孫桂英，趙 剛，沈 燕，徐密琴，高勝利，俞 凈,鈕志林

(蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院感染科，江蘇蘇州 215200)

結(jié)核病是因感染結(jié)核分枝桿菌(Mtb)而發(fā)生的并具有傳染性的慢性疾病，可累及全身各種器官，最為常見(jiàn)是以肺部受累形成的肺結(jié)核病。根據(jù)WHO的2016年結(jié)核病年度報(bào)告顯示[1]，肺結(jié)核病在2015年的全球新發(fā)病例高達(dá)1 040萬(wàn)例，死亡病例為140萬(wàn)例，超過(guò)HIV；同年我國(guó)新發(fā)生肺結(jié)核病91萬(wàn)例，僅次于印度(238萬(wàn)例)與印尼(102萬(wàn)例)位列全球第3位，死亡病例約3.5萬(wàn)。當(dāng)前,我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家及27個(gè)耐多藥(MDR)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一[2]。自1993年WHO宣布“全球結(jié)核病緊急狀態(tài)”以來(lái)，多個(gè)國(guó)家及地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)了1例或多例MDR結(jié)核病。全球有3.9%的新發(fā)病例和21%的復(fù)診患者患有MDR結(jié)核病[1]。結(jié)核病耐藥已成為全世界結(jié)核病疫情控制的巨大阻礙。建立有效且快速的Mtb耐藥檢測(cè)方法對(duì)臨床合理用藥及結(jié)核病疫情控制意義重大。長(zhǎng)期以來(lái)，傳統(tǒng)羅氏比例法由于操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、方便、易于推廣等因素而被廣泛應(yīng)用于Mtb藥敏試驗(yàn)，并被視為結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但該方法耗時(shí)較久，步驟繁瑣，已很難滿足當(dāng)前對(duì)MDR結(jié)核病診斷及時(shí)性的需求。伴隨著Mtb耐藥分子機(jī)制的闡明，幾種快速檢測(cè)結(jié)核病耐藥的分子藥敏檢測(cè)技術(shù)得以問(wèn)世，其中基因芯片技術(shù)日益受到重視。與此同時(shí)，近年來(lái)受耐藥率不斷升高的影響，利福平(RFP)與異煙肼(INH)這一經(jīng)典的抗結(jié)核病一線藥物組合在蘇州吳江地區(qū)的治療效果有所降低。本研究采用基因芯片技術(shù)對(duì)Mtb的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)羅氏比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)采用DNA測(cè)序驗(yàn)證，旨在探討基因芯片法對(duì)蘇州地區(qū)Mtb臨床分離株RFP與INH耐藥性快速檢測(cè)的實(shí)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年5月1日至2018年12月31日在蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院感染科發(fā)現(xiàn)的痰液標(biāo)本涂片陽(yáng)性的結(jié)核病患者。以無(wú)菌容器連續(xù)3 d采集所有患者的第1口晨痰2～5 mL并及時(shí)送檢。

1.2試劑與儀器 晶芯?系列試劑或儀器均購(gòu)自博奧生物公司，包括核酸快速提取儀(ExtractorTM 36)、芯片洗干儀(SlideWasherTM 8)、芯片雜交儀(BioMixerTM Ⅱ)、微陣列芯片掃描儀(LuxScanTM10K-B)、Mtb耐藥基因檢測(cè)試劑盒與菌種鑒定試劑盒；實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)伯樂(lè))，改良羅氏培養(yǎng)基(海博生物)，PNB與TCH菌種鑒定培養(yǎng)基。

