王雪，肖亞玲，孫正怡，甄璟然，郁琦，鄧成艷，周遠(yuǎn)征，王含必

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦科內(nèi)分泌與生殖中心，北京 100730)

1992年，Palermo等[1]首次將卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術(shù)應(yīng)用到輔助生殖技術(shù)(ART)領(lǐng)域，ICSI已經(jīng)成為治療男性因素不育的有效措施。在ICSI操作前，需要?jiǎng)兂涯讣?xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞，一方面顆粒細(xì)胞會(huì)阻礙注射針，干擾卵母細(xì)胞注射，另一方面去除顆粒細(xì)胞后可以清楚地評(píng)估卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂狀態(tài)。在胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)室，胚胎學(xué)家習(xí)慣性在獲卵和卵母細(xì)胞脫顆粒以及卵母細(xì)胞脫顆粒和ICSI之間等待一定的時(shí)間，原因是卵母細(xì)胞在獲卵后可能需要一定的時(shí)間來(lái)恢復(fù)。然而，對(duì)于所有操作的精確時(shí)間尚無(wú)定論。有研究認(rèn)為卵母細(xì)胞脫顆粒時(shí)間和ICSI時(shí)間對(duì)成熟卵率無(wú)影響，但是對(duì)受精率有顯著影響，認(rèn)為脫顆粒前的孵育時(shí)間越久受精率越高，但要控制在3 h內(nèi)，而脫顆粒后立即行ICSI能夠達(dá)到最優(yōu)受精率[2-3]。還有研究發(fā)現(xiàn)延遲脫顆?？梢燥@著提高優(yōu)質(zhì)囊胚形成率[4]。而有一些研究則發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞脫顆粒時(shí)間對(duì)ICSI結(jié)局無(wú)影響，認(rèn)為脫顆粒時(shí)間和ICSI時(shí)間對(duì)受精率和臨床結(jié)局的影響不大[5-6]?？紤]到這些結(jié)論的不一致性，本研究的目的是對(duì)獲卵-脫顆粒和脫顆粒-ICSI之間的時(shí)間對(duì)ICSI結(jié)局的影響進(jìn)行分析，為確定操作的最佳時(shí)間提供依據(jù)，從而進(jìn)一步改善ICSI結(jié)局。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2017年3月至2018年1月在本院輔助生殖中心進(jìn)行ICSI治療的380例患者(408個(gè)周期)的臨床資料?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：(1)男方因素不育；(2)前次IVF治療失敗史；(3)年齡<42歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并存在內(nèi)科疾病的患者，如高血壓、糖尿病、肝臟疾病、甲狀腺功能異常等；(2)存在腫瘤病史的患者；(3)存在夫妻雙方染色體異常者；(4)卵巢儲(chǔ)備功能下降(獲卵數(shù)<5個(gè))者；(5)行胚胎植入前遺傳學(xué)篩選的患者；(6)行附睪穿刺取精患者。

二、研究方法

1. 促排卵及取卵：選擇本中心常規(guī)的促排卵方案，包括激動(dòng)劑長(zhǎng)方案和拮抗劑方案，使用卵泡刺激素(FSH，果納芬，默克雪蘭諾，瑞士)進(jìn)行卵巢刺激。當(dāng)有3個(gè)卵泡直徑達(dá)到18～20 mm時(shí)注射HCG(艾澤，250 μg/支，Serono，瑞士)250 μg，此后38 h經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵。

