方學君,梁藝,劉曉曼,譚梅傲,曹敏,趙利娜

（1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是一種由于喪失功能受體導致膽堿能神經(jīng)傳遞的缺陷，從而導致自發(fā)性肌無力和肌疲勞的神經(jīng)自身免疫性疾病，屬于中醫(yī)的“痿病”范疇。MG具有病情重、死亡率高、易復發(fā)的特點，是世界性難治疾病之一。臨床中，西醫(yī)學主要應用膽堿酯酶抑制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、血漿置換法、胸腺切除術(shù)等療法治療，但副作用多，療效欠理想，故尋求安全、有效的治療手段是亟待解決的問題。國醫(yī)大師鄧鐵濤教授根據(jù)“脾主肌肉”理論和“脾胃虛損，五臟相關(guān)”學說，運用健脾益氣法治療該病，在提高臨床療效、減輕激素的依賴性及減少患者的復發(fā)率方面存在一定優(yōu)勢。健脾益氣法代表方強肌健力方在臨床上取得了良好的療效，多項臨床試驗表明，該方能有效治療脾胃氣虛型MG[1-5]，減緩乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AchR）的降解，增加有效AchR數(shù)量，促進神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞[6]。強肌健力方雖臨床療效確切，但其作用機理尚不明確。有研究表明，輔助性T細胞17型細胞（T helper cell 17，Th17）在MG發(fā)病過程中起到了關(guān)鍵性的作用，而調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory cell，Treg）能抑制其功能。因此，本研究擬觀察不同劑量強肌健力方灌胃前后MG大鼠體質(zhì)量及肌力變化，同時采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測不同劑量強肌健力方灌胃后MG大鼠脾臟Th17細胞特異性核轉(zhuǎn)錄蛋白維甲酸受體相關(guān)孤兒受體γt（RORγt）、相關(guān)細胞因子白細胞介素17A（IL-17A），Treg細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白p3（Foxp3）及其轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）蛋白表達水平，以探討強肌健力方能否通過影響MG大鼠Th17、Treg細胞的轉(zhuǎn)錄及其相關(guān)細胞因子的表達來調(diào)節(jié)二者平衡，從而對MG大鼠產(chǎn)生治療作用，并明確其量—效關(guān)系，以期從免疫學方面為中醫(yī)藥治療MG的臨床研究提供依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡Lewis雌鼠共70只，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[合格證號：SCXK（京）2016-0011]。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級別動物房中[許可證號：SYXK（粵）2013-0001]，自由進食、飲水，保持恒溫22℃，濕度55%，晝夜節(jié)律。

1.2 實驗藥物 強肌健力方中黃芪、五爪龍、熟黨參、生白術(shù)、當歸、廣升麻、北柴胡、蒸陳皮、甘草等中藥飲片均購自廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房。

1.3 主要試劑與儀器 鼠源性AchR-α亞單位97-116肽段（杭州中肽生化有限公司）；完全弗氏佐劑（CFA）（美國Sigma公司，批號：F5506）、不完全弗氏佐劑（IFA）（美國Sigma公司，批號：F5881）。鼠源性多克隆RORγt抗體（美國Novus公司，批號：NBP2-24449）；Foxp3抗體（美國abcam公司，批號：ab22510）；IL-17A抗體（美國Affinity公司，批號：DF6127）；TGF-β抗體（美國Abcam公司，批號：ab170874）；山羊抗兔IgG H&L（HRP）（美國Abcam公司，批號：ab6721）；BCA試劑盒（美國Pierce公司，批號：23227）；電化學發(fā)光（ECL）試劑盒（美國Millipore公司，批號：WBKLS0500）。BL-420S生物信號采集與分析系統(tǒng)（成都泰盟公司）；Mini-PROREAN3垂直電泳儀及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.4 造模與分組 將70只Lewis雌性大鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機選取7只作為正常組，其余63只參照許文華等[7]的造模方法進行造模：首次免疫當天視為0天，將鼠源性AchR-α亞單位97-116肽段、完全弗氏佐劑（CFA）和磷酸鹽緩沖液（PBS）按照1∶1∶1比例經(jīng)振蕩器混勻成乳化劑。水合氯醛按照1∶10的比例配成100 g∕L質(zhì)量濃度，按0.3 mL∕kg的劑量腹腔注射麻醉大鼠后，取200 μL乳化劑分別注射于脊柱兩側(cè)及雙側(cè)后足墊皮下（含多肽100 μg）；第2次加強免疫于首次免疫后第4周末進行，多肽、不完全弗氏佐劑（IFA）和PBS按照1∶2∶2比例混勻乳化后于相同部位皮下注射（含多肽50 μg）；首次免疫后第6周末進行第3次加強免疫，其注射方法及劑量同第2次加強免疫。第3次加強免疫結(jié)束后1周（首次免疫第7周）評估造模。造模成功評估標準：①出現(xiàn)肢體乏力癥狀；②Lennon評分≥1分；③低頻重復電刺激（repetitive nerve stimulation，RNS）[RNS=（第1波波幅-第5波波幅）∕第1波波幅×100%]≥10%。再將成模的Lewis大鼠隨機分為模型組（N=7），強肌健力方高劑量組（N=8）、中劑量組（N=7）、低劑量組（N=8）。