1.3方法

1.3.1羅氏培養(yǎng)藥敏試驗(yàn) 嚴(yán)格按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[3]進(jìn)行試驗(yàn)操作。采用2倍于痰標(biāo)本量的標(biāo)本消化液進(jìn)行樣本前處理，接種至改良羅氏培養(yǎng)基后進(jìn)行恒溫(37 ℃)培養(yǎng)，觀察到陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果后即行比例法藥敏試驗(yàn)及菌種鑒定，陰性培養(yǎng)結(jié)果延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，最長(zhǎng)不超過(guò)8周。將臨床分離Mtb的初生長(zhǎng)2周菌落研磨并配成菌懸液，濃度1 mg/mL，梯度稀釋，目標(biāo)濃度分別為10-2mg/mL與10-4mg/mL，分別滿環(huán)沾取并接種至含RFP(40 μg/mL)與INH(0.2 μg/mL)的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基，同時(shí)采用PNB與TCH培養(yǎng)基鑒定菌種。所有樣本完成以上處理后均進(jìn)行恒溫(37 ℃)培養(yǎng)，4周后觀察結(jié)果。本研究以Mtb標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV為質(zhì)控菌株。

1.3.2基因芯片檢測(cè) 選擇RFP耐藥基因rpoB及INH耐藥基因katG與inhA作為本次檢測(cè)的目標(biāo)基因，檢測(cè)Mtb中以上基因啟動(dòng)子的野生型(wt)及多種突變型(mt)，具體實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)及實(shí)驗(yàn)室操作標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。(1)采用核酸快速提取儀進(jìn)行核酸提??；(2)在提取好核酸的離心管中加入PCR擴(kuò)增試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)在PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后對(duì)標(biāo)本進(jìn)行芯片雜交，擴(kuò)增產(chǎn)物按說(shuō)明書(shū)加雜交緩沖液加入芯片，放入56 ℃水浴箱2 h；(4)芯片雜交結(jié)束后，將芯片按照說(shuō)明書(shū)所配置好的洗滌液進(jìn)行洗滌，洗滌后進(jìn)行干燥；(5)采用微陣列芯片掃描儀對(duì)干燥后芯片進(jìn)行掃描，軟件讀取信號(hào)并自行判讀結(jié)果。

1.3.3DNA測(cè)序驗(yàn)證 對(duì)經(jīng)羅氏比例法檢測(cè)的Mtb陽(yáng)性菌株，進(jìn)行3個(gè)目標(biāo)基因耐藥相關(guān)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA測(cè)序，具體測(cè)序工作由博奧生物公司完成，采用第一代DNA測(cè)序技術(shù)雙脫氧鏈終止法進(jìn)行核酸測(cè)序。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)配對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行交叉制表下的χ2檢驗(yàn)分析兩種檢驗(yàn)方式是否存在差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用Kappa檢驗(yàn)分析兩種檢驗(yàn)方法的結(jié)果一致性，Kappa≥0.75為一致性良好。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)本檢測(cè)情況 本研究共納入300例痰液涂片陽(yáng)性肺結(jié)核患者的共計(jì)900份痰標(biāo)本，排除31份(3.44%)培養(yǎng)陰性及7份(0.78%)培養(yǎng)污染標(biāo)本后對(duì)862份標(biāo)本進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)與菌種鑒定。862份標(biāo)本中有4份(0.46%)藥敏試驗(yàn)失敗，5份(0.58%)菌種鑒定為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，最終有853份可用于藥敏分析。900份痰標(biāo)本中，基因芯片檢測(cè)未檢測(cè)到Mtb的有11份(1.22%),NTM9份(1.00%)，結(jié)果不能判定的有17份(1.89%)，最終有863份可用于藥敏分析。綜合藥敏試驗(yàn)與基因芯片檢測(cè)結(jié)果，最終有829份標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果可用于藥敏檢測(cè)結(jié)果的比較。

表1 基因芯片檢測(cè)Mtb RFP和INH耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)情況