2. 脫顆粒細(xì)胞及ICSI操作：按照本實(shí)驗(yàn)室的工作常規(guī)，將獲得的卵母細(xì)胞放入受精液(G-IVF Plus，Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)一段時(shí)間，再將其放入透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，80 U/ml，Vitrolife，瑞典)中消化片刻，時(shí)間控制在30 s內(nèi)，然后將其吸出放入受精液中，用不同孔徑的毛細(xì)管不斷吹打，直至完全去除顆粒細(xì)胞。將拆除顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，準(zhǔn)備進(jìn)行ICSI。每次操作前記錄時(shí)間。進(jìn)行ICSI操作前，在7%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Vitrolife，瑞典)液滴中選擇形態(tài)正常、活動(dòng)力好的精子進(jìn)行制動(dòng)，然后將卵母細(xì)胞放置培養(yǎng)液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)中，進(jìn)行ICSI操作。單精子注射時(shí)，用固定針將卵母細(xì)胞固定，并將極體放置12點(diǎn)位置，注射針從3點(diǎn)位置進(jìn)入，回吸，確認(rèn)卵母細(xì)胞膜破裂后將精子注入卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)，緩慢退出注射針。將注射完的卵母細(xì)胞用卵裂期培養(yǎng)液(G1，Vitrolife，瑞典)充分沖洗，并放置提前配置好的G1培養(yǎng)液中，放入37℃、6%CO2、5%O2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

3. 胚胎的觀察和評(píng)估：ICSI后的16～18 h(受精后第1天)觀察卵母細(xì)胞的受精情況，并換液，繼續(xù)用卵裂期培養(yǎng)基培養(yǎng)，第3天觀察卵裂球的分裂情況，根據(jù)胚胎卵裂球數(shù)目、細(xì)胞質(zhì)均一性、碎片多少等進(jìn)行胚胎評(píng)分，我們將卵裂球數(shù)目為6或8，評(píng)級(jí)為Ⅰ或Ⅱ的胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎。在移植日挑選質(zhì)量最好的2枚胚胎進(jìn)行移植，其他胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液(G2，Vitrolife，瑞典)中繼續(xù)培養(yǎng)。如果移植當(dāng)日因特殊情況不能移植者，將此兩枚胚胎冷凍保存或繼續(xù)培養(yǎng)。在受精后第5日或第6日觀察囊胚形成情況，并根據(jù)Gardner評(píng)分法[7]進(jìn)行評(píng)分，挑選內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量達(dá)到A或B級(jí)的囊胚進(jìn)行冷凍，C級(jí)的囊胚放棄，滋養(yǎng)細(xì)胞層的質(zhì)量不限。具體的冷凍操作方法按照本中心常規(guī)進(jìn)行。

4. 妊娠結(jié)局的判斷及觀察指標(biāo)：移植后第7日檢測(cè)血清HCG水平，HCG>5 U/L判斷為生化妊娠；移植后4周行超聲檢查，超聲下可見胎心及胎囊者判斷為臨床妊娠。受精率=正常受精數(shù)/MⅡ卵母細(xì)胞數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂數(shù)×100%；囊胚形成率=囊胚數(shù)/(卵裂數(shù)-移植數(shù)-卵裂期冷凍數(shù))×100%；種植率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/移植周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=隨訪獲得活產(chǎn)的總例數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

5. 分組標(biāo)準(zhǔn)：取卵至脫顆粒的時(shí)間定義為T1，脫顆粒至ICSI的時(shí)間定義為T2，取卵至ICSI的時(shí)間定義為T3(具體示意見圖1)。本研究中T1平均值為(0.56±0.30)h(0.08～1.92 h)，因此將患者分為3組，分別為A1組≤0.5 h，B1組0.5～1.0 h，C1組≥1 h。T2的平均值為(2.13±0.87)h(0.33～6.05 h)，據(jù)此將患者分為3組：A2組≤2 h，B2組2～3 h，C2組>3 h。T3的均值為(2.69±0.87)h(0.67～6.77 h)，亦將患者分為3組：A3組≤2.5 h，B3組2.5～3.5 h，C3組>3.5 h。

圖1 T1和T2的定義示意圖

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

本研究共納入380例患者(408個(gè)ICSI周期)的資料，平均年齡(34.7±4.1)歲。共移植350個(gè)周期，超聲下見到妊娠囊182個(gè)，種植率為25.4%(182/717)，145例患者獲得臨床妊娠，臨床妊娠率為41.4%(145/350)，妊娠后流產(chǎn)30例，流產(chǎn)率為20.7%(30/145)，宮外孕發(fā)生率為0.29%(1/350)，活產(chǎn)率為32.0%(112/350)。

