毛柳東

(深圳市葵涌人民醫(yī)院葵豐社區(qū)健康服務(wù)中心，廣東 深圳 518116)

非酒精性脂肪肝是指肝細胞內(nèi)脂肪大量存積、變性導致的臨床病理綜合征，患者無過度飲酒史但大量的脂肪類食物攝入也造成了非酒精性脂肪肝發(fā)病率提高，嚴重者甚至發(fā)展為肝硬化或終末期肝病，嚴重威脅患者的健康和日常生活，并且目前臨床上尚未出現(xiàn)有效的治療藥物[1-2]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)是血清中常見的致炎因子，解偶聯(lián)蛋白2(UCP-2)為肥胖的候選基因，與胰島素形成抵抗，均與脂肪肝的形成密切相關(guān)，鹽酸維格列汀為新型的抗高血糖藥物，能夠改善肝臟內(nèi)的脂肪沉積，但是作用機制尚未明確[3]。本文旨在探討鹽酸維格列汀對非酒精性脂肪肝大鼠肝組織UCP-2的表達及血清炎性因子的影響，為非酒精性脂肪肝的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 四川成都達碩生物有限公司提供的實驗SD大鼠(合格證號：0018160)24只，體重120～170g，平均體重(152.92±10.23)g，隨機分成3組，每組各8只。

1.2設(shè)備與試劑

1.2.1設(shè)備 動物IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)(蘇杭儀器)，病理切片機(Leica)，酶標儀(Tecan)，顯微鏡(明美)，微量核酸儀(北京奧凱)，Real time PCR(ABI7500)。

1.2.2試劑 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)，Real time PCR kit(Takara)，Tirzol(Ginbio?)，ELISA kit(武漢華美)，EMSA kit(Ginbio?)，DAB 顯色試劑盒(福建邁新)，ECL 顯色試劑盒(碧云天)，UCP-2 antibody(Abcam)，蘇木精-HE顯色試劑盒(Ginbio?)。

1.3實驗方法與檢測指標

1.3.1實驗方法 對照組大鼠給予正常飲食結(jié)合等量生理鹽水皮下注射；模型組大鼠給予正常飲食，并以0.3 mL/10g 給予5 %CCl4花生油溶液皮下多點注射，1次/5 d；干預組大鼠在造模后給予鹽酸維格列汀50 mg/kg·d，灌胃給藥。8周后所有大鼠麻醉后斷頭取血分離血清，檢測IL-6、TNF-α和轉(zhuǎn)氨酶水平；將左葉肝組織取出并送檢，檢測其NF-κB活性和CUP-2表達。

1.3.2檢測指標 (1)NF- B活性檢測：采用EMSA法，利用BandScan5.0圖象分析軟件分析面積灰度，并根據(jù)結(jié)果計算NF-κB活性值。(2)病理學檢查：麻醉后斷頭處死大鼠，逐層剪開腹腔皮膚黏膜，取出肝左葉，采用4 %甲醛固定，同時給予脫水，透明，浸蠟，包埋，4μm切片，HE染色，光鏡下(100倍)觀察大鼠肝組織病理變化。(3)大鼠肝組織UCP-2的表達：免疫組化法和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測各組大鼠肝組織UCP-2的表達，具實施步驟如下：①RNA提?。阂旱心ソM織，常規(guī)RNA提取，微量核酸儀檢測，保證A260A280在1.8～2.0間 TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR鑒定基因表達，UCP-2引物 F: CTCCCAATGTTGCCCGAAAT，R: GAGGTCGTCTGTCATGAGGT，GAPDH 內(nèi)參 F: GATGC TGGTG CTGAG TATGCCGR: GTGGT GCAGG ATGCA TTGCT CTGA，cDNA的合成，a從-80 ℃冰箱中取出樣品 RNA，4 ℃下解凍，然后在 0.2 mL PCR 管中配制反應(yīng)溶液(表1)；b反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min (反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85 ℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))，4 ℃，②SYBR Green RT-PCR：a配制反應(yīng)體系(表2)，b將 PCR管置于定量 PCR 儀中進行反應(yīng)，反應(yīng)程序：Stage 1： 預變性，Reps：1，95 ℃ 30 s，Stage 2：PCR 反應(yīng)，Reps：40，95 ℃，3 s，60 ℃，30 s，Melt Curve Stage(由熔解曲線來判斷引物特異性，若同一對引物的所有樣品的熔解曲線均是單一峰且峰值一致則表示該引物特異性良好)。見表1，表2。(4)血清IL-6、TNF-α水平：ELISA法檢測各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平。(5)肝功能：檢測各組大鼠的肝功能 。

表1 20 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液配制體系

表2 20 μL反應(yīng)配制體系

2 結(jié)果

2.1不同組大鼠肝組織病理改變 正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細胞未見明顯脂肪變性，細胞核清晰可見；模型組中，肝細胞腫脹，胞質(zhì)疏散，含脂肪粒，肝細胞核固縮；干預組脂肪粒變小，肝細胞結(jié)果趨于正常。見圖1。

圖1 不同組大鼠肝組織 HE染色觀察肝組織病理改變(400X)

2.2不同組大鼠肝組織UCP-2表達 光學顯微鏡下顯示，對照組大鼠的肝組織病理學形態(tài)變化正常，且未見UCP2 陽性肝細胞；模型組大鼠肝組織病理學形態(tài)存在程度不一的變性情況，且細胞體積出現(xiàn)異常增大，并且UCP2 陽性肝細胞廣泛分布，主要分布在細胞漿中與脂肪化程度呈現(xiàn)正相關(guān)；而干預組大鼠UCP2陽性肝細胞顯著減少。見圖2，圖3。

