徐單單，王穎，陳素紅

(1廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣州510520；2暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；3仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品學(xué)院)

肝癌是世界第五大常見腫瘤疾病[1],盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)取得巨大進(jìn)步，但是其預(yù)后仍較差,5年生存率較低。肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與耐藥是患者5年生存率降低的主要原因，大約有70%的肝癌患者在治療5年后會(huì)復(fù)發(fā)[2]?；熓歉伟┲委煹闹饕侄?。Sorafenib是一種多酶抑制劑靶點(diǎn)藥物，為常見的肝癌治療一線藥物,主要用于不能進(jìn)行手術(shù)治療的肝癌患者[3]，但是Sorafenib使用后患者會(huì)出現(xiàn)明顯的耐藥或因其不良反應(yīng)如高血壓、惡心、皮膚病以及腹瀉等[4]而停藥，這些缺點(diǎn)限制了Sorafenib的臨床應(yīng)用。其他肝癌化療藥物，如Regorafenib、Ramucirumab臨床效果均不及Sorafenib[5]。所以，研究及開發(fā)其他靶點(diǎn)的肝癌治療藥物成為必需。

本課題組之前已深入研究過Hsp90抑制劑SNX-2112，發(fā)現(xiàn)其能抑制黑色素瘤、肝癌、乳腺癌細(xì)胞的增殖[6～9]，但是其水溶性不好。2008年1月至今，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，觀察了SNX-2112的衍生物WH-4對(duì)肝癌細(xì)胞SK-HEP-1增殖、凋亡和化療藥物耐藥基因ABCB1、ABCG2的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 肝癌細(xì)胞株SK-HEP-1購自中山大學(xué)細(xì)胞庫，采用1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清，1%青霉素鏈霉素)，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。WH-4由暨南大學(xué)王一飛教授實(shí)驗(yàn)室合成。17-AAG購自上海藍(lán)木生物公司，MTT粉末購自碧云天生物技術(shù)公司，1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自四季青公司，青霉素鏈霉素購自廣州天駿公司，AnnexinV-APC/7AAD細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基公司。Bcl2(#4223)抗體、Bcl-xL(#2764)以及Bax(#2774)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。ECL細(xì)胞Western blotting發(fā)光液購自美國Millipore公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，PCR儀器購自BIO-RAD公司。

1.2 不同濃度WH-4對(duì)肝癌細(xì)胞SK-HEP-1增殖的影響觀察 ①采用MTT法。將肝癌細(xì)胞SK-HEP-1隨機(jī)分為A、B、C組，每組肝癌細(xì)胞SK-HEP-1經(jīng)胰酶消化后，接種到96孔板，每孔接種5 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，A組分別加入0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L WH-4，B組分別加入0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L 17-AAG， C組加等量的生理鹽水。1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、48 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD /對(duì)照組OD ×100%(實(shí)驗(yàn)組指A組、B組，對(duì)照組指C組)②采用BrdU法。將肝癌細(xì)胞SK-HEP-1隨機(jī)分為A1、B1、C1組，分別加入2.3 μmol/L WH-4、2.6 μmol/L 17-AAG組及等量的生理鹽水，1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，1 500 r/ min離心5 min離心收集收集各組肝癌細(xì)胞，按試劑盒說明書操作，最后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞增殖情況( 藥物對(duì)細(xì)胞有抑制效果，綠色熒光變?nèi)?；反之，變?qiáng))。③克隆形成率的測(cè)算：采用軟瓊脂平板實(shí)驗(yàn)。將肝癌細(xì)胞SK-HEP-1隨機(jī)分為A2、B2、C2組，分別加入2.25 μmol/L WH-4、2.80 μmol/L 17-AAG及等量生理鹽水，用含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(2倍雙抗)將各組肝癌細(xì)胞SK-HEP-1調(diào)整至密度30 000個(gè)/mL，按試劑盒說明書操作。顯微鏡下觀察大于50個(gè)細(xì)胞的結(jié)晶紫染色克隆。細(xì)胞克隆形成率 = 大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù) / 接種細(xì)胞數(shù) × 100%。