二、不同組別間胚胎發(fā)育情況及妊娠結(jié)局比較

1.取卵-脫顆粒時(shí)間對(duì)胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響：不同T1時(shí)間的3組中的年齡、不育年限、FSH應(yīng)用總劑量及拮抗劑方案比例比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)；3組間的受精率、優(yōu)胚率、囊胚形成率、種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)(表2)。

2.脫顆粒-ICSI時(shí)間對(duì)胚胎及妊娠結(jié)局的影響：不同T2時(shí)間的3組間年齡、不育年限及FSH應(yīng)用總劑量比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，3組間的拮抗劑方案比例比較亦無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。3組間的受精率比較有顯著性差異，C2組顯著高于A2組和B2組(P<0.05)；囊胚形成率3組間比較亦有顯著性差異，C2組顯著高于A2組(P<0.05)；3組間的優(yōu)胚率、種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率及活產(chǎn)率比較均無(wú)顯著性差異(P均>0.05)，但B2組的種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率有略高于其他兩組的趨勢(shì)(表4)。

表1 不同T1三組間一般情況的比較[(-±s)，%]

表2 不同T1三組間胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局比較(%)

表3 不同T2三組間一般情況的比較[(-±s)，%]

表4 不同T2三組間胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局比較(%)

3.取卵-ICSI時(shí)間對(duì)胚胎及妊娠結(jié)局的影響：3組間的年齡、不育年限及FSH應(yīng)用總劑量比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，3組間的拮抗劑方案比例比較亦無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表5)。3組間的受精率比較有顯著性差異，C3組顯著高于A3組和B3組(P<0.05)；3組間的囊胚形成率比較無(wú)顯著性差異，C3組有略高于A3和B3組的趨勢(shì)(P>0.05)；3組間的優(yōu)胚率、種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率及活產(chǎn)率比較均無(wú)顯著性差異(P均>0.05)，但B3組的種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率有略高于其他兩組的趨勢(shì)(表6)。

表5 不同T3三組間一般情況的比較[(-±s)，%]

表6 不同T3三組間胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局比較(%)

