董丹丹，劉 騰，繆秋紅，朱 杰，劉光清

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

MAVS（mitochondrial antiviral signaling protein）又稱IPS-1（interferon-Β）[1]、VISA（virus-induced signaling adaptor）[2]、Cardif（CARD adaptor inducing interferon-Β）[3]。MAVS在天然免疫中至關重要，主要介導下游 NF-κB 等因子的激活以應對病毒感染。人源MAVS的mRNA含有兩個剪接體，長度分別為3.4 kb和9.5 kb。MAVS含有540個氨基酸，可分為三部分：N端CARD樣結(jié)構(gòu)域（半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域caspase recruitment domain）、脯氨酸富集結(jié)構(gòu)域和C端的跨膜結(jié)構(gòu)域[4]。Seth等[5]2005年首次證實MAVS可以介導由病毒感染引起的NF-kappaB和IRF3的激活，從而誘導機體的免疫應答，并進一步證明NF-kappaB和 IRF 3的磷酸化需要MAVS。Moore等[6]2008年證實NLRX1可以拮抗MAVS介導的機體免疫應答。

小反芻獸疫病毒是由PPRV引起的一種急性、高傳染性疾病，主要感染綿羊和山羊[7]。由于小反芻獸疫對養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟損失，現(xiàn)已成為全球根除目標之一[8]。為了進一步研究MAVS能否應對PPRV引起的病毒感染，本研究對綿羊MAVS基因進行克隆并構(gòu)建原核表達載體，通過純化蛋白并免疫小鼠制備抗MAVS基因的多抗，為進一步研究MAVS與PPRV之間的相互作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒和菌株感受態(tài)細胞DH5α、BL21購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；原核表達載體pET-32a、真核表達載體pCMV-myc及綿羊肺細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑LATaq聚合酶、膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；pMD19T載體、SolutionⅠ連接酶、XhoⅠ和EcoR V限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自 AXYGEN 公司；抗His 標簽鼠單克隆抗體購自北京康為世紀公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購自 Thermo 公司；其余試劑均為分析純。

1.3 羊MAVS基因的克隆根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中MAVS基因序列（登錄號：XM_015099722.1）設計PCR引物，上游引物MAVS-F：5'-GATATCATGACGTT TGCCGAGGACAGA-3'（下劃線部分為EcoR V 酶切位點），下游引物MAVS-R：5'-CCGCTCGAGT CACTGGGGTAGGCGCCGCCGGTACAG-3'（下劃線部分為XhoⅠ 酶切位點），產(chǎn)物長度為1569 bp，共編碼523個氨基酸。引物由上海華津科技有限公司合成。

利用Trizol法提取綿羊肺細胞的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模板擴增MAVS基因。將擴增產(chǎn)物純化后連接至pMD19-T 載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆測序。

PCR反應體系：模板 DNA（50 ng/ μL）2 μL，ExTaqMix 25 μL，上下游引物（10 mmol/L）各2 μL，補加滅菌蒸餾水至50 μL。PCR擴增條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min 45 s，34 個循環(huán)；72℃再延伸5 min。

1.4 原核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將成功連接pMD19-T 載體并測序正確的菌液擴大培養(yǎng)，經(jīng)質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒進行雙酶切后連接至原核表達載體pET-32a及真核表達載體pCMV-myc，菌液鑒定后送去測序。

1.5 重組質(zhì)粒的原核表達將pET-32a-MAVS轉(zhuǎn)化至BL21感受肽細胞，經(jīng)抗性篩選后挑取單個菌落于氨芐抗性LB中，37℃ 220 r/min搖床培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入終濃度為1.0 mmol/L IPTG，然后置于16℃搖床繼續(xù)震蕩培養(yǎng)20 h。將菌液離心后，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳。

1.6 目的蛋白的純化擴大培養(yǎng)的菌液經(jīng)IPTG誘導20 h后離心，棄上清液，用PBS洗滌沉淀，室溫離心30 min后再次棄去上清，用PBS將沉淀重懸后-80℃反復凍融3次。將菌液進行超聲破碎，工作電壓為300 V，工作 5 s，間隔 9 s，超聲至菌液不黏稠。將菌液反復凍融3次，離心后棄上清。用含2 mol/L尿素的Tris緩沖液（50 mmol/L Tris-HCL、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCL、0.5% Triton X-100，pH 8.0）洗滌包涵體，10 000×g離心30 min后棄上清，重復操作 2 次。洗滌沉淀，10 000×g離心30 min后棄上清，重復2次。用含8 mol/L尿素的Tris緩沖液溶解沉淀（4 mL/g），4℃過夜，次日12 000×g離心10 min，將上清加入透析袋中，分別用含6、5、4、3、2 mol/ L尿素進行梯度復性[9]。