1.5 給藥方法 各組灌胃液體積為10 mL∕kg（體質(zhì)量），其濃度及等效劑量按成人體質(zhì)量折算[8]。首次免疫后第8周，強肌健力方高、中、低劑量組開始分別給予大鼠強肌健力方（劑量分別為23.4、15.6、7.8 g·kg-1·d-1）灌胃，正常組和模型組予相同體積生理鹽水灌胃。1次∕日，療程為4周。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 體質(zhì)量及肌力 稱體質(zhì)量及肌力評估于實驗前及接種免疫后（每周2次）進行。以Lennon評分作為肌力評估標準，對于肌無力臨床體征表現(xiàn)不明顯的大鼠，重復抓握籠頂1 min后再評估。具體評分標準[9]為：0分，無任何臨床體征；1分，檢測前無臨床體征，運動后出現(xiàn)疲乏無力癥狀；2分，檢測前即出現(xiàn)肌無力體征，如蜷縮、抓握及抬頸無力；3分，無力抓握和行走、活動；4分，瀕死狀態(tài)。介于兩者之間的以0.5、1.5、2.5、3.5分評定。

1.6.2 Western blot法檢測大鼠脾臟組織RORγt、Foxp3、IL-17A、TGF-β蛋白表達水平 取各組大鼠脾臟組織100 mg樣品充分研磨，加入組織裂解液RIPA冰上裂解 30 min后，14 000 r∕m離心15 min，收集上清提取組織蛋白，參照二喹啉甲酸（BCA）試劑盒說明書操作測定組織總蛋白濃度。各孔取40 μg的蛋白上樣，經(jīng)100 g∕L聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉2 h。TBST溶液共洗膜6次，5 min∕次，加入經(jīng)稀釋的一抗4℃孵育過夜。第2天用TBST洗膜3次，10 min∕次，加入稀釋后的二抗，室溫孵育2 h。孵育結(jié)束后，室溫下浸泡于TBST溶液中置于脫色搖床上洗2次，10 min∕次。根據(jù)ECL試劑盒說明書進行顯影。采用Image J圖像分析管理系統(tǒng)對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.7 統(tǒng)計方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果 造模過程中，造模組大鼠因麻醉過度低體溫死亡3只，最終成模30只，成模率約50%。其原因可能為誘導免疫的乳化劑中未額外添加具有增強免疫作用的HR37a凍干粉，免疫原性較弱所致。另外，灌胃過程中因誤灌入肺，強肌健力方高、低劑量組各死亡1只。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量及肌力比較 圖1、2結(jié)果顯示：造模前，各組大鼠體質(zhì)量相近，肌力正常。造模過程中，正常組大鼠體質(zhì)量呈穩(wěn)步上升趨勢且肌力正常，造模大鼠體質(zhì)量增速較為緩慢，逐漸出現(xiàn)活動減少、叫聲及抓握力減弱及動作遲鈍等癥狀，特別是第3次免疫過后，各造模組大鼠體質(zhì)量出現(xiàn)下降，肌無力癥狀明顯加重。首次免疫后第8周開始灌胃給藥后，模型組體質(zhì)量及肌力繼續(xù)下降，各中藥劑量組大鼠體質(zhì)量開始逐漸上升，Lennon評分開始下降。給藥4周結(jié)束后，與模型組比較，強肌健力方各劑量組均能有效增加MG大鼠體質(zhì)量（P＜0.05），降低Lennon評分（P＜0.01），且各給藥組MG大鼠體質(zhì)量及肌力改善程度與灌胃中藥劑量呈正相關(guān)。