1.3 WH-4對(duì)肝癌細(xì)胞SK-HEP -1凋亡的影響觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。實(shí)驗(yàn)分組及處理同克隆能力觀察試驗(yàn)。1640培養(yǎng)基培養(yǎng)各組肝癌細(xì)胞SK-HEP-1 48 h，棄去培養(yǎng)基上清，胰酶消化細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞3次，收集5×105個(gè)細(xì)胞；每個(gè)樣品加入500 μL結(jié)合液重懸細(xì)胞，錫箔紙包好靜置15 min；然后每個(gè)樣品再加入5 μL的Annexin-APC凋亡試劑，輕輕混勻后靜置5 min，再加5 μL的7-AAD凋亡試劑，混勻；室溫下避光孵育15～20 min，流式細(xì)胞儀測(cè)算細(xì)胞凋亡率。

1.4 WH-4對(duì)肝癌細(xì)胞SK-HEP-1凋亡蛋白Bcl2、Bax、Bcl-xL的影響觀察 采用Western blotting法。實(shí)驗(yàn)分組及處理同同克隆能力觀察試驗(yàn)。1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，1 500 r/min離心5 min離心收集各組肝癌細(xì)胞SK-HEP-1，細(xì)胞用含苯甲基磺酰氟(PMSF)的 RIPA 裂解液裂解，金屬浴加熱裂解細(xì)胞到完全溶解。然后使用BCA法測(cè)定蛋白濃度，并使用SDS loading buffer上樣緩沖液稀釋細(xì)胞。蛋白樣品使用12%的SDS-PAGE 凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。5%脫脂牛奶(0.1%吐溫20，TBS緩沖液)室溫封閉 1.5 h，TBST緩沖液洗滌膜3次后，一抗與PVDF 膜4 ℃ 雜交孵育過夜。次日，TBST洗滌PVDF膜3次，然后加入相應(yīng)的二抗，室溫1 h，利用化學(xué)發(fā)光法顯影蛋白表達(dá)水平。使用GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.5 WH-4對(duì)多藥耐藥基因 ABCB1、乳腺癌耐藥蛋白(ABCG2)的影響觀察 采用qPCR法。將肝癌細(xì)胞SK-HEP-1隨機(jī)分為A3、B3、C3組，分別加入2.30 μmol/L WH-4、2.65 μmol/L 17-AAG及等量生理鹽水。1 500 r/ min離心收集上述濃度藥物作用48 h后的細(xì)胞，棄去上清，提取總RNA，之后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；反應(yīng)條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA用于下一步的qPCR反應(yīng)過程：ABCB1:F引物：5′-GGGACGCTGGTTCCCGGAAT TTCCGGGCC-3′，R引物：5′-CCGGTTTAAAGGGCCTTGGAACCTTGG-3′。ABCG2:F引物：5′-GGCCAATTGCCTGGGAAGGTTCCGGAACC-3′，R引物：5′-CCCCGGGTTAAGGCCAAGGTTCCGGTTAATT-3′;GAPDH：F引物：5′-TTGAGGTTAAGTGAAC CGGGCCTTAACC-3′，R引物：5′-AATTGGCCCGGTAATGTGGCCAATGGC-3′，反應(yīng)體積為10 μL，反應(yīng)步驟為2步法，反應(yīng)條件：1個(gè)循環(huán)，95 ℃、5 s，60 ℃、5 s；40 個(gè)循環(huán)， 95 ℃、15 s ，60 ℃、1 min，用2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組肝癌細(xì)胞SK-HEP-1增殖抑制率、增殖活性比較 加入0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L WH-4后24 h,A組細(xì)胞存活率分別為93.00 %±5.85%、61.82%±3.86%、30.58%±3.25%、28.57%±3.49%、15.35%±3.47%, IC50為(2.35±0.25)μmol/L；48 h后，A組細(xì)胞存活率為90.26%±4.18%、61.26%±3.18%、25.61%±2.57%、21.68%±3.15%、10.54%±2.89%，IC50為(2.05±0.25)μmol/L。0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L 17-AAG作用后24 h，B組細(xì)胞存活率分別為95.04%±6.45%、66.81%±3.64%、43.61%±3.68%、31.27%±2.89%、23.54%±3.18%，IC50為(2.65±0.18)μmol/L；48 h后，B組細(xì)胞存活率分別為95.23%±6.89%、65.31%±3.28%、39.26%±3.27%、31.28%±2.95%、18.21%±3.25%， IC50為(2.45±0.18 )μmol/L。隨著WH-4藥物濃度的提高以及藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率降低[R2= 0.647 (48 h)，R2= 0.524 (24 h)，P均<0.05，見圖1、2]。與B1組相比，A1組SK-HEP-1細(xì)胞綠色熒光顯著性減弱，細(xì)胞增殖受到顯著性抑制，見圖3。A2、B2、C2 組細(xì)胞克隆數(shù)目分別為(1 523±123)、(3 652±235)、(28 890± 865)個(gè)，克隆形成率分別為5.01 %±0.4%、12.17 %±0.7%、96.3±4.72%，A2組、B2組細(xì)胞克隆形成率相比，P<0.05，見圖4。