1.7 羊MAVS多克隆抗體的制備用純化的MAVS重組蛋白免疫6周齡BALB/ c SPF 雌鼠，首免時將弗氏完全佐劑與蛋白混勻后多點皮下注射小鼠背部，免疫劑量為50 μg/只。2周和4周后分別進行二免和三免，將弗氏不完全佐劑與蛋白混勻后多點皮下注射小鼠背部，免疫劑量同上。三免7 d后眼眶采血并分離血清。

1.8 多克隆抗體特異性檢測將真核表達質(zhì)粒 pCMV-myc-MAVS轉(zhuǎn)染CV細胞，48 h后收集蛋白樣品，100℃煮樣10 min后進行SDS- PAGE 電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后用5%脫脂乳室溫封閉2 h，以制備的多抗（1∶200）作為一抗，以HRP標記的山羊抗鼠IgG（1∶10000）作為二抗進行Western blot檢測。

2 結(jié)果

2.1 MAVS基因的克隆提取綿羊肺細胞RNA并將其反轉(zhuǎn)錄后作為模板，成功擴增出MAVS基因，大小約1569 bp（圖1），與預期條帶大小相符，經(jīng)測序后確認無堿基突變。

圖1 MAVS基因的 PCR 擴增Fig.1 Amplification results of MAVS

2.2 重組表達質(zhì)粒的鑒定pET-32a-MAVS 經(jīng)EcoR V 和XhoⅠ雙酶切，電泳結(jié)果顯示有兩條特異性條帶，分別為載體和目的基因（圖2），表明MAVS基因插入到原核表達載體pET-32a中，測序結(jié)果顯示無堿基突變。

2.3 MAVS蛋白鑒定及可溶性分析SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET-32a -MAVS轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞后，經(jīng)IPTG誘導成功表達目的蛋白，MAVS融合蛋白大小為95 kDa（圖 3A），與預期相符。未誘導的重組質(zhì)粒及誘導的空載體質(zhì)粒無目的蛋白表達。Western blot顯示MAVS重組蛋白主要以包涵體形式表達（圖 3B）。

2.4 重組MAVS蛋白多克隆抗體的 Western blot分析轉(zhuǎn)染真核表達質(zhì)粒pCMV-myc-MAVS，48 h后收取細胞裂解液進行Western blot，將制備的多克隆抗體作為一抗。結(jié)果顯示95 kDa處出現(xiàn)目的條帶，表明制備的抗體可與 MAVS蛋白反應，并具有良好的特異性（圖4）。

圖2 重組表達質(zhì)粒 pET-32a-MAVS的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-32a-MAVS digested with double enzymes

圖3 MAVS 蛋白鑒定及可溶性分析Fig.3 Identification and soluble analysis of MAVS protein

圖4 純化的 MAVS重組蛋白分析Fig.4 Purified MAVS recombinant protein

3 討論

MAVS是線粒體外膜上的一種接頭蛋白，可激活天然免疫信號通路并誘導干擾素表達， 參與抗病毒免疫反應。當RNA病毒感染細胞后，胞質(zhì)中的RIG I受體可識別并結(jié)合MAVS，促使其發(fā)生寡聚化，產(chǎn)生I型干擾素及促炎性細胞因子。雖然MAVS在抗病毒天然免疫中發(fā)揮至關重要的作用，但病毒也會形成各種各樣的拮抗機制[10]。研究表明，漢坦病毒的糖蛋白片段能阻止IRF3磷酸化，進而抑制RIG I/MAVS/TBK1/TRAF3信號通路，通過減少IFNβ的產(chǎn)生使其在人內(nèi)源細胞中成功復制[11]。丙肝病毒的NS3/4A可將MAVS切割，使其不能激活下游信號，從而阻斷RLR介導的信號通路[12,13]。甲肝病毒3ABC（3Cpro 半胱氨酸蛋白酶的前體）及乙肝病毒X 蛋白HBX 也可裂解MAVS，從而阻斷信號轉(zhuǎn)導。由此可見，MAVS在抗病毒免疫反應中起著關鍵作用，深入研究MAVS的功能有助于了解宿主與病毒的相互作用機制。

本研究成功制備了反應良好的羊MAVS多克隆抗體，為研究其生物學功能及小反芻獸疫病毒的致病機制提供了平臺，也為深入研究相關的免疫信號通路，以及小反芻獸疫病毒逃逸宿主天然免疫的機制研究打下基礎。