討 論

目前ICSI操作技術(shù)已經(jīng)日趨成熟，但是脫顆粒時(shí)間和顯微注射時(shí)間對(duì)ICSI結(jié)局的影響一直存在爭(zhēng)議。早期的研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)延長(zhǎng)取卵后脫顆粒前的時(shí)間有利于卵母細(xì)胞胞漿和胞核的成熟，推薦獲卵后2 h后再進(jìn)行脫顆粒，從而使ICSI結(jié)局最優(yōu)[2，3，8]。但也有一些研究認(rèn)為脫顆粒時(shí)間對(duì)ICSI結(jié)局無(wú)影響[5-6]。目前，對(duì)于所有操作的精確時(shí)間尚無(wú)確切定論。本研究的目的是分析脫顆粒細(xì)胞時(shí)間(T1)和ICSI時(shí)間(T2)對(duì)胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的影響。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在獲卵后0.08～1.92 h內(nèi)進(jìn)行脫顆粒不會(huì)影響ICSI的結(jié)局。過(guò)早的拆卵(≤0.5 h)和延遲拆卵(≥1 h)對(duì)胚胎的發(fā)育潛能沒有明顯影響，3組的優(yōu)胚率、囊胚形成率和種植率相似；對(duì)臨床結(jié)局也沒有明顯影響，3組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率相似。這與之前的一些研究結(jié)論是相似的，認(rèn)為在ICSI前延遲脫顆粒細(xì)胞不會(huì)提高ICSI結(jié)局[6，9]。在2016年Bárcena等[6]的研究中納入近4 000個(gè)ICSI周期，他們發(fā)現(xiàn)獲卵與脫顆粒之間的時(shí)間與ICSI結(jié)局無(wú)顯著關(guān)系，他們認(rèn)為高質(zhì)量的卵母細(xì)胞體外承受能力更強(qiáng)，更耐受體外的各種操作，而不影響臨床結(jié)局。最近Naji等[9]進(jìn)行了一項(xiàng)研究，納入2 051個(gè)非供卵的ICSI周期，根據(jù)取卵至脫顆粒的時(shí)間分為兩組，發(fā)現(xiàn)脫顆粒時(shí)間在2 h以內(nèi)或以上的兩組的受精率、種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率比較無(wú)顯著性差異；在第一組中他們又進(jìn)一步分為脫顆粒時(shí)間在30 min以內(nèi)和30～119 min的兩組，同樣發(fā)現(xiàn)兩亞組的數(shù)據(jù)也無(wú)顯著性差異。然而我們的研究結(jié)論也與之前的一些研究相反，即他們認(rèn)為在脫顆粒之前，將卵母細(xì)胞培養(yǎng)2 h以上可以提高受精率和胚胎質(zhì)量，改善妊娠結(jié)局[2]。Mizuno等[4]發(fā)現(xiàn)，取卵后立即脫顆粒細(xì)胞組與2 h脫顆粒細(xì)胞組的受精率、囊胚形成率、妊娠率及活產(chǎn)率比較無(wú)顯著性差異，但是2 h脫顆粒細(xì)胞組的優(yōu)質(zhì)囊胚率顯著高于立即脫顆粒細(xì)胞組(P<0.05)，認(rèn)為在ICSI之前保持完整的顆粒細(xì)胞有利于卵母細(xì)胞的成熟和后續(xù)胚胎發(fā)育。分析本研究與其他研究的差異，可能存在以下幾點(diǎn)原因：首先，由于本實(shí)驗(yàn)室的工作安排，我們的脫顆粒時(shí)間為0.08～1.92 h，最高不超過(guò)2 h，因此未能評(píng)估脫顆粒時(shí)間超過(guò)2 h的情況；對(duì)于0.08～1.92 h內(nèi)脫顆粒者，本研究提示取卵-脫顆粒時(shí)間短者的種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率略高于脫顆粒時(shí)間久者，盡管3組間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。最近關(guān)于鼠類的研究提示，有完整顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞延長(zhǎng)培養(yǎng)后會(huì)誘導(dǎo)卵母細(xì)胞出現(xiàn)凋亡改變，促進(jìn)卵母細(xì)胞老化，從而影響胚胎質(zhì)量和臨床結(jié)局，建議在取卵后立即進(jìn)行脫顆粒[10-11]。其次，很多研究是在HCG后(36.5±0.5)h進(jìn)行取卵[2，6，12]，而本研究是在HCG后38 h取卵，相當(dāng)于上述研究的卵母細(xì)胞取出后在體外培養(yǎng)2 h后，似乎我們的取卵-脫顆粒時(shí)間較短，實(shí)際上距離HCG的時(shí)間并不短，卵母細(xì)胞的成熟度相對(duì)較好。因此，本研究認(rèn)為取卵至脫顆粒的時(shí)間對(duì)胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的影響并不顯著。

