何磊 陳軍 陳麗莉 李雪飛 王皓 劉利君 秦樹(shù)存 李保強(qiáng) 段昕所

1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚病與性病科，河北 067000；2山東第一醫(yī)科大學(xué)動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東泰安 271000

銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病，不僅累及皮膚，還可以累及其他系統(tǒng)［1］。認(rèn)知功能包括信息處理、注意力、學(xué)習(xí)、記憶和語(yǔ)言能力等。認(rèn)知功能障礙（cognitive impairment）指各種原因?qū)е碌牟煌潭鹊恼J(rèn)知功能損害，影響患者的社會(huì)功能及生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。最新研究表明，銀屑病患者伴有早期或者輕微認(rèn)知障礙，表現(xiàn)為長(zhǎng)期記憶、執(zhí)行功能、注意功能、視空間功能下降，發(fā)生率高于普通人群，可達(dá)44%［2］。因此，我們擬采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)銀屑病小鼠模型認(rèn)知功能的學(xué)習(xí)記憶能力，探索銀屑病對(duì)認(rèn)知功能的影響。

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康 SPF 級(jí)雄性 C57BL/6J 小鼠 20 只，10月齡，體重30～45 g，產(chǎn)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（京）2016-0006，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證書編號(hào)11400700294421。實(shí)驗(yàn)期間小鼠飼養(yǎng)于泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)脈粥樣硬化研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，12 h晝夜交替，室溫（24±2）℃，空氣濕度（50±10）%，除造模及必要的斷水?dāng)嗍惩猓∈缶勺杂蛇M(jìn)水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)遵循“減少、替代和優(yōu)化”為核心的3R原則。

2.主要試劑與儀器：5%咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限公司），凡士林乳膏（河北蘭煉飛天石化有限公司），小鼠水迷宮實(shí)時(shí)測(cè)試系統(tǒng)（美國(guó)CleverSys公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.銀屑病小鼠模型制備：取C57BL/6J 小鼠20 只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組和銀屑病組各10只，兩組間小鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.111，P＞0.05）。通過(guò)腹腔注射4%水合氯醛（0.1 ml/kg）麻醉兩組小鼠后，將其背部約2 cm×2 cm毛發(fā)剃除，對(duì)照組背部外用凡士林，銀屑病組參考文獻(xiàn)［3］在背部給予5%咪喹莫特62.5 mg 每日1 次外涂。兩組均連續(xù)用藥1 周。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼法處死20只小鼠，取背部約1 cm×1 cm大小皮膚組織，4%多聚甲醛固定，按常規(guī)制成蠟塊，切片，HE染色，顯微鏡下觀察，評(píng)估模型建立情況。

2.Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)［4］：造模成功后次日，用小鼠水迷宮實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)20只小鼠的活動(dòng)狀況。Morris水迷宮選用小鼠通用型圓桶，水池直徑100 cm，高50 cm，水深25 cm，水溫控制在2 ～24 ℃，水中加白色染料，在水池壁的邊沿均勻分布4 個(gè)線性標(biāo)記，由此將水池等分為四個(gè)象限，選第三象限正中放置高度23 cm、直徑6 cm 的平臺(tái)，沒(méi)入水下2 cm，迷宮外參照物保持固定。實(shí)驗(yàn)分為定位航行階段和空間探索階段。

（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：將受試小鼠按順時(shí)針?lè)较蛞来巫缘谝弧⒍?、三、四象限入水點(diǎn)順序放入水中，記錄60 s內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間（逃逸潛伏期），如果小鼠在60 s內(nèi)找到平臺(tái)，則小鼠達(dá)到平臺(tái)的時(shí)間即逃逸潛伏期；如果在60 s 內(nèi)未找到平臺(tái)，逃逸潛伏期記錄為60 s，以小鼠逃逸潛伏期的長(zhǎng)短來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的空間學(xué)習(xí)能力。

（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后，次日進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，然后在第一象限相同的入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠在60 s 內(nèi)穿越原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)，以及小鼠在平臺(tái)各象限停留的時(shí)間及游動(dòng)距離，以此判斷小鼠空間記憶存儲(chǔ)及提取再現(xiàn)的能力。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

