朱秀之，陳 力，紀 磊，高 雨，王中華

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，上海市乳腺腫瘤重點實驗室，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一類雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）均陰性的乳腺癌亞型。目前TNBC缺乏特異性的治療靶點，相較于其他亞型，其遠處復發(fā)風險較高，預后較差［1-2］。國內(nèi)外針對TNBC基因表達譜差異已鑒定出不同的亞群［3-4］。在中國，Liu等［5］采用人轉(zhuǎn)錄組芯片技術(shù)，將TNBC分為免疫調(diào)節(jié)亞型（immunomodulatory subtype，IM）、腔內(nèi)雄激素受體亞型（luminal androgen receptor subtype，LAR）、間充質(zhì)樣亞型（mesenchymal-like subtype，MES）和基底樣及免疫抑制亞型（basal-like and immune suppressed subtype，BLIS）4個分型。分子譜研究揭示了TNBC的分子異質(zhì)性，強調(diào)尋找靶向治療生物標志物的重要性。

哺乳動物中細胞周期分G1、S、G2、M期共4期。細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）在細胞周期進程中發(fā)揮重要作用。其中，CDK4/6活化調(diào)控G1期到S期的轉(zhuǎn)變［6］。CDK作為細胞周期調(diào)控機制的核心部分，是各種惡性腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中所必需的，以其為作用靶點的CDK抑制劑是近年來研究抗腫瘤藥物的熱點。

靶向細胞周期治療的CDK4/6抑制劑對ER陽性的晚期乳腺癌患者療效顯著［7］，有望為TNBC患者提供新的治療方向。但是由于缺乏統(tǒng)一的靶向患者篩選標準和療效評價因子，迄今為止，CDK4/6抑制劑在TNBC患者中的療效并不確切。本文總結(jié)TNBC中CDK4/6抑制劑的作用機制及可能相關(guān)的聯(lián)系通路，在基礎(chǔ)實驗水平和臨床試驗水平，對藥物聯(lián)合治療及療效評價分子進行綜述，旨在探討CDK4/6抑制劑在TNBC治療中的應用前景及優(yōu)化手段。

1 CDK4/6抑制劑

1.1 CDK4/6在細胞周期調(diào)節(jié)中的信號通路

細胞有絲分裂周期是一個高度協(xié)調(diào)的過程，關(guān)鍵取決于細胞周期檢查點控制［8］。CDK4/6是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調(diào)控著G1期關(guān)鍵檢查點，在乳腺癌細胞中磷酸化結(jié)合相應的細胞周期蛋白，形成的cyclin D-CDK4/6復合體介導視網(wǎng)膜母細胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白磷酸化，引發(fā)Rb蛋白結(jié)構(gòu)改變，繼而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F。E2F結(jié)合于DNA并促進G1期到S期進程的關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄和增殖蛋白的合成釋放，啟動DNA復制［9］。

Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb-E2F信號通路受多方面聯(lián)合調(diào)控。根據(jù)細胞類型的不同，cyclin D可以是cyclin D1、D2或D3。Cyclin D的正確合成和定位影響CDK4/6的活性［10］。此外，CDK抑制因子2（CDK inhibitor 2，CDKN2）基因家族（如CDKN2A、CDKN2B）編碼產(chǎn)生CDK4/6抑制因子INK4家族（如p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d），競爭性結(jié)合CDK并抑制cyclin D-CDK4/6復合物的形成［11］。Rb蛋白被CDK4/6在多個位點磷酸化，可聯(lián)合其他Rb家族成員p107和p130共同抑制細胞在G1早期的擴增。該通路持續(xù)激活的原因主要包括CDK4/6的富集、cyclin D1編碼基因CCND1的擴增及p16INK4A基因的缺失等。

1.2 CDK4/6抑制劑在乳腺癌中的應用

目前數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌中cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb-E2F軸異常調(diào)節(jié)廣泛存在，并且可能是乳腺癌發(fā)生的早期步驟［12］，包括cyclin D1的富集、抑制劑p16的缺失、Rb蛋白磷酸化水平的提高等。有研究顯示，在激素受體（hormone receptor，HR）陽性的乳腺癌中，29%～58%存在cyclin D1過表達或擴增，14%～25%存在CDK4過表達；在BLIS中發(fā)現(xiàn)CDKN2A的高表達和細胞周期蛋白E1的富集。另外，Rb的低表達、丟失和突變也更常見于BLIS［13］。在乳腺癌、非小細胞肺癌等［14］多種惡性腫瘤中均觀察到了p16INK4A基因的缺失以及CCND1、CDK4、CDK6基因的擴增。此外，CDK4/6抑制劑還可能會激發(fā)免疫及阻斷TNBC細胞的遠處轉(zhuǎn)移（肝、肺）［15］。

第一代CDK抑制劑flavopiridol（alvociclib）由于缺乏特異性，呈現(xiàn)出大劑量限制性毒性。對于進展性TNBC患者的UCN-01Ⅱ期臨床試驗，療效依舊令人失望而未能成功應用于臨床［16］。新一代的CDK4/6抑制劑經(jīng)過改造以后，具有一定的特異性和可以耐受的不良反應，典型代表有palbociclib、ribociclib、abemaciclib等，目前多種CDK4/6抑制劑臨床試驗正在進行。2015年2月美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）根據(jù)PALOMA1［17］Ⅱ期研究批準palbociclib聯(lián)合來曲唑一線治療絕經(jīng)后HR+/HER2-的晚期乳腺癌；此后又根據(jù)PALOMA3研究［18］批準palbociclib聯(lián)合氟維司群治療絕經(jīng)后既往內(nèi)分泌治療失敗的ER+/HER2-晚期乳腺癌。Abemaciclib于2017年9月正式獲得美國FDA批準上市［19］。

2 CDK4/6抑制劑治療TNBC的基礎(chǔ)研究

TNBC作為一種異質(zhì)性的疾病，其內(nèi)在豐富的生物學特性決定了對CDK4/6抑制劑的不同療效。研究發(fā)現(xiàn)部分TNBC細胞株對palbociclib表現(xiàn)出一定程度的敏感性，甚至表現(xiàn)為明顯的生長抑制，更有研究表明palbociclib療效與ER或HER2的狀態(tài)無直接相關(guān)［20］。

2.1 CDK4/6抑制劑對TNBC的選擇性作用

以往研究發(fā)現(xiàn)，Rb基因高表達的TNBC細胞株對CDK4/6抑制劑palbociclib敏感并阻滯于G1期，Rb基因突變或低表達的TNBC細胞株則觀察不到細胞周期阻滯現(xiàn)象［21］。Liu等［22］在TNBC研究中也證明在palbociclib治療中，Rb與雄激素受體（androgen receptor，AR）表達狀態(tài)都是不可或缺的。隨后的臨床回顧性研究也發(fā)現(xiàn)TNBC患者AR/Rb雙強表達與總生存率顯著相關(guān)，提出AR/Rb雙陽性的TNBC患者適合palbociclib治療。然而現(xiàn)有研究缺乏完整的臨床數(shù)據(jù)來支持Rb和AR之間可能的相關(guān)性，關(guān)于AR和Rb在TNBC中的具體作用機制還不清楚，需要更深入研究來探討兩者的生物學聯(lián)系。

Asghar等［23］用palbociclib作用于12個Rb基因野生型的TNBC細胞系，發(fā)現(xiàn)TNBC中LAR對CDK4/6抑制劑表現(xiàn)出高度敏感性。Palbociclib敏感的LAR癌細胞通常在有絲分裂后進入CDK2低表達的靜止狀態(tài)，需要CDK4/6磷酸化Rb才可以