吳山強(qiáng)，李小冬，陳培芳，葉岳，吳建蘭，謝予揚(yáng)

(廣西醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院生殖中心，梧州 543000)

近年來隨著我國不孕不育人群的不斷增多，越來越多的人需要接受輔助生殖技術(shù)(ART)助孕，獲取更多的優(yōu)質(zhì)胚胎是不孕不育人群成功妊娠的基礎(chǔ)[1]。保證卵母細(xì)胞受精質(zhì)量，優(yōu)化體外培養(yǎng)條件成為胚胎培養(yǎng)成功的重要因素，尤其是新建的人類ART胚胎實(shí)驗(yàn)室，需要經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制才能將其運(yùn)用于人類配子及胚胎的處理[2]。目前鼠胚實(shí)驗(yàn)(mouse embryo assay，MEA)是最常用的ART胚胎實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)，通過鼠胚實(shí)驗(yàn)檢測實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)體系是否達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)控要求[3]。我院生殖中心新建胚胎實(shí)驗(yàn)室建成于2015年3月，經(jīng)過前期充分的通風(fēng)和層流換氣、升溫并去除揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOC)等[4]處理后，于2018年1～10月利用昆明小白鼠進(jìn)行體外受精胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察當(dāng)日配皿與前日配皿兩組實(shí)驗(yàn)的受精率、卵裂率和2C囊胚形成率，對不同受精液平衡方式處理的小鼠卵母細(xì)胞體外受精及胚胎發(fā)育過程進(jìn)行評價，從而為后期開展人類輔助生殖技術(shù)中卵子的體外受精及胚胎培養(yǎng)尋求最佳培養(yǎng)液平衡方案的選擇提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

資料與方法

一、研究對象

SPF級昆明小白鼠購自于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，雌鼠4～10周齡，共204只；雄鼠6～12周齡，共100只。SPF級小鼠繁殖飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1～2周，晝夜光照為每日8∶00開燈，20∶00關(guān)燈，溫度18～26℃，相對濕度40%～70%。對同一批次雌鼠統(tǒng)一超促排卵后按照隨機(jī)原則分為當(dāng)日配皿組與前日配皿組進(jìn)行鼠胚實(shí)驗(yàn)。

二、主要試劑及儀器

孕馬血清促性腺激素(PMSG)和絨毛膜促性腺激素(HCG)購自杭州第二激素制藥廠；培養(yǎng)體系選擇Quinn’s系列培養(yǎng)液(購自美國SAGE公司)；石蠟盤，滅菌動物解剖工具；Falcon培養(yǎng)皿、移液管、離心管、滅菌巴氏吸管等為美國BD公司Falcon系列；丹麥IVFtech工作站，蔡司體視顯微鏡，奧林巴斯倒置顯微鏡；日本Panasonic CO2培養(yǎng)箱和ASTEC三氣培養(yǎng)箱等。

三、研究方法

1. 當(dāng)日配皿組中授精皿的制備：授精前1日16∶00在含9 ml Quinn’s 1020液的Falcon2001管中添加1 ml血清蛋白代用品(SPS)，10 ml移液管輕輕吹打5次混勻后松開蓋子置于37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜平衡。授精當(dāng)日8∶00取出過夜平衡的含10%SPS的Quinn’s 1020液1 ml，在Falcon3037皿中小心添加1 ml后立即覆蓋0.8 ml培養(yǎng)油，放回37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱待當(dāng)日授精用。

2.前日配皿組中授精皿的制備：授精前1日16∶00在含9 ml Quinn’s 1020液的Falcon2001管中添加1 ml SPS，10 ml移液管輕輕吹打5次混勻，在Falcon3037皿中小心添加1 ml含10%SPS的Quinn’s 1020液后立即覆蓋0.8 ml培養(yǎng)油，放回37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱待次日授精用。

3.卵裂期培養(yǎng)皿的制備：當(dāng)日配皿組與前日配皿組均于授精前1日16∶30在Falcon3001皿中做30～50 μl含10%SPS的Quinn’s 1026液微滴，立即覆蓋2.5 ml培養(yǎng)油，放回37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱過夜平衡后待次日行卵裂期胚胎培養(yǎng)用。

4.囊胚期培養(yǎng)皿的制備：授精當(dāng)天記為Day0(D0)，則D2 16∶00在Falcon3001皿中做30～50 μl含10%SPS的Quinn’s 1029液微滴，立即覆蓋2.5 ml培養(yǎng)油，放回37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱過夜平衡后待次日行囊胚培養(yǎng)用。

