徐 麗，溫貴蘭，管?chē)?guó)丹，張升波，李昌紅，林漢卿，楊佰啟，田 浪

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗稱(chēng)“豬藍(lán)耳病”，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起，以母豬繁殖障礙和生長(zhǎng)豬的呼吸道疾病為主要特征，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。非結(jié)構(gòu)蛋白2（non-structural protein 2，NSP2）是PRRSV編碼的成熟蛋白中體積最大的蛋白，參與多肽的組合和病毒的復(fù)制等過(guò)程，屬于免疫顯性蛋白，有較強(qiáng)的免疫原性[2,3]。NSP2至少包括4個(gè)特異的功能區(qū)：氨基端CP/OUT區(qū)（N）、中央高變區(qū)（HV）、潛在穿膜區(qū)（TM）和羧基端富含半胱氨酸的未知功能區(qū)（C）[4,5]。NSP2的中央高變區(qū)突變率非常高，不僅表現(xiàn)為點(diǎn)突變、核苷酸插入、替換和缺失，還存在大片段核苷酸序列的插入與缺失[6]。研究發(fā)現(xiàn)NSP2能夠耐受432 aa的缺失[7]。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)，在NSP2受到干擾的細(xì)胞中可以很明顯地觀察到病毒的復(fù)制受到抑制，而通過(guò)真核表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方法表達(dá)NSP2，PRRSV 的復(fù)制能力得到了明顯提升，因此推測(cè)NSP2具有促進(jìn)病毒復(fù)制的能力。本研究以PRRSV NSP2的第147～323位氨基酸為研究對(duì)象，構(gòu)建重組質(zhì)粒PCDNA3.1-NSP2-147-323，轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察NSP2的定位情況，為PRRSV的復(fù)制和基因表達(dá)調(diào)控提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料豬繁殖與呼吸綜合征病毒、抗NSP2的鼠源單抗、pcDNA 3.1-5'Flag載體、感受態(tài)細(xì)胞DH5α、大腸桿菌BL21（DE3）及HEK 293T細(xì)胞由貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存；完整NSP2基因序列重組質(zhì)粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2由貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司；抗Flag鼠源單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司；RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和XbaI、DNA連接酶Solution I、DL2000 Marker及DL5000 DNA Marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)購(gòu)自碧云天公司；Alex555標(biāo)記的羊抗鼠抗體購(gòu)自華安生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室保存的PRRSV基因全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增147～323位氨基酸的引物NSP2-147：BamH I-F：5'-CGCGG ATCCTGTGAGCATAAAGGCGG-3'；NSP2-323：XbaI-R：5'-CTAGTCTAGACTACAAAGGCTCTT GAGTCAC-3'下劃線處分別為BamH I、XbaI酶切位點(diǎn)，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)531 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性5 s，62℃退火10 s，72℃延伸2 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 真核重組質(zhì)粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323的構(gòu)建通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA片段進(jìn)行純化回收，將回收的PCR產(chǎn)物與真核表達(dá)載體pcDNA 3.1-5'Flag分別用BamH I和XbaI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后16℃連接過(guò)夜。把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Amp的普通平板上，37℃培養(yǎng)12～16 h，挑取單菌落搖菌，通過(guò)菌液PCR進(jìn)行鑒定，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證為陽(yáng)性的質(zhì)粒送Invitrogen公司測(cè)序。

1.5 轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine? 2000 Reagent說(shuō)明書(shū)操作步驟，待HEK 293T細(xì)胞長(zhǎng)至單層且密度達(dá)90%以上時(shí)，轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒，試驗(yàn)同時(shí)設(shè)置完整NSP2基因序列重組質(zhì)粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2組作為對(duì)照。

1.6 間接免疫熒光棄去1.5中轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞板內(nèi)的培養(yǎng)液，用預(yù)冷的80%丙酮于-20℃固定30 min，取出后用PBS（0.01 mol/L）洗滌3次；分別加入Flag抗體（小鼠單抗）（1∶1000）及抗NSP2的鼠源單抗（1∶1000），濕盒中37℃孵育1 h，取出后PBS（0.01 mol/L）洗滌3次；分別加入FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)（1∶500）及Alex555標(biāo)記的羊抗鼠抗體（1∶500），濕盒中37℃孵育1 h，取出后PBS（0.01 mol/L）洗滌3次；再加入DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，避光孵育1～2 min，PBS（0.01 mol/L）洗滌3次；最后用磷脂甘油封片，共聚集顯微鏡觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果針對(duì)NSP2 147-323位氨基酸設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在約500 bp處有一特異性條帶，與預(yù)期一致（圖1）。

圖1 NSP2 147-323位氨基酸PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of NSP2 147-323 amino acid

2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323的雙酶切鑒定結(jié)果提取菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒，用BamH I和XbaI雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323，得到大小約為500 bp及5000 bp左右2條特異性條帶（圖2），證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果完整NSP2基因序列重組質(zhì)粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2可在細(xì)胞核周?chē)吹教禺愋詿晒?，真核重組質(zhì)粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323在細(xì)胞核及細(xì)胞核周?chē)捎^察到特異性熒光。PRRSV侵入細(xì)胞后，對(duì)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起關(guān)鍵作用的位置就是NSP2定位的核周區(qū)。溫貴蘭[9]在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NSP2的HEK 293T細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)觀察到特異性綠色熒光；Kappes等[10]也通過(guò)試驗(yàn)表明NSP2熒光染色主要分布在細(xì)胞核周?chē)?。在本試?yàn)中，完整NSP2基因序列重組質(zhì)粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2在HEK 293T細(xì)胞中主要分布在細(xì)胞核周?chē)?；然而，轉(zhuǎn)染真核重組質(zhì)粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示在細(xì)胞核及細(xì)胞和周?chē)捎^察到特異性熒光，造成這一現(xiàn)象的原因目前還未知，有待進(jìn)一步研究。

圖2 NSP2 147-323位氨基酸真核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 PCR amplification of NSP2 147-323 amino acid

圖3 重組質(zhì)粒在HEK 293T細(xì)胞中的定位Fig.3 Localization of recombinant plasmids in HEK 293T cells