注：密碼子改變一欄中的數(shù)字前后字母分別為wt與mt堿基

2.2基因芯片檢測(cè)Mtb耐藥基因相關(guān)突變位點(diǎn) 基因芯片檢出rpoB突變型菌株109株，包括單一位點(diǎn)突變108株與雙位點(diǎn)突變1株。突變頻率最高的2個(gè)位點(diǎn)分別為531位點(diǎn)[56.88%(62/109)]與526位點(diǎn)[23.85%(26/109)]?；蛐酒瑱z出katG/inhA突變型菌株162株，包括katG315單一位點(diǎn)突變112株[69.14%(112/162)]，inhA-15單一位點(diǎn)突變47株[29.01%(47/162)]，katG315位點(diǎn)與inhA啟動(dòng)子區(qū)域雙突變3株[1.85%(3/162)]。見(jiàn)表1。

表2 基因芯片與羅氏比例法檢測(cè)RFP、INH及MDR的結(jié)果比較(n)

2.3基因芯片與羅氏比例法檢測(cè)RFP、INH及MDR 基因芯片與羅氏比例法檢測(cè)RFP耐藥及MDR的效果相近(均P>0.05)，對(duì)INH耐藥的檢測(cè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2；以羅氏比例法為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)基因芯片檢測(cè)RFP、INH耐藥及MDR的評(píng)估見(jiàn)表3。

表3 基因芯片檢測(cè)RFP、INH及MDR的效果評(píng)價(jià)

注：本研究中，將對(duì)RFP與INH均耐藥定義為MDR

2.4基因芯片技術(shù)與DNA測(cè)序的對(duì)比 以DNA測(cè)序結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片檢測(cè)RFP耐藥結(jié)果不一致為4株，檢測(cè)準(zhǔn)確率為99.52%(825/829)；檢測(cè)INH耐藥結(jié)果不一致為2株，檢測(cè)準(zhǔn)確率為99.76%(827/829)，相關(guān)分離菌株檢測(cè)結(jié)果的不一致基因位點(diǎn)見(jiàn)表4。

表4 基因芯片技術(shù)與DNA測(cè)序結(jié)果對(duì)比

3 討 論

隨著全程督導(dǎo)化學(xué)治療策略的逐步開(kāi)展，我國(guó)個(gè)別地區(qū)結(jié)核病疫情開(kāi)始有所緩解，但全國(guó)總體形式嚴(yán)峻依舊，區(qū)域化流行趨勢(shì)差別仍然存在[4]。鑒于本院所屬蘇州吳江地區(qū)的RFP與INH耐藥結(jié)核病病例逐年增多的趨勢(shì)明顯，尋求一種及時(shí)、準(zhǔn)確的耐藥性檢測(cè)方法對(duì)有效控制本地區(qū)耐多藥結(jié)核病的流行與傳播具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。與傳統(tǒng)方法相比，生物芯片技術(shù)具有快速、結(jié)果可靠、重復(fù)性好、通量高、可以在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)成千基因表達(dá)的特點(diǎn)，為Mtb的實(shí)驗(yàn)室診斷開(kāi)拓了新的途徑，更滿足了當(dāng)前臨床快速檢測(cè)之需求[5]。

研究表明[6-7]，95%以上的RFP耐藥與rpoB基因變異有關(guān)。本研究選擇了幾種rpoB基因常見(jiàn)突變位點(diǎn)(511、513、516、526、531、533位點(diǎn))，考察與蘇州吳江地區(qū)RFP耐藥的相關(guān)性?；蛐酒瑱z測(cè)結(jié)果表明，本地區(qū)RFP耐藥基因rpoB的突變類型包括511(T→C)、513(A→C或C→A)、516(G→T或A→G或A→T)、526(A→G或A→T或C→G或C→T)、531(C→T或C→G)、533(T→C)等單位點(diǎn)突變以及511與516的雙位點(diǎn)突變，其中的531(C→T或C→G)與526(A→G或A→T或C→G或C→T)為主要突變類型，突變率分別為56.88%與23.85%。KatG基因315位點(diǎn)突變與inhA基因-15位點(diǎn)突變不僅普遍存在于耐藥Mtb中，同時(shí)也與INH耐藥高度相關(guān)。基因芯片檢測(cè)結(jié)果表明，本地區(qū)INH耐藥基因的主要突變類型為KatG315(G→A或G→C)，突變率達(dá)69.14%，與吉林省(68.55%)[8]相似，但與青島(44.83%)[9]及青海(75.5%)[10]等地區(qū)明顯不同，提示KatG315突變存在一定地域差異。后經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證，基因芯片檢測(cè)RFP與INH耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)不一致分別為4株與2株，檢測(cè)準(zhǔn)確率分別為99.52%與99.76%。表明本次采用基因芯片檢測(cè)Mtb RFP和INH耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)的結(jié)果是可靠的，總體提示rpoB531、526位點(diǎn)突變及katG315位點(diǎn)突變可能是促成蘇州吳江地區(qū)RFP和INH耐藥病例增多最為關(guān)鍵的分子機(jī)制。