5.小鼠卵母細(xì)胞的獲?。哼x6～10周齡雌鼠進(jìn)行超促排卵，于17∶30腹腔注射PMSG 10 U，48 h后腹腔注射HCG 10 U，次日早9∶30頸椎脫臼法處死，75%酒精消毒腹部后解剖取其輸卵管，用含10%SPS的HEPS-緩沖HTF操作液Quinn’s 1023將多余的血液和脂肪去掉，在體視顯微鏡下用1 ml無菌注射器劃破膨大壺腹部，滅菌的巴氏吸管將鼠卵于過夜平衡的含10%SPS的Quinn’s 1020中吹洗3次，隨機(jī)轉(zhuǎn)至當(dāng)日配皿組與前日配皿組的Falcon3037授精皿中，置37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。

6.小鼠精子的獲取：選8～12周齡雄鼠用頸椎脫臼法處死，75%酒精消毒腹部后解剖取其附睪下段及輸精管中上段，用含10%SPS的HEPS-緩沖HTF操作液Quinn’s 1023將多余的血液和脂肪去掉，在含10%SPS的Quinn’s 1020液中用1 ml無菌注射器在體視顯微鏡下刺破附睪下端并擠出輸精管中精子，置37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱上游30 min～1 h，用40%與80%密度梯度液做非連續(xù)密度梯度離心，300g離心8～15 min，去上清；加入0.5～1.0 ml含10%SPS的Quinn’s 1020液，吹打混勻后300g離心5 min，去上清；留約0.2 ml沉淀物，再次加入0.5 ml含10%SPS的Quinn’s 1020液吹打混勻，置37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱，待授精用。

7.體外受精：卵母細(xì)胞在37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，將調(diào)好的精子用無菌巴氏吸管在遠(yuǎn)離卵母細(xì)胞的地方按照1～3×106/ml的終濃度輕緩注入精子，完成當(dāng)日配皿組與前日配皿組授精。放回37℃、5% CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h。取出Falcon3037授精皿，體視顯微鏡下將卵母細(xì)胞撈出，轉(zhuǎn)移至已過夜平衡的卵裂期培養(yǎng)皿，在倒置顯微鏡下觀察受精情況并記錄。

8.胚胎發(fā)育的觀察(圖1)：授精日記為D0、D1至D3早8∶00～9∶00觀察胚胎發(fā)育情況并記錄。D3觀察結(jié)束后將卵裂的胚胎轉(zhuǎn)至已過夜平衡的囊胚期培養(yǎng)皿，D5觀察囊胚情況并記錄。

A：劃破輸卵管壺腹部流出的小鼠卵泡團(tuán)；B：受精卵；C：2細(xì)胞鼠胚；D：4細(xì)胞鼠胚；E：8細(xì)胞鼠胚；F：小鼠囊胚圖1 小鼠卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育過程(×10)

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、當(dāng)日配皿組小鼠體外受精胚胎發(fā)育情況

當(dāng)日配皿組共完成124個促排周期，總獲卵數(shù)為4 731枚，受精率為68.2%(3 227/4 731)，卵裂率為97.7%(3 152/3 227)，囊胚率為76.7%(2 419/3 152)，詳見表1。

二、前日配皿組小鼠體外受精胚胎發(fā)育情況

前日配皿組共完成80例促排周期，總獲卵數(shù)為2 683枚，受精率為84.5%(2 266/2 683)，卵裂率為99.6%(2 258/2 266)，囊胚率為88.8%(2 005/2 258)，見表2。

三、不同受精培養(yǎng)液平衡方式對小鼠體外受精及胚胎發(fā)育的影響

當(dāng)日配皿組每促排周期獲卵數(shù)為(38.7±8.4)枚，前日配皿組每促排周期獲卵數(shù)為(35.1±6.4)枚，兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)。當(dāng)日配皿組的受精率、卵裂率和囊胚率分別為68.2%、97.7%和76.7%，均顯著低于前日配皿組的受精率、卵裂率和囊胚率(分別為84.5%、99.6%和88.8%)(P<0.01)，見表3。

表1 當(dāng)日配皿組小鼠體外受精胚胎發(fā)育情況

表2 前日配皿組小鼠體外受精胚胎發(fā)育情況

表3 不同受精培養(yǎng)液平衡方式對小鼠體外受精及胚胎發(fā)育的比較[(-±s)，%]