2.3 各組大鼠脾臟RORγt、Foxp3、IL-17A、TGF-β表達比較 圖3、表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠脾臟RORγt、IL-17A蛋白表達水平均明顯升高，F(xiàn)oxp3、TGF-β蛋白表達水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，強肌健力方各劑量組大鼠脾臟RORγt、IL-17A蛋白表達水平均顯著下降（P＜0.01），F(xiàn)oxp3（低劑量組除外）、TGF-β蛋白表達水平均明顯上升（P＜0.05）；且強肌健力方各劑量組對MG大鼠脾臟RORγt、IL-17A、Foxp3、TGF-β蛋白表達的作用在量—效關(guān)系上呈正相關(guān)。表明強肌健力方能夠抑制MG大鼠脾臟Th17細胞轉(zhuǎn)錄蛋白RORγt及細胞因子IL-17A的表達，促進Treg細胞轉(zhuǎn)錄蛋白Foxp3及細胞因子TGF-β的表達，且其作用與藥物劑量呈正相關(guān)。

圖1 大鼠體質(zhì)量趨勢Figure 1 The trend of body mass in rats

圖2 Lennon評分趨勢圖Figure 2 The trend of Lennon scores in various groups

圖3 各組大鼠脾臟RORγt、Foxp3、IL-17A、TGF-β蛋白電泳條帶圖Figure 3 The graph of electrophoresis bands of RORγt，F(xiàn)oxp3，IL-17A and TGF-β proteins in rat spleen tissues of various groups

表1 各組大鼠RORγt、Foxp3、IL-17A、TGF-β蛋白相對表達Table 1 Comparison of the relative expression levels of RORγt，F(xiàn)oxp3，IL-17A and TGF-β proteins in rat spleen tissues of various groups （，p）

表1 各組大鼠RORγt、Foxp3、IL-17A、TGF-β蛋白相對表達Table 1 Comparison of the relative expression levels of RORγt，F(xiàn)oxp3，IL-17A and TGF-β proteins in rat spleen tissues of various groups （，p）

①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較

分組正常組模型組強肌健力方高劑量組強肌健力方中劑量組強肌健力方低劑量組TGF-β∕GAPDH 1.087±0.040 0.343±0.025②0.933±0.021③0.727±0.050③0.500±0.017③N7 7 7 7 7 RORγt∕GAPDH 0.357±0.095 1.168±0.148①0.393±0.143④0.675±0.121④0.820±0.121④Foxp3∕GAPDH 1.060±0.206 0.437±0.101①0.962±0.135③0.737±0.253③0.485±0.127 IL-17A∕GAPDH 0.260±0.087 1.123±0.015②0.493±0.042④0.703±0.015④0.873±0.025④

3 討論

鄧鐵濤教授認為，MG病機根本在于脾胃，脾虛則氣血生化無力，氣血不足無以濡養(yǎng)肌肉四肢則導致肌肉無力。強肌健力方全方以補氣健脾、益氣升陷為法，使肌肉得以充養(yǎng)，下垂之證得以緩解，從而改善MG的肌無力癥狀。本研究觀察強肌健力方對MG大鼠體質(zhì)量及肌力的影響，結(jié)果顯示，首次免疫后第8周開始給藥前，正常組體質(zhì)量均明顯高于各造模組，而Lennon評分則明顯低于各造模組。結(jié)束4周給藥后，強肌健力方不同劑量組大鼠體質(zhì)量與模型組比較均明顯升高，Lennon評分明顯降低，且其升高及下降幅度隨中藥給藥劑量逐漸加大。表明強肌健力方能夠有效提高MG大鼠的體質(zhì)量及肌力，且量—效關(guān)系呈正相關(guān)。

