李繼紅，徐騰飛，張耀丹，汪 偉，孟春春，孫英杰，譚 磊，宋翠萍，廖 瑛，仇旭升，丁 鏟

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）屬于副黏病毒科 （Paramyxoviridae）、副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus）[1]，基因組由單股負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA構(gòu)成，為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，依次編碼以下結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）和大分子蛋白（L）[1]。P蛋白、L蛋白和NP蛋白一起形成病毒RNA依賴性RNA聚合酶復(fù)合體（RNA dependent RNA polymerase，RdRp），負(fù)責(zé)病毒基因組的復(fù)制和病毒mRNA轉(zhuǎn)錄[2]。

副黏病毒磷蛋白，即P蛋白（phosphoprotein），富含絲氨酸和蘇氨酸，以其高度磷酸化而得名。據(jù)報(bào)道，很多宿主細(xì)胞的磷酸激酶參與了副黏病毒P蛋白的磷酸化。例如，激酶PCK介導(dǎo)了人副流感病毒3型（human Parainfluenza virus type 3，hPIV3）和仙臺(tái)病毒（Sendai virus，SV）P蛋白的磷酸化，而激酶CKII則介導(dǎo)了呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）和麻疹病毒（(Measles virus，MeV）的磷酸化。P蛋白的磷酸化具有重要的生物學(xué)意義[3]。一般認(rèn)為，P蛋白磷酸化能影響病毒的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制。據(jù)報(bào)道，MeV P蛋白磷酸化位點(diǎn)S86和S151參與了P蛋白與NP蛋白的互作，調(diào)節(jié)病毒基因的轉(zhuǎn)錄[4]。腮腺炎病毒（Mumps virus，MuV）P蛋白磷酸化位點(diǎn)T101與病毒的增殖效率相關(guān)[5]。

本研究通過純化La Sota病毒尿囊液來(lái)富集P蛋白，對(duì)NDV P蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜分析，獲得了6個(gè)磷酸化位點(diǎn)。通過構(gòu)建La Sota毒株微型基因組平臺(tái)，對(duì)NDV P蛋白磷酸化位點(diǎn)功能進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 病毒、細(xì)胞和質(zhì)粒La Sota經(jīng)典疫苗株購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，屬于ClassⅡ基因Ⅱ型；穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的BSR-T7/5細(xì)胞由揚(yáng)州大學(xué)劉秀梵院士惠贈(zèng)；表達(dá)NP、P和L基因的真核表達(dá)質(zhì)粒（pCINP、pCI-P和pCI-L）由徐丹等構(gòu)建；正向克隆插入leader-eGFP-trailer基因的La Sota毒株微型基因組質(zhì)粒TVT-LGT由于洋等構(gòu)建[6]；病毒擴(kuò)增使用的SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通公司。

1.2 主要試劑E.coliDH5α感受態(tài)、Plasmid Mini Kit購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)自Promega公司；PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase 高保真酶購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑FuGENE購(gòu)自Promega公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。

1.3 帶熒光素酶報(bào)告基因的LaSota株微型基因組的構(gòu)建根據(jù)螢火蟲熒光素酶（luciferase）基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物：Luc-TVT-MluI（5'-GTTGGTACGCGTACCATGGAAGACGCCAA AAAC -3', 下劃線為MluI酶切位點(diǎn)）；Luc-TVTKpnI（5' -GCCCCGACTGGTACCTTACACGGCG ATCTTTCC -3', 下劃線為KpnI酶切位點(diǎn)）。PCR反應(yīng)條件：95℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物純化回收后，依次經(jīng)過MluI和KpnI酶切后定向克隆至TVT-LGT質(zhì)粒，用luc基因替換TVT-LGT質(zhì)粒中原有的gfp基因。酶切鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為TVT-LLT，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.4 NDV La Sota微型基因組的活性檢測(cè)利用間接免疫熒光檢測(cè)La Sota微型基因組的活性。按照FuGENE轉(zhuǎn)染試劑盒說明書方法，將3 μg質(zhì)粒（TVT-LLT 1 μg、pCI-NP 1 μg、pCI-P 0.5 μg、pCI-L 0.5 μg）轉(zhuǎn)染至6孔板中培養(yǎng)的密度為60%～80%的單層BSR T7/5 細(xì)胞中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后，更換為含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)。陰性對(duì)照組不加入pCI-L，轉(zhuǎn)染對(duì)照中加入表達(dá)GFP的微型基因組pTVT-LGT。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察對(duì)照組細(xì)胞報(bào)告基因表達(dá)情況。間接免疫熒光常規(guī)操作參照文獻(xiàn)[7]。按照Luciferase Assay System說明書，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組以及陰性對(duì)照組的螢火蟲熒光素酶（luciferase）表達(dá)水平。