脫顆粒后應(yīng)該立即進(jìn)行ICSI操作還是應(yīng)該放置一段時(shí)間一直存在爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為脫顆粒時(shí)間至ICSI時(shí)間的長(zhǎng)短與ICSI結(jié)局無(wú)關(guān)[13]。Garor等[5]在脫顆粒后5 min～5.2 h進(jìn)行ICSI操作，以≤1 h和>1 h分為兩組，發(fā)現(xiàn)兩組的受精率和妊娠率相似。認(rèn)為ICSI之前延長(zhǎng)卵母細(xì)胞的孵育時(shí)間并不能提高卵母細(xì)胞的發(fā)育程度，也不能改善妊娠結(jié)局。但也有研究發(fā)現(xiàn)脫顆粒后立即行ICSI能夠獲得較好的結(jié)局。Patrat等[2]研究發(fā)現(xiàn)脫顆粒至ICSI注射時(shí)間與受精率成負(fù)相關(guān)，隨著脫顆粒至ICSI注射時(shí)間的延長(zhǎng)，受精率逐漸下降，因此建議在脫顆粒后立即進(jìn)行精子注射。最近Pujol等[12]進(jìn)行了一項(xiàng)多因素的分析發(fā)現(xiàn)脫顆粒時(shí)間(0.5～2 h)對(duì)妊娠結(jié)局無(wú)影響，但是脫顆粒-ICSI時(shí)間每增加1 h，生化妊娠率和臨床妊娠率分別降低7.5%和7.9%，而對(duì)繼續(xù)妊娠率和活產(chǎn)率沒有影響，也建議在脫顆粒后立即行ICSI操作。在本研究中，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的工作安排，我們的T2時(shí)間為0.33～6.05 h，其中脫顆粒后短時(shí)間內(nèi)(<1 h)行ICSI的僅10例，所以我們按照T2的平均時(shí)間(2 h)進(jìn)行分組，我們發(fā)現(xiàn)C2組(>3 h)的受精率顯著高于A2和B2組，C2組的囊胚形成率顯著高于A2組(P<0.05)；而B2組的種植率、妊娠率及活產(chǎn)率略高于其他兩組，但3組間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。另外本研究還對(duì)取卵和ICSI之間的時(shí)間進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)T3超過(guò)3.5 h時(shí)(C3組)的受精率最好；盡管3組間尚無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但B3組的妊娠率及活產(chǎn)率有略高于其他兩組的趨勢(shì)。這與上述以脫顆粒為節(jié)點(diǎn)進(jìn)行的研究結(jié)論相一致，與Bárcena等[6]的研究結(jié)論也相似，他們認(rèn)為不管是新鮮周期還是復(fù)蘇卵母細(xì)胞周期，取卵至ICSI的時(shí)間對(duì)妊娠率和活產(chǎn)率均無(wú)顯著影響。這可能是因?yàn)樵诿擃w粒操作中，由于透明質(zhì)酸酶的化學(xué)損傷和吸管吹吸的機(jī)械損傷，導(dǎo)致卵母細(xì)胞膜受損或卵母細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器受到擠壓，因此，脫顆粒后給予卵母細(xì)胞一段恢復(fù)時(shí)間后再進(jìn)行ICSI比較合理。且ICSI前對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行適度時(shí)間的孵化可能促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)的成熟，更有利于卵母細(xì)胞的全面激活和后續(xù)正常發(fā)育，可能增加受精率。然而脫顆粒后的孵化時(shí)間不宜過(guò)久，否則會(huì)造成卵母細(xì)胞老化，卵母細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，基因表達(dá)改變，紡錘體異常的發(fā)生率增加[14-16]，從而影響后續(xù)胚胎發(fā)育。本研究中>3 h的患者例數(shù)相對(duì)較少，可能會(huì)存在一定偏倚。

本研究對(duì)臨床和實(shí)驗(yàn)室工作具有較重要的意義。對(duì)于極度繁忙的IVF中心，尤其是需要下午取卵的中心，如果能夠縮短取卵至ICSI之間的時(shí)間而又不影響ICSI結(jié)局，可以避免實(shí)驗(yàn)室從業(yè)人員工作時(shí)間的顯著延長(zhǎng)，提高實(shí)驗(yàn)室工作效率，從而降低ICSI周期的總體成本[17]。本研究認(rèn)為獲卵后脫顆粒時(shí)間對(duì)ICSI結(jié)局的影響并不顯著，脫顆粒后孵育2～3 h再進(jìn)行ICSI的效果可能更好，但尚未表現(xiàn)出顯著性差異，因此具體操作時(shí)間還有待于進(jìn)一步研究。當(dāng)然，本研究的樣本量有限，后續(xù)還需要進(jìn)行前瞻性的隨機(jī)對(duì)照研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。