陶鵬宇,張悅

（上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203）

糖尿病腎?。―N）是糖尿病進(jìn)展到后期出現(xiàn)的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病的重要原因[1]。葡萄糖代謝異常引起的腎小球毛細(xì)血管和腎小管結(jié)構(gòu)功能的改變?cè)谔悄虿∧I病中起重要作用[2]。糖尿病腎病以腎臟纖維化為主要形態(tài)學(xué)特征。腎小球細(xì)胞外基質(zhì)生成增多并沉淀在基底膜上導(dǎo)致基底膜增厚、腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，會(huì)進(jìn)一步加重糖尿病腎病[3]。炎癥在DN中的作用受到廣泛重視，核因子κB（NF-κB）炎癥通路的激活可使多種促炎癥因子的表達(dá)增加從而介導(dǎo)炎癥活動(dòng)，同時(shí)也引起轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β∕Smad通路激活促進(jìn)腎臟纖維化發(fā)生，這提示炎癥和纖維化在DN中相互作用，可進(jìn)一步惡化病情[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸可以延緩大鼠糖尿病腎病進(jìn)展，保護(hù)腎臟功能，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1-Smad信號(hào)通路相關(guān)[5]?；诖耍狙芯繑M從NF-κB與TGF-β∕Smad雙信號(hào)通路角度進(jìn)一步探討六味地黃丸在糖尿病腎病中的抗炎抗纖維化作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室內(nèi)溫度為25℃，自由進(jìn)食普通標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用純凈水。

1.2 藥物與試劑 六味地黃丸濃縮丸（購(gòu)于北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號(hào)：807063）。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：119K1591）；BCA蛋白定量試劑盒（購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司）；NF-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、alpha平滑肌抗體（α-SMA）、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）等抗體（購(gòu)于美國(guó)CST公司）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠Ⅱ抗（購(gòu)于晶美生物工程有限公司）；PVDF膜（購(gòu)于美國(guó)Millipore公司）。

1.3 儀器 強(qiáng)生穩(wěn)步型血糖測(cè)試儀（強(qiáng)生中國(guó)有限公司）；PowerWave XS2酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；電泳裝置（美國(guó)BioRad公司）；Axio Lab A1型正置顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）；Fluorochem M型自動(dòng)成像分析系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple公司）。

1.4 分組、造模與給藥 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成正常組、模型組、中藥組，每組10只。于造模前1 d禁食24 h，將STZ溶于pH 4.5的0.1 mol∕L檸檬酸鹽緩沖液，避光保存，給造模大鼠（20只）按60 mg∕kg一次性腹腔注射STZ，正常組（10只）則注射等量檸檬酸鹽緩沖液。造模1周后，尾靜脈取血測(cè)量大鼠空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG＞16.7 mmol∕L為糖尿病大鼠[6]。將六味地黃丸按人與大鼠體表面積比折算成等效劑量（6.75 g·kg-1·d-1）[5]灌胃，正常組及模型組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)12周。

1.5 標(biāo)本收集 取材前1 d撤掉飼料只保留飲用水，代謝籠收集24 h尿液并記錄尿量，以100 g∕L水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心取血清，-80℃保存；取雙側(cè)腎臟，用濾紙吸干腎表面血液后稱(chēng)質(zhì)量，取腎臟的一部分組織浸泡于福爾馬林中用于石蠟切片，取體積大小適中的腎組織包裹于錫紙中并置于液氮中，繼而放入-80℃冰箱保存，用于組織勻漿以作其他生化實(shí)驗(yàn)用途。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1 一般情況觀察 觀察大鼠精神活動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)顏色和密度、食物消耗程度。

1.6.2 腎系數(shù)的測(cè)定 將大鼠麻醉后處死，迅速剖腹取兩側(cè)腎臟，用濾紙吸干腎表面血液后稱(chēng)質(zhì)量。腎系數(shù)（w∕%）=雙側(cè)腎質(zhì)量（m∕g）∕體質(zhì)量（m∕kg）×100%。

1.6.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各組大鼠24 h尿蛋白總量（24h-Pro）、血清肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、FBG。