1.5 NDV P蛋白的質(zhì)譜分析取NDV經(jīng)典疫苗株La Sota病毒新鮮尿囊液，4℃、16 000×g高速離心2 h，上清用超濾管過濾（Amicon? Ultra-15 Centrifugal Filter Device）。取14.9 mL上清與 0.1 mL NaCl（1 mol/L）混合后加入過濾裝置，4℃、4000×g離心30 min，最終收集到2 mL富集后的液體。用富集后La Sota病毒尿囊液加等量2×蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min后進(jìn)行10%分離膠的SDSPAGE電泳及Western blot檢測(cè)。Western blot鑒定P蛋白條帶大小，一抗為本實(shí)驗(yàn)室制備的P單抗，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，用ECL增強(qiáng)顯色試劑盒進(jìn)行顯影。SDS-PAGE膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，取相應(yīng)位置的蛋白條帶，送至上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析，確定其磷酸化位點(diǎn)。

1.6 生物信息學(xué)分析通過在線平臺(tái)NetPhos 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/），NetPhosK 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/）以及Scanite motif scan（http://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml）對(duì)NDV La Sota株P(guān)蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過NetSurP online server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/）分析這些磷酸化位點(diǎn)暴露在蛋白表面的概率。

1.7 P蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的磷酸化位點(diǎn)突變根據(jù)質(zhì)譜分析和基因比對(duì)分析結(jié)果，分別對(duì)La Sota毒株P(guān)蛋白氨基酸的Ser56、Ser77、Thr78、Thr82、Ser141和Ser164位6個(gè)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。根據(jù)丙氨酸掃描原理分別設(shè)計(jì)6對(duì)定點(diǎn)突變引物，以pCI-P為模板，擴(kuò)增P基因突變質(zhì)粒，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95℃變性20 s 、55℃退火30 s、72℃延伸5 min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。用瓊脂糖核酸膠回收試劑盒（天根）純化回收PCR產(chǎn)物，然后在37℃條件下用DpnI酶切消化1 h。將消化的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)，用無(wú)內(nèi)毒素小提中量試劑盒提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

表1 本研究使用的引物Table1 The primers in this study

1.8 質(zhì)譜的微型基因組驗(yàn)證將La Sota微型基因組和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR T7/5 細(xì)胞。根據(jù)pCI-P質(zhì)粒的不同分為6組，分別為原始pCI-P質(zhì)粒（陽(yáng)性對(duì)照），6個(gè)磷酸化位點(diǎn)突變的pCI-P質(zhì)粒，同時(shí)設(shè)置只轉(zhuǎn)染微型基因組作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)螢火蟲熒光素酸表達(dá)水平，具體方法見1.4。

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE電泳獲取La Sota毒株P(guān)蛋白NDV La Sota純化方法參照文獻(xiàn)[8]。病毒新鮮尿囊液純化后通過SDS-PAGE檢測(cè)，可見5條清晰條帶，其中44 kDa處條帶最為明顯，推測(cè)為NP蛋白，其上方一條較淡條帶為P蛋白（圖1A）。經(jīng)Western blot鑒定，P蛋白大小約為55 kDa（圖1B）。切取相應(yīng)位置的膠條，用于質(zhì)譜測(cè)序。

2.2 P蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果經(jīng)過LC-MS/MS分析，獲得大量多肽，分析確定6個(gè)磷酸化位點(diǎn)（表2和圖2）。通過在線分析，預(yù)測(cè)這些磷酸化位點(diǎn)的磷酸化激酶是PKC、CKII和GSK3。

圖1 SDS-PAGE電泳獲取La Sota病毒P蛋白Fig.1 La Sota P protein extracted by SDS-PAGE

表2 P蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果Table 2 LC-MS/MS results of NDV P protein.