圖1 不同濃度WH-4作用24 h后兩組細(xì)胞存活曲線

圖2 不同濃度WH-4作用48 h后兩組細(xì)胞存活曲線

圖3 三組SK-HEP-1細(xì)胞的綠色熒光圖像

圖4 三組肝癌細(xì)胞SK-HEP-1克隆形成結(jié)果

2.2 各組肝癌細(xì)胞SK-HEP-1凋亡率及凋亡蛋白 Bax、Bcl2、Bcl-xL的表達(dá) A2、B2 組細(xì)胞凋亡率分別為20.0%±1.25 %、12.2%±1.59%，兩組比較，t=0.342，P<0.05。與B2組比較，A2組Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量提高，Bcl-2及Bcl-xL蛋白表達(dá)量降低，WH-4誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡程度明顯增加。見圖5。

圖5 三組肝癌細(xì)胞SK-HEP-1凋亡蛋白的表達(dá)

2.3 各組肝癌細(xì)胞SK-HEP-1耐藥基因ABCB1、ABCG2表達(dá)比較 A3、B3、C3組ABCB1相對(duì)表達(dá)量分別為0.38±0.04、0.59±0.05、1.00±0.04, ABCG2分別為0.47±0.03、0.69±0.06、1.00±0.04，A3、B3組ABCB1、ABCG2相對(duì)表達(dá)量比較，t分別為-8.88、-13.00，P均<0.05。

3 討論

熱休克蛋白是細(xì)胞受到應(yīng)激因素的情況下如熱、輻照、饑餓等合成的一組高度保守的蛋白分子，根據(jù)同源性及分子量命名為Hsp90、Hsp70、Hsp40、Hsp27等[10]。它是一種高度保守的分子伴侶家族，參與細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、激酶活化、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生理過程，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及發(fā)育等生理活動(dòng)[11]。