圖2 不同組大鼠肝組織UCP-2 肝組織表達(400X)

2.3熒光定量PCR檢測不同組大鼠肝組織UCP-2基因表達 在對照組，P65和探針基本沒有結(jié)合；而在模型組，結(jié)合明顯增多；干預組結(jié)合能力降低，說明干預后P65的細胞核轉(zhuǎn)移能力和結(jié)合啟動下游因子轉(zhuǎn)錄的能力降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 熒光定量PCR檢測不同組大鼠肝組織UCP-2基因表達

2.4不同組大鼠血清IL-6、TNF-α水平及肝功能比較 干預組大鼠血清IL-6、TNF-α水平及肝功能指標水平較模型組顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同組大鼠血清IL-6、TNF-α水平及肝功能比較

注：與模型組比 a為P<0.05

3 討論

解偶聯(lián)蛋白存在于細胞線粒體膜中，可強化線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)反應(yīng)，促使形成線粒體ATP能量，使得體內(nèi)熱能得到釋放，調(diào)節(jié)線粒體對能力的儲備功能。UCP2是常見的解偶聯(lián)蛋白，是線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子通道，UCP2在正常肝組織細胞內(nèi)僅對庫普夫細胞存在表達，而對肝細胞無表達或表達水平不高，ATP在肝細胞氧化物中的生成效率減弱，抑制脂質(zhì)物質(zhì)在肝臟中堆積，使得患者肝細胞需求平衡起到調(diào)節(jié)作用[4-5]，UCP2的優(yōu)勢主要為：(1)對脂肪酸β氧化具有調(diào)節(jié)平衡作用，能夠讓干細胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運脂肪酸的能力提高，脂肪酸利用增加，減少脂質(zhì)物質(zhì)沉積；(2)能夠讓線粒體內(nèi)膜的電化學梯度以及合成ATP能力提高，介導質(zhì)子的跨膜內(nèi)流[6]；(3)促進線粒體能量的分解，儲備功能受到抑制，誘發(fā)肝細胞壞死，產(chǎn)生大量的LPO、ROS為UCP2的產(chǎn)生提供條件，UCP2表達增強，進而誘發(fā)肝細胞的壞死[7]。UCP2表達在脂肪肝形成過程中是具有雙面性，一方面肝組織可以適應(yīng)性做出反應(yīng)，減少肝臟組織內(nèi)脂質(zhì)物質(zhì)的沉積，但是另一方面由于脂質(zhì)物質(zhì)的過度分解，減弱了能量儲備功能，使得肝細胞耐受性降低，并且禁食、應(yīng)激注射等極易誘發(fā)肝細胞壞死[8]。

國內(nèi)外研究表明，非酒精性脂肪肝肝細胞UCP2表達異常增強，與高脂質(zhì)物質(zhì)、游離脂肪酸、內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子、白介素水平密切相關(guān)。動物實驗發(fā)現(xiàn)切除小鼠肝臟，發(fā)現(xiàn)肝細胞線粒體產(chǎn)物H2O2迅速增加，而后肝細胞中UCP2表達也迅速上升[8]，Pheiffer[9]認為非酒精性脂肪肝的肝組織細胞中的UCP2表達增強，能量的儲備受到影響，增加肝細胞壞死的敏感性，因此，下調(diào)肝細胞中UCP2表達為防治非酒精性脂肪肝提供了新的思路。

本實驗中采用SD大鼠建立非酒精性脂肪肝模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝組織病理學形態(tài)存在程度不一的變性，且細胞體積出現(xiàn)異常增大，UCP2 陽性肝細胞廣泛分布，主要分布在細胞漿中與脂肪化程度呈現(xiàn)正相關(guān)。實驗結(jié)果提示，在非酒精性脂肪肝的形成過程中，伴隨著脂肪肝程度的不斷發(fā)展，肝組織中UCP2表達增強，損傷肝細胞、肝功能與以往研究基本一致。同時本實驗還顯示，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α水平及肝功能指標水平顯著上升，進一步損傷肝臟組織，導致肝功能降低。

維格列汀是臨床治療2型糖尿病的常用藥物，其選擇性、競爭性較強，是可逆的DPP24抑制劑，正常情況下GIP(葡萄糖依賴性促胰島素多肽)、GLP21(胰高血糖素樣多肽)可有效維持機體內(nèi)葡萄糖濃度，具有腸促胰島素的作用，糖尿病患者的GIP作用損傷，僅有GIP21促進胰島素分泌的作用，維格列汀能夠與蛋白有效結(jié)合，形成DPP24復合物抑制該酶的活性，促進胰島素產(chǎn)生降低血糖濃度[10]。近年來國外研究顯示，維格列汀能夠降低非酒精性脂肪肝的肝細胞UCP2表達，且具有促進血清IL-6、TNF-α水平，改善肝功能的作用[11]。本研究顯示，維格列汀干預組大鼠UCP2陽性肝細胞顯著減少，大鼠血清IL-6、TNF-α水平及肝功能指標水平較模型組顯著下降。結(jié)果提示，鹽酸維格列汀可抑制非酒精性脂肪肝大鼠肝組織UCP-2的表達，降低血清IL-6、TNF-α炎性因子水平，促進肝功能恢復，為非酒精性脂肪肝的防治提供新的思路。