biāo)志酶，是線粒體呼吸鏈氧化磷酸化過程中的關(guān)鍵酶。它直接以氧分子為電子受體進(jìn)行電子傳遞，是線粒體完成生物氧化的最后步驟[5，6]。因此，細(xì)胞色素氧化酶活性強(qiáng)度的變化直接反映了線粒體有氧代謝的功能狀態(tài)，其損傷可直接影響線粒體功能，導(dǎo)致ATP合成減少，膜電位喪失，促使呼吸鏈大量產(chǎn)生ROS，活化凋亡信號通路，細(xì)胞出現(xiàn)死亡（凋亡或壞死）。我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)的差異蛋白COX5A是COX含亞鐵血紅素A鏈。

表1 數(shù)據(jù)庫差異蛋白質(zhì)鑒定信息Table 1 Information of various differential proteins identified in database

肺內(nèi)亦存在豐富的抗氧化防御系統(tǒng)，如本研究發(fā)現(xiàn)的與Prdx-6同屬于非硒依賴過氧化物酶家族的差異蛋白Prdx-2就屬于其中，肺內(nèi)這種抗氧化機(jī)制可確保生理狀況下氧化—抗氧化系統(tǒng)的平衡，而一旦體內(nèi)的抗氧化代償機(jī)制被破壞或不足，造成機(jī)體氧化—抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，氧化損傷即開始啟動，造成肺損傷[7]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COX5A和Prdx-2在便秘小鼠肺組織中表達(dá)水平均較正常組下調(diào)，這說明便秘小鼠肺細(xì)胞線粒體有氧代謝功能下降，可能是由于過多的ROS在體內(nèi)不能及時清除，造成肺細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷的結(jié)果。

除此之外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，MLC-2在便秘組小鼠肺組織細(xì)胞中表達(dá)水平較正常小鼠上調(diào)。MLC-2是肌球蛋白的重要組成部分，它在調(diào)節(jié)肌球蛋白的活性中發(fā)揮作用，肌球蛋白輕鏈必須纏繞在重鏈上才能保持其天然的活性構(gòu)象[8]。MLC-2是細(xì)胞骨架的分子馬達(dá)，MLC-2通過Ser19、Thr18磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)肌球蛋白活性，在有肌動蛋白存在的情況下，控制肌球蛋白頭部構(gòu)象，可大大提高肌球蛋白的ATP酶活性，廣泛參與細(xì)胞質(zhì)流動、細(xì)胞器運(yùn)動、細(xì)胞遷移、細(xì)胞內(nèi)吞、物質(zhì)運(yùn)輸、有絲分裂、胞外分泌和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程[9]。便秘小鼠肺組織細(xì)胞MLC-2表達(dá)上調(diào)可能是肺細(xì)胞為抗氧化應(yīng)激損傷而產(chǎn)生的防御作用。

從上述研究結(jié)果可以看出，便秘小鼠“腸病及肺”時，可能由于大腸傳導(dǎo)功能失調(diào)不能正常將糟粕排除體外，上逆影響至肺，致肺組織細(xì)胞不能正常發(fā)揮抗氧化損傷的作用，使ROS在體內(nèi)大量堆積，造成肺細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。

值得一提的是，臨床觀察常見在創(chuàng)傷、大手術(shù)、休克、燒傷等情況下肺往往是第一個受累的器官，這可能是由于腸系膜淋巴管引流的腸淋巴液經(jīng)胸導(dǎo)管進(jìn)入右心，肺因而成為暴露于腸源性炎癥介質(zhì)的第一個器官。這種解剖結(jié)構(gòu)可以解釋臨床上的這一現(xiàn)象[10]，也為本課題進(jìn)行“腸病及肺”病機(jī)研究提供了重要的解剖學(xué)原因。

綜上所述，“肺與大腸相表里”中的肺與腸在正常情況下可能是處于氧化—抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡關(guān)系。而在各種原因造成的大腸病理狀態(tài)時，氧化—抗氧化系統(tǒng)平衡被破壞，肺與腸的關(guān)系出現(xiàn)紊亂。一旦發(fā)生病變，肺腸之病可以相互傳變、累及，惡性循環(huán)。

其中，作為在“肺病及腸”[11]、“腸病及肺”中均表現(xiàn)差異的過氧化物氧化還原酶（peroxiredoxin）家族蛋白可能起了重要作用，值得進(jìn)一步探討。