四、結(jié)果

1.臨床及組織病理學(xué)表現(xiàn)：對(duì)照組小鼠皮膚未見(jiàn)異常（圖1A），顯微鏡下可見(jiàn)皮膚結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)正常（圖2A）。銀屑病組第2天背部皮膚為淡紅色，第3天出現(xiàn)紅斑、少許鱗屑，隨后皮膚逐漸出現(xiàn)皺褶、增厚，第4 ～6天，紅斑、鱗屑持續(xù)增多，第7天呈典型銀屑病樣改變（圖1B）；組織病理檢查顯示Munro小膿腫，表皮明顯角化過(guò)度及角化不全，棘層肥厚，伴有明顯毛細(xì)血管擴(kuò)張和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2B）。

2.銀屑病對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，銀屑病組小鼠逃逸潛伏期為（38.24±13.59）s較對(duì)照組為（14.28± 3.80）s，兩組比較，t=5.37，P＜0.01。

3.銀屑病對(duì)小鼠空間記憶能力的影響：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、圖3。銀屑病組平臺(tái)穿越次數(shù)明顯降低（P＜0.01），平臺(tái)象限停留時(shí)間（P＜0.05）及平臺(tái)象限游程（P＜0.01）均顯著低于對(duì)照組。銀屑病組在第二象限游程低于對(duì)照組（P＜0.05），在第四象限停留時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.05）；在一、三象限停留時(shí)間及游程兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

五、討論

圖1 咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型的皮膚表現(xiàn) 1A：對(duì)照組皮膚未見(jiàn)異常；1B：銀屑病組皮膚肥厚，表面大量脫屑圖2 咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型的組織學(xué)表現(xiàn)（HE×100）2A：對(duì)照組皮膚結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)正常；2B：銀屑病組呈典型的銀屑病病理表現(xiàn)

認(rèn)知功能障礙是指多種原因引起的知覺(jué)、學(xué)習(xí)、記憶能力等嚴(yán)重減退，導(dǎo)致知識(shí)的獲取和應(yīng)用障礙，常伴有行為學(xué)的異常［5］，包括不同程度的認(rèn)知功能損害，從輕度認(rèn)知功能障礙到癡呆。認(rèn)知功能障礙對(duì)患者的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單純的身體功能障礙。認(rèn)知功能障礙通常隱匿起病，如果不早期發(fā)現(xiàn)，盡早干預(yù)，認(rèn)知功能障礙可能進(jìn)一步加重，發(fā)展到癡呆。研究表明，糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等許多疾病伴有認(rèn)知功能障礙，并可以增加癡呆的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［6-7］。銀屑病患者常伴有精神心理疾病和代謝性疾病等，使其具有更高的風(fēng)險(xiǎn)出現(xiàn)早期認(rèn)知功能下降［8］，并且有研究表明，銀屑病已經(jīng)成為認(rèn)知功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［9］。有研究顯示，銀屑病患者輕度認(rèn)知功能障礙發(fā)病率高達(dá)44%［2］，6%～48%的輕度認(rèn)知功能障礙可以在1 ～3年內(nèi)進(jìn)展為癡呆［10］，銀屑病患者比單純患有輕度認(rèn)知功能障礙的患者出現(xiàn)癡呆的可能性更大［11］，并且認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重程度與銀屑病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［9］。姚瑩等［12］的研究顯示，銀屑病患者的認(rèn)知功能障礙發(fā)生率為30.2%，主要累及視空間功能和執(zhí)行能力兩個(gè)認(rèn)知維度，視空間功能是對(duì)視覺(jué)信號(hào)包含的空間信息進(jìn)行提取和闡釋的認(rèn)知過(guò)程。