Hsp90是分子伴侶蛋白，在細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激的情況下如饑餓、高熱等合成的分子，其功能主要是幫助其他的重要分子如激酶達(dá)到正確構(gòu)象，這些激酶等因子稱為Hsp90的客戶蛋白[12]。Hsp90的客戶蛋白還包括其他因子，如細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等，這些客戶蛋白介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等活動(dòng)，如Akt、Erk、p38、EGFR、HIF1α等[13～15]。因此，抑制Hsp90功能可導(dǎo)致其多個(gè)客戶蛋白的生物學(xué)功能受到抑制，從而在體內(nèi)外具有明顯的抗腫瘤效果，這使得Hsp90成為有效的抗腫瘤分子靶點(diǎn)。目前研究比較活躍的化合物有g(shù)eldanamycin、17-AAG、IPI-504、SNX-2112。如臨床Ⅱ期研究顯示，17-AAG與曲妥珠單抗聯(lián)合使用治療Her2+乳腺癌，可有效抑制乳腺癌細(xì)胞的存活[16]。IPI-504水溶性更好，具有良好的藥物動(dòng)力學(xué)，且肝毒性降低，目前已在臨床中進(jìn)行應(yīng)用[17, 18]。本研究發(fā)現(xiàn)，WH-4能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖，且具有藥物濃度依賴性，不管是24 h還是48 h，細(xì)胞增殖都受到抑制。但由于細(xì)胞在48 h狀態(tài)不好，因此,48 h后藥物對(duì)細(xì)胞的效果如何還有待進(jìn)一步研究。

在多種腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，Hsp90呈高表達(dá)現(xiàn)象，其表達(dá)水平與腫瘤患者生存期存在密切關(guān)系。近年以Hsp90為分子抗腫瘤靶點(diǎn)的研究很多。首次發(fā)現(xiàn)，Hsp90抑制劑格爾德霉素(Geldanamycin)通過結(jié)合到Hsp90-ATP結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞增殖活性[19]。經(jīng)典的Hsp90抑制劑17-AAG抑制胰腺癌I型胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGF1R)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子蛋白3(STAT3)信號(hào)通路，從而達(dá)到腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的效果[20]。NVP-AUY922對(duì)小鼠結(jié)腸癌異體移植瘤模型腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，還發(fā)現(xiàn)這種藥物本身對(duì)小鼠生理活動(dòng)并沒有明顯的毒性。Mayor-Lopez等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90抑制劑NCT-50具有明顯的抗非小肺癌細(xì)胞血管新生功能以及細(xì)胞毒性，進(jìn)一步研究[22]發(fā)現(xiàn)，NCT-50通過結(jié)合到Hsp90的ATP疏水口袋發(fā)揮其功能。本研究中的WH-4屬于苯甲酰胺化合物，主要針對(duì)Hsp90的疏水口袋設(shè)計(jì)，可干擾Hsp90作為分子伴侶的功能，研究結(jié)果顯示，隨著WH-4藥物濃度的提高以及藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率降低。2.30 μmol/L的WH-4與2.60 μmol/L的17-AAG作用SK-HEP-1細(xì)胞48 h，與C組相比，SK-HEP-1綠色熒光顯著減弱。提示W(wǎng)H-4對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用。細(xì)胞經(jīng)WH-4作用后細(xì)胞克隆形成數(shù)目顯著減少，克隆形成率為5.01 %±0.4%，提示W(wǎng)H-4可抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成。與17-AAG比較，2.25 μmol/L WH-4可使肝癌細(xì)胞SK-HEP-1凋亡率升高，Bcl2、Bcl-xL表達(dá)水平下調(diào)，Bax表達(dá)水平上調(diào)，提示W(wǎng)H-4對(duì)肝癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的效果；qPCR分析結(jié)果顯示多藥耐藥基因ABCB1及ABCG2表達(dá)水平降低，提示W(wǎng)H-4可能對(duì)肝癌細(xì)胞的多藥耐藥性有抑制效果。

綜上所述，Hsp90抑制劑WH-4可抑制肝癌細(xì)胞SK-HEP-1增殖、誘導(dǎo)其凋亡、抑制其克隆形成，并預(yù)防耐藥的發(fā)生，為肝癌的臨床治療提供了新的思路。本研究的不足之處在于WH-4誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體途徑還不清楚，在體內(nèi)效果還不明確，有待進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)。