圖2 La Sota P蛋白磷酸化質(zhì)譜分析圖譜Fig.2 Identification of La Sota-specific phosphorylated residues in MS

2.3 微型基因組的構(gòu)建和活性鑒定為確定質(zhì)譜檢測(cè)到的磷酸化位點(diǎn)的功能，構(gòu)建微型基因組質(zhì)粒TVTLLT，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖3。熒光素酶報(bào)告基因（luc）大小為1900 bp左右，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了與預(yù)期大小一致的特異性條帶（圖4A），將該基因回收并雙酶切后定向克隆至TVT-LGT質(zhì)粒。經(jīng)過酶切鑒定以及測(cè)序分析，結(jié)果表明，luc基因的開放閱讀框已經(jīng)被正確插入到真核表達(dá)載體TVT中。功能完整的微型基因組質(zhì)粒可以在 NDV 感染細(xì)胞內(nèi)利用病毒NP、P和L蛋白進(jìn)行裝配、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。通過轉(zhuǎn)染共感染NDV 的方法鑒定構(gòu)建微型基因組的活性，轉(zhuǎn)染對(duì)照組報(bào)告基因GFP正確表達(dá)（圖5）。熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，本研究構(gòu)建的微型基因組具有較高的螢火蟲熒光素酶活性，而陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組無(wú)明顯活性，表明成功構(gòu)建了具有活性的La Sota毒株微型基因組。

圖3 表達(dá)螢火蟲熒光素酶的NDV微型基因組TVT-LLT的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Schematic representation of Luc minigenome

圖4 帶有熒光素酶報(bào)告基因的La Sota微型基因組的構(gòu)建Fig.4 Construction of La Sota minigenome with luciferase gene by overlap PCR

圖5 微型基因組體系的功能驗(yàn)證Fig.5 Functional assessment of NDV minigenome in BSR T7/5 cells by GFP expression

2.4 磷酸化位點(diǎn)的功能檢測(cè)利用構(gòu)建的La Sota微型基因組，以其表達(dá)的螢火蟲熒光素酶活性的差異來(lái)直觀判斷磷酸化位點(diǎn)缺失對(duì)P蛋白功能的影響，而熒光素酶表達(dá)活性的差異可以根據(jù)其催化相同底物后造成的熒光值的差異來(lái)反應(yīng)。從圖6可以看出，T78、T82和S164位磷酸化位點(diǎn)缺失后微型基因組平臺(tái)的報(bào)告基因表達(dá)出現(xiàn)差異，但差異不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 磷酸化位點(diǎn)缺失的P蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)熒光素酶活性的影響（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）Fig.6 Luciferase activity of minigenome with diverse plasmid pCI-P mutants

3 討論

作為一種重要的副黏病毒，NDV的P蛋白含有豐富的蘇氨酸和絲氨酸，在自然條件下磷酸化水平較高，對(duì)病毒RNA的合成發(fā)揮著重要作用。但是NDV P蛋白磷酸化位點(diǎn)不明，具體功能仍然未知。

磷酸化是蛋白翻譯后修飾中最廣泛的共價(jià)修飾形式，同時(shí)也是真核生物中最重要的調(diào)控修飾形式。蛋白質(zhì)翻譯后修飾不僅影響蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)，還影響其亞細(xì)胞定位以及與其他物質(zhì)的相互作用，從而改變蛋白質(zhì)活性和功能。蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化的過程就是在蛋白激酶的作用下，將ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)上的過程，這類可以被蛋白激酶所識(shí)別的位點(diǎn)就是磷酸化位點(diǎn)。本研究通過對(duì)NDV P蛋白進(jìn)行磷酸化質(zhì)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了Ser56、Ser77、Thr78、Thr82、Ser141和Ser164共6個(gè)磷酸化位點(diǎn)。這些磷酸化位點(diǎn)主要位于P蛋白氨基酸端，與其他副黏病毒的報(bào)道類似[3,9]。據(jù)報(bào)道很多RNA病毒蛋白盡管富含磷酸化位點(diǎn)，但并非每一個(gè)磷酸化位點(diǎn)均具有生物學(xué)功能。例如，仙臺(tái)病毒（Sendai virus，SeV）P蛋白S249磷酸化位點(diǎn)突變后，在感染細(xì)胞后的磷酸化水平大幅度下降，而P蛋白的功能卻未受到影響[9]。水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）P蛋白磷酸化也對(duì)mRNA的合成和基因組的復(fù)制沒有大的影響[10]。