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)是行為神經(jīng)科學(xué)中應(yīng)用最廣泛的評(píng)價(jià)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶的實(shí)驗(yàn)方法［13］。由于嚙齒類動(dòng)物表現(xiàn)中的“視空間導(dǎo)航”過(guò)程也參與人類日常認(rèn)知過(guò)程，因此Morris 水迷宮在認(rèn)知受損的神經(jīng)退行性疾病研究中具有重要意義［14］。本研究為國(guó)內(nèi)外首次采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)銀屑病對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響。潛伏期是Morris水迷宮定位航行階段的重要指標(biāo)，潛伏期越短，預(yù)示著動(dòng)物的學(xué)習(xí)空間能力越好。本研究顯示，銀屑病小鼠的定位航行潛伏期顯著增加，表明銀屑病小鼠的空間學(xué)習(xí)能力下降。在空間探索方面，動(dòng)物在平臺(tái)位置穿越的次數(shù)越多，停留時(shí)間和游程越長(zhǎng)，說(shuō)明其空間記憶能力越好。銀屑病小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)較正常小鼠明顯降低，平臺(tái)象限停留的時(shí)間及平臺(tái)象限游程均顯著下降，表明銀屑病小鼠空間記憶能力受到損傷。這一結(jié)果與既往結(jié)論“銀屑病患者用于評(píng)估視覺(jué)空間工作記憶的時(shí)間明顯延長(zhǎng)［9］”相一致。

表1 應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估銀屑病對(duì)小鼠模型空間學(xué)習(xí)和記憶功能的影響（±s）

表1 應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估銀屑病對(duì)小鼠模型空間學(xué)習(xí)和記憶功能的影響（±s）

指標(biāo)穿越平臺(tái)次數(shù)平臺(tái)象限停留時(shí)間（s）游程（mm）第一象限停留時(shí)間（s）游程（mm）第二象限停留時(shí)間（s）游程（mm）第四象限停留時(shí)間（s）游程（mm）對(duì)照組（n=10）5.00±1.76 19.37±5.00 500.34±117.09 9.34±3.74 237.31±77.82 20.54±5.45 489.16±188.82 11.42±2.81 251.80±64.00銀屑病組（n=10）1.70±0.95 13.34±4.60 251.29±71.59 11.54±3.75 206.13±51.84 21.77±6.62 309.97±126.49 14.02±1.81 290.84±78.97 t值5.21 2.80 5.74 1.44 1.05 0.46 2.49 2.46 1.22 P值＜0.01＜0.05＜0.01＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＜0.05＞0.05

圖3 對(duì)照組和銀屑病組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)軌跡 銀屑病組平臺(tái)穿越次數(shù)明顯低于對(duì)照組

越來(lái)越多的研究表明，小鼠的大腦皮層、皮層下區(qū)域以及海馬在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的空間學(xué)習(xí)和探索策略中發(fā)揮重要作用［15］。同樣，銀屑病患者在認(rèn)知測(cè)試中出現(xiàn)無(wú)法用認(rèn)知策略進(jìn)行回憶信息的錯(cuò)誤模式，與大腦皮層下額葉區(qū)域有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者前額皮質(zhì)可能存在結(jié)構(gòu)和功能的異常，其神經(jīng)影像學(xué)表現(xiàn)為雙側(cè)島葉皮層信號(hào)降低［2］。同時(shí)，伴有認(rèn)知功能障礙的銀屑病患者大腦左半球海馬旁回、顳上回和額上回的腦厚度變薄，這些區(qū)域恰恰是認(rèn)知功能的區(qū)域［2，16］。此外，認(rèn)知功能障礙的出現(xiàn)也可能是由于銀屑病炎癥狀態(tài)所致，我們前期研究表明銀屑病患者不僅皮膚發(fā)生炎癥，而且全身也處于炎癥狀態(tài)，這種炎癥程度還與銀屑病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［17］。炎癥介質(zhì)已經(jīng)被證實(shí)在阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［18］，如超敏C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子α很可能是引起相關(guān)神經(jīng)功能損傷的原因。已有研究證實(shí)，神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)是一個(gè)功能統(tǒng)一體，推測(cè)認(rèn)知功能障礙是神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞因子相互作用、各個(gè)系統(tǒng)互相影響的結(jié)果。

本研究初步顯示銀屑病小鼠認(rèn)知功能下降，局限性在于樣本量有限，未能對(duì)時(shí)間段、皮損嚴(yán)重程度與認(rèn)知功能的關(guān)系進(jìn)行分析，且本實(shí)驗(yàn)僅選擇了一種銀屑病經(jīng)典模型，在未來(lái)研究中可以引入不同的銀屑病模型進(jìn)行更深入的比較。銀屑病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，而認(rèn)知功能涉及機(jī)制廣泛，將來(lái)可以進(jìn)一步開(kāi)展銀屑病認(rèn)知功能改變的機(jī)制研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突