本研究中，基因芯片與羅氏比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)RFP耐藥及MDR效果相近，對(duì)INH耐藥的檢測(cè)結(jié)果存在明顯差異，由于羅氏比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，故初步認(rèn)為基因芯片對(duì)INH耐藥檢測(cè)的一致性可能不及RFP與MDR。具體效果：以羅氏比例法為金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片檢測(cè)RFP耐藥的符合率為97.47%，靈敏度為94.90%，特異度為97.81%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為85.32%，陰性預(yù)測(cè)值為99.31%，Kappa值為0.952；檢測(cè)INH耐藥的符合率為94.45%，靈敏度為78.16%，特異度為99.84%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為99.38%，陰性預(yù)測(cè)值為93.25%，Kappa值為0.823；檢測(cè)MDR的符合率為97.83%，靈敏度為82.50%，特異度為99.47%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94.29%，陰性預(yù)測(cè)值為98.16%，Kappa值為0.927。由此可見(jiàn)，基因芯片檢測(cè)RFP耐藥及MDR的效果是值得肯定的，但檢測(cè)INH耐藥的符合率、靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值以及Kappa值均相對(duì)偏低，其中靈敏度明顯偏低，Kappa值低也進(jìn)一步印證了其與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)一致性存在一定不足。分析原因可能包括以下幾方面：(1)非基因突變的原發(fā)性耐藥造成對(duì)INH的耐藥性，現(xiàn)已探明的機(jī)制為多層Mtb胞外包被與活性多藥外排離子泵構(gòu)成了屏障機(jī)制，繼而對(duì)藥物運(yùn)輸產(chǎn)生干擾[11-12]；(2)非KatG與inhA基因(如ahpC、KasA、ndh等)的突變也與INH耐藥具有一定相關(guān)性[13]；(3)KatG與inhA基因中除本研究選擇315及-15位點(diǎn)的極少數(shù)其他位點(diǎn)突變也可能引起INH耐藥[14-15]。但總體來(lái)看，74.52%的靈敏度尚在可接受范圍，同時(shí)基于檢測(cè)的及時(shí)性優(yōu)勢(shì)，筆者認(rèn)為基因芯片在蘇州吳江地區(qū)臨床INH耐藥菌株的快速診斷價(jià)值不應(yīng)被忽視。

綜上所述，rpoB531、526位點(diǎn)突變與katG315位點(diǎn)突變可能是蘇州吳江地區(qū)Mtb產(chǎn)生RFP和INH耐藥的關(guān)鍵性分子機(jī)制，基因芯片技術(shù)能快速且高準(zhǔn)確度地檢測(cè)出以上位點(diǎn)的突變情況，值得在本地區(qū)推廣應(yīng)用于RFP和INH的耐藥性檢測(cè)。但基因芯片技術(shù)尚不能檢出所有的基因突變位點(diǎn)，本研究中其對(duì)INH耐藥的靈敏度相對(duì)偏低，提示現(xiàn)階段該技術(shù)還必然存在某些局限，但可作為傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的重要補(bǔ)充。本課題組擬在后續(xù)研究中酌情增加相關(guān)基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，以期進(jìn)一步提高本地區(qū)對(duì)RFP和INH耐藥性檢測(cè)的敏感度。