既往認為，MG的免疫學發(fā)病機制與Th1∕Th2型細胞因子失衡導致B細胞產(chǎn)生過多自身免疫性抗體有關(guān)，這一理論機制一直占主導地位[10]。近期研究發(fā)現(xiàn)Th17細胞參與了Th1∕Th2型細胞因子的失衡，輔助B細胞產(chǎn)生過多自身免疫性抗體，導致免疫紊亂，從而促使MG的發(fā)生[11]，而Th17細胞的免疫學功能受Treg細胞功能的限制。

Th17細胞作為CD4+T淋巴細胞亞群中的一個重要亞群，特異性表達核轉(zhuǎn)錄因子RORγt，分泌細胞因子IL-17、IL-23，參與促進自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展。臨床及動物研究均表明，Th17細胞及其相關(guān)細胞因子，尤其是IL-17，具有促進MG發(fā)病的作用，MG患者外周血及胸腺的Th17細胞增多，且與病情嚴重程度呈正相關(guān)[12]；而動物實驗表明Th17細胞通過分泌IL-17促進AchR-ab IgG2b表達和誘導B細胞耐受的缺失，進而增加AChR-Ab的產(chǎn)生[13]。Treg細胞特異性表達轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，分泌細胞因子TGF-β、IL-10，具有維持自身免疫耐受的作用。Treg細胞的功能異常在自身免疫性MG的發(fā)病機制中起著十分重要的作用，其主要原因為Foxp3表達缺失，影響Treg細胞發(fā)育及功能的發(fā)揮，且Foxp3的缺失程度與MG的嚴重程度相關(guān)[11，14]。研究表明，F(xiàn)oxp3能夠通過直接作用于RORγt抑制Th17細胞的產(chǎn)生[15]。本實驗研究結(jié)果表明，與模型組比較，強肌健力方各劑量組均能有效提高Treg細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3蛋白表達水平，降低Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt蛋白表達水平，推測強肌健力方可能通過促進Foxp3的表達，同時抑制RORγt的表達，影響Th17及Treg細胞的分化，從而調(diào)節(jié)二者的平衡對MG大鼠產(chǎn)生治療作用。

相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，初始CD4+T淋巴細胞在TGF-β單獨存在的情況下向Treg細胞分化，在炎癥因子IL-6及少量TGF-β共同存在情況下則向Th17分化，且Th17細胞相關(guān)細胞因子IL-17、IL-21可以抑制Treg細胞的分化[16，17]。本實驗研究結(jié)果顯示，強肌健力方各劑量組與模型組比較能夠不同程度降低細胞因子IL-17蛋白表達水平，提高細胞因子TGF-β蛋白表達水平，故推測強肌健力方可能通過影響Th17及Treg細胞轉(zhuǎn)錄蛋白的表達調(diào)節(jié)二者的分化，進而調(diào)節(jié)其相關(guān)細胞因子IL-17、TGF-β的表達，而IL-17表達的抑制及TGF-β表達的增加在促進初始CD4+T細胞向Treg細胞分化的同時又抑制其向Th17細胞分化，因此對MG大鼠產(chǎn)生治療作用。

綜上所述，強肌健力方能夠有效提高MG大鼠的體質(zhì)量及肌力，緩解病情，抑制Th17細胞特異性轉(zhuǎn)錄蛋白RORγt及細胞因子IL-17A的表達及促進Treg細胞特異性核轉(zhuǎn)錄蛋白Foxp3及細胞因子TGF-β的表達。推測強肌腱力方對MG大鼠的治療作用可能是通過影響Th17、Treg細胞的分化及相關(guān)細胞因子的表達，從而調(diào)節(jié)二者平衡來實現(xiàn)的。而其具體的作用通路有待進一步研究闡明。