1.6.4 腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察 ①蘇木素—伊紅（HE）染色：取腎皮質(zhì)，體積分?jǐn)?shù)10%中性福爾馬林固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成3 μm石蠟切片，HE染色后光鏡觀察。②Masson染色：脫蠟至水，bouin液60℃恒溫箱固定1 h，沖洗后蘇木素染色10 min，Masson復(fù)合液染色20 min，沖洗后加5%磷鉬酸分化6 min；倒掉磷鉬酸加入2%苯胺藍(lán)復(fù)染7 min，2%冰醋酸分化2 min，乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)脂固定，然后鏡下觀察。

1.6.5 Western blot法檢測(cè)腎組織NF-κB、MCP-1、α-SMA、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7蛋白的表達(dá) 取適量腎臟組織，放入含有預(yù)冷RIPA裂解緩沖液的試管中，于冰上用超聲破碎儀勻漿，離心取上清，即為組織蛋白液。按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定量，將各組蛋白濃度調(diào)至一致，加入loading buffer煮沸蛋白變性，結(jié)束后保存于-80℃冰箱。取出變性好的組織樣品于冰上溶解、震蕩、離心后上樣，每孔加10 μL蛋白樣品電泳，積層膠電壓80 V，分離膠電壓110 V，經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、TBST洗滌、一抗[分別為 NF-κB、MCP-1、α-SMA、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7（稀釋比均為1∶1 000），GAPDH（稀釋比均為1∶5 000）]孵育、TBST洗滌、二抗孵育、TBST洗滌、添加顯影液、機(jī)器下曝光條帶等步驟。以Image J測(cè)定目的條帶∕內(nèi)參的灰度值比值（p）來(lái)反應(yīng)蛋白表達(dá)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察 正常組大鼠毛色光亮，無(wú)脫發(fā)，活動(dòng)自如；模型組大鼠明顯瘦小，毛較粗糙，色澤黯淡，食物及水消耗較正常的多，喜靜少動(dòng)；經(jīng)六味地黃丸治療后，上述癥狀有所改善。

表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組體質(zhì)量減少，食量、飲水量、尿量及腎系數(shù)增加（均P＜0.05）；與模型組比較，中藥組體質(zhì)量增加，食量、飲水量、尿量及腎系數(shù)減少（均P＜0.05）。

2.2 各組大鼠血糖及腎功能比較 表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠FBG、SCr、BUN及24h-Pro顯著提高（P＜0.01）；經(jīng)六味地黃丸干預(yù)治療后，上述指標(biāo)均有所改善（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、食量、飲水量、尿量及腎系數(shù)變化Table 1 Comparison of the changes of body mass，consumption of food and water，output of urine and rend coefficient in various groups （）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、食量、飲水量、尿量及腎系數(shù)變化Table 1 Comparison of the changes of body mass，consumption of food and water，output of urine and rend coefficient in various groups （）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

分組正常組模型組中藥組腎系數(shù)(w∕%)5.60±1.23 15.67±3.31①12.88± 2.71①②N 10 10 10體質(zhì)量（m∕g）478.34±11.81 325.61±10.32①366.47± 12.33①②24 h食物（m∕g）28.06±8.23 75.66±11.89①53.24± 9.07①②24 h飲水（V∕mL）45.12±15.03 216.75±36.89①150.35± 20.01①②24 h尿量（V∕mL）15±6.01 57±25.34①32± 20.01①②

表2 各組大鼠血糖及腎功能比較Table 2 Comparison of the changes of FBG and renal function in various groups （）

表2 各組大鼠血糖及腎功能比較Table 2 Comparison of the changes of FBG and renal function in various groups （）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

分組正常組模型組中藥組24h-Pro[ρ∕(mg·L-1)]5.6±3.5 80.7±20.3①63.2± 13.4①②N 10 10 10 FBG[c∕(mmol·L-1)]4.5±0.68 26.8±7.55①18.7± 5.66①②SCr[c∕(μmol·L-1)]16.2±1.43 28.9±7.92①21.4± 5.78①②BUN[c∕(mmol·L-1)]4.8±0.71 16.3±4.26①8.3± 2.40①②