討 論

培養(yǎng)液的平衡對卵母細(xì)胞、胚胎的體外培養(yǎng)產(chǎn)生很大的影響，其中尤其是PH與滲透壓的改變影響最為明顯[5]。PH受培養(yǎng)箱中CO2濃度的影響，當(dāng)培養(yǎng)液從培養(yǎng)箱中取出后，大氣中CO2濃度的降低使得受精液中的PH緩沖系統(tǒng)發(fā)生改變[6-7]，而早期的胚胎發(fā)育對PH的波動尤為敏感，同時加上培養(yǎng)液滲透壓的不穩(wěn)定性等因素，更容易給胚胎發(fā)育帶來極為不利的影響[8-11]。

為了對新建的人類ART胚胎實(shí)驗(yàn)室中人類卵母細(xì)胞受精液的配制及平衡方式進(jìn)行前期試驗(yàn)，本研究在配制含10%SPS的Quinn’s 1020培養(yǎng)液后按照先過夜平衡后配皿(當(dāng)日配皿)與立即配皿再過夜平衡(前日配皿)分為兩組進(jìn)行鼠胚實(shí)驗(yàn)，觀察含10%SPS的Quinn’s 1020受精液不同的平衡方式對卵母細(xì)胞體外受精及胚胎發(fā)育的影響。研究結(jié)果顯示不同的受精液平衡方式對卵母細(xì)胞體外受精及胚胎發(fā)育具有明顯影響，當(dāng)日配皿組的受精率、卵裂率和囊胚率分別為68.2%(3 227/4 731)、97.7%(3 152/3 227)和76.7%(2 419/3 152)均顯著低于前日配皿組的受精率、卵裂率和囊胚率[分別為84.5%(2 266/2 683)、99.6%(2 258/2 266)、88.8%(2 005/2 258)](P<0.01)。我們認(rèn)為這可能與當(dāng)日配皿組的受精液雖然在培養(yǎng)箱中平衡過夜，然而次日在配皿過程中，哪怕極短時間內(nèi)，在缺乏培養(yǎng)油的保護(hù)作用下，受精液中的CO2很快逸出，導(dǎo)致PH的波動以及滲透壓的改變。通過兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明受精液的平衡過程應(yīng)該采取配液后立即配皿，利用培養(yǎng)油覆蓋受精微滴，然后再過夜平衡，這種受精液平衡方式更適合于卵母細(xì)胞的體外受精及后期的胚胎發(fā)育。因此建議在人類ART的應(yīng)用過程中，對受精皿的制備采用配皿過夜平衡16～18 h后再使用。有動物實(shí)驗(yàn)證明過短的平衡時間會對卵母細(xì)胞的受精以及后期的胚胎發(fā)育帶來不利影響[11]。同時，培養(yǎng)油覆蓋受精液可以給胚胎更加穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，但無論何種情況下培養(yǎng)皿都不應(yīng)過久的在脫離培養(yǎng)箱環(huán)境下進(jìn)行操作[12]，在撿卵、授精以及胚胎發(fā)育觀察過程中，應(yīng)盡快結(jié)束操作，減少PH、滲透壓以及溫度等的波動對卵母細(xì)胞及胚胎帶來的不利影響[13-15]。

綜上所述，胚胎實(shí)驗(yàn)室內(nèi)受精液的平衡方式對昆明小白鼠卵母細(xì)胞的受精及胚胎發(fā)育可產(chǎn)生顯著影響。本研究明確了卵母細(xì)胞和胚胎培養(yǎng)皿的配制方式，同時也提示將來在人類胚胎實(shí)驗(yàn)室中，應(yīng)該在配備溫度計等的基礎(chǔ)上增加PH與滲透壓檢測儀，并將胚胎培養(yǎng)液的PH與滲透壓納入實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制中，探求不同培養(yǎng)液最佳的PH，這會給配子及胚胎提供一個更加安全、穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，以期給更多的不孕不育患者提供更加優(yōu)質(zhì)的胚胎，令患者在不斷發(fā)展的輔助生殖技術(shù)中受益。本研究驗(yàn)證了當(dāng)?shù)匦碌纳持行呐咛?shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制，為桂東南地區(qū)人類ART技術(shù)的開展奠定了研究基礎(chǔ)。