為了確定質(zhì)譜數(shù)據(jù)中磷酸化位點(diǎn)是否具有生物學(xué)功能，本研究構(gòu)建了一套表達(dá)熒光素酶的微型基因組系統(tǒng)進(jìn)行功能性鑒定。微型基因組系統(tǒng)是最常見的一種功能模擬平臺(tái)，通常用于檢測(cè)單股負(fù)鏈RNA病毒的RNA聚合酶蛋白亞基功能和基因組基序功能[9]。以NDV La Sota病毒株基因組骨架為平臺(tái)，插入熒光素酶（luciferase）作為報(bào)告基因替代病毒的整個(gè)編碼區(qū)，保留Leader和Trailer區(qū)域，構(gòu)建獲得的微型基因組DNA片段正向插入反向遺傳載體TVT（0.0）中，從而構(gòu)建了La Sota病毒的微型基因組質(zhì)粒。

與其他副黏病毒一樣，NDV的P蛋白是組成病毒RdRp的重要輔助因子，對(duì)病毒RNA和合成起著重要的調(diào)節(jié)作用。因此，P蛋白的重要磷酸化出現(xiàn)缺失會(huì)顯著影響RdRp編碼蛋白的表達(dá)水平，在微型基因組平臺(tái)上體現(xiàn)為熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)量的變化。根據(jù)這一原理，本研究使用“丙氨酸掃描”方法，將構(gòu)建的6個(gè)不同的P突變體作為輔助質(zhì)粒，通過報(bào)告基因的表達(dá)活性可以直觀的看出基因組轉(zhuǎn)錄水平高低。結(jié)果顯示，6個(gè)磷酸化位點(diǎn)缺失后，微型基因組仍能夠正常表達(dá)，但是表達(dá)水平發(fā)生了不同的變化。磷酸化位點(diǎn)T78和T82缺失后，報(bào)告基因表達(dá)水平顯著上升；而S164缺失后，報(bào)告基因顯著下調(diào)。其中，T82的表達(dá)水平變化最大，上調(diào)了約48%（圖6）?？梢姡@些磷酸化位點(diǎn)盡管不是NDV致命性的磷酸化位點(diǎn)，但是依然參與了NDV的生命過程。磷酸化位點(diǎn)T78和T82位于NDV P蛋白氨基末端的“結(jié)構(gòu)紊亂區(qū)”，而這一結(jié)構(gòu)存在于所有副黏病毒P蛋白中[11]。據(jù)報(bào)道，“結(jié)構(gòu)紊亂區(qū)”不具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，在不同的理化條件下會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而引起蛋白整體結(jié)構(gòu)和功能的變化。磷酸化水平的變化正是“結(jié)構(gòu)紊亂區(qū)”結(jié)構(gòu)變化的一種調(diào)節(jié)因素。因此，推測(cè)磷酸化位點(diǎn)T78和T82可能參與了“結(jié)構(gòu)紊亂區(qū)”的構(gòu)象調(diào)節(jié)以及相關(guān)的蛋白功能調(diào)控。

本研究通過LC-MS/MS質(zhì)譜和生物信息學(xué)分析，在NDV的P蛋白上篩選到了6個(gè)PKC、CKII和GSK3激酶相關(guān)的磷酸化位點(diǎn)，并且通過微型基因組系統(tǒng)證實(shí)T78、T82和S164位磷酸化位點(diǎn)影響病毒的復(fù)制，其生物學(xué)意義需要進(jìn)一步的研究。