2.3 各組大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示：正常組腎組織形態(tài)正常，小球形態(tài)規(guī)則，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常；模型組大鼠腎小球體積增大、結(jié)節(jié)樣硬化，系膜基質(zhì)增生；中藥組大鼠腎小球形態(tài)基本正常，系膜基質(zhì)輕度增生，病變明顯輕于模型組。Msson染色結(jié)果顯示：正常組無(wú)明顯改變，各部分排列整齊；模型組腎小球部分體積變大兼纖維組織生成增多，間質(zhì)增寬，球囊粘連；經(jīng)六味地黃丸治療后，纖維化程度較模型組減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。

圖1 各組腎臟組織病理形態(tài)學(xué)改變（HE，×400；Masson，×200）Figure 1 Comparison of the pathomorphologic changes of renal tissues in various groups（by HE staining，×400；by Masson staining，×200）

2.4 六味地黃丸對(duì)NF-κB、MCP-1蛋白表達(dá)的影響 圖2、表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組中NF-κB、MCP-1表達(dá)水平均升高（P ＜0.01）；經(jīng)六味地黃丸治療后，NF-κB、MCP-1表達(dá)水平均有所下降（P＜0.05）。

圖2 NF-κB、MCP-1蛋白電泳條帶Figure 2 Electrophoresis strips of NF-κB and MCP-1 proteins

表3 各組腎組織NF-κB、MCP-1蛋白表達(dá)比較Table 3 Comparison of the expression levels of NF-κB and MCP-1 proteins in renal tissues of various groups （，p）

表3 各組腎組織NF-κB、MCP-1蛋白表達(dá)比較Table 3 Comparison of the expression levels of NF-κB and MCP-1 proteins in renal tissues of various groups （，p）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組MCP-1∕GAPDH 0.17±0.02 0.76±0.08①0.47± 0.02①②N 10 10 10 NF-κB∕GAPDH 0.21±0.04 0.88±0.10①0.54± 0.30①②

2.5 六味地黃丸對(duì)TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)的影響 圖3、表4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組中的TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3表達(dá)升高，而Smad7表達(dá)下降（均P＜0.01）；經(jīng)六味地黃丸治療后，TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3表達(dá)下降，而Smad7表達(dá)上升（均P ＜ 0.05）。

圖3TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7蛋白電泳條帶Figure 3 Electrophoresis strips of TGF-β，α-SMA，Smad2，Smad3 and Smad7 proteins in various groups

表4 各組TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of the expression levels of TGF-β，α-SMA，Smad2，Smad3 and Smad7 proteins in renal tissues of various groups （，p）

表4 各組TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of the expression levels of TGF-β，α-SMA，Smad2，Smad3 and Smad7 proteins in renal tissues of various groups （，p）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組Smad7∕GAPDH 0.78±0.29 0.17± 0.17①②0.49± 0.34①②N 10 10 10 TGF-β∕GAPDH 0.17±0.11 0.89±0.67①0.51± 0.44①②α-SMA∕GAPDH 0.18±0.21 0.91±0.75①0.62± 0.56①②Smad2∕GAPDH 0.26±0.22 0.90±0.57①0.54± 0.34①②Smad3∕GAPDH 0.14±0.12 0.85± 0.45①②0.56± 0.23①②

3 討論

糖尿病腎?。―N）是1型或2型糖尿病患者的主要并發(fā)癥，也是終末期腎功能衰竭的主要原因之一[1]。DN臨床病理特征是微量白蛋白尿、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白過(guò)度積聚、基底膜增厚，最終導(dǎo)致腎功能衰竭[2]。

纖維化是在機(jī)體受到損傷時(shí)為維持原組織結(jié)構(gòu)和功能的完整性而對(duì)傷口進(jìn)行修復(fù)和愈合的一個(gè)過(guò)程，α-SMA是成肌纖維細(xì)胞的標(biāo)記物[7]。有研究表明，炎癥在糖尿病腎病纖維化中起著重要作用，炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等對(duì)腎小球和腎小管間質(zhì)浸潤(rùn)[8]。NF-κB信號(hào)通路是介導(dǎo)DN發(fā)展過(guò)程中腎臟炎癥的重要組成部分。通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致一系列促炎癥因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α），白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-8活化進(jìn)入到腎臟部位刺激誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量ECM蛋白，積聚并沉積在腎間質(zhì)促進(jìn)腎纖維化形成[9]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）是趨化性細(xì)胞因子家族中的重要成員之一，腎間質(zhì)損傷時(shí)腎小管上皮細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的MCP-1，其在腎小球硬化、腎間質(zhì)炎癥損傷、腎間質(zhì)纖維化中起關(guān)鍵作用[10]。Vielhauer等[11]在UUO鼠中發(fā)現(xiàn)MCP-1在腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)，MCP-1可通過(guò)對(duì)單核∕巨噬細(xì)胞的趨化引發(fā)間質(zhì)炎癥。因此，通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)具有抑制進(jìn)行性腎纖維化潛在治療靶點(diǎn)的作用。

TGF-β在臨床腎臟纖維化疾病及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中均存在著高表達(dá)，提示TGF-β在腎臟纖維化的發(fā)病機(jī)制中起著重要的調(diào)控作用[2，3]。TGF-β刺激ECM生成的同時(shí)又抑制其降解，促腎纖維化形成。此外，TGF-β1亦可通過(guò)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）這一機(jī)制誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)腎纖維化[12]。TGF-β是DN腎纖維化的重要介質(zhì)，研究報(bào)道提示TGF-β可能通過(guò)Smad信號(hào)通路發(fā)揮其作用[13]。在糖尿病條件下，某些細(xì)胞因子通過(guò)激活TGF-β∕Smad信號(hào)通路，刺激膠原蛋白基質(zhì)沉積并促進(jìn)腎小管間質(zhì)和腎小球纖維化[14]。而有研究報(bào)道，使用TGF-β受體抑制劑雖然可以抑制TGF-β的活性并在一些糖尿病腎病動(dòng)物模型中可以改善腎小球硬化，但是僅僅抑制TGF-β可能會(huì)帶來(lái)一些負(fù)面效應(yīng)，如刺激腎臟炎癥反應(yīng)[15]。因此，有必要尋求一種抑制TGF-β兼控制炎癥損傷的方法。

中醫(yī)藥在我國(guó)有著廣泛用于糖尿病治療的歷史，并被公認(rèn)為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的有效補(bǔ)充。糖尿病屬于中醫(yī)的“消渴”范疇，其發(fā)病機(jī)制為虛火上炎，灼傷陰液，下?lián)p腎水，導(dǎo)致腎陰虧虛[16]。六味地黃丸出自《小兒藥證直訣》，具有滋陰補(bǔ)腎功效，對(duì)臨床治療糖尿病具有輔助效果[17]。本研究以STZ誘導(dǎo)的DN大鼠模型為研究對(duì)象，觀察六味地黃丸的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)六味地黃丸可降低DN大鼠血糖，減少尿白蛋白排泄，改善體質(zhì)量，減少多飲多食癥狀，降低SCr并緩解腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張和腎小球基底增厚。表明六味地黃丸具有顯著的腎保護(hù)作用。

本研究結(jié)果亦顯示，模型組中TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3表達(dá)明顯上調(diào)，而Smad7受到抑制，而中藥組TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3表達(dá)受到抑制，Smad7的表達(dá)增加，表明六味地黃丸可能通過(guò)抑制TGF-β∕Smad通路從而抑制腎纖維化的進(jìn)程。另外，前面所述抑制TGF-β介導(dǎo)的纖維化同時(shí)也會(huì)刺激炎癥反應(yīng)，本研究結(jié)果顯示，模型組NF-κB、MCP-1表達(dá)明顯上調(diào)，而六味地黃丸治療可有效地降低NF-κB、MCP-1表達(dá)，提示六味地黃丸可以降低相關(guān)炎癥因子表達(dá)，抑制NF-κB信號(hào)通路，減輕腎臟炎癥。那么，推測(cè)六味地黃丸的抗炎作用或許是緩解腎臟纖維化的另一個(gè)重要機(jī)制。

綜上所述，六味地黃丸可抑制糖尿病腎病的腎纖維化、減輕腎臟炎癥損傷，其機(jī)制可能與抑制NF-κB和TGF-β∕Smad雙信號(hào)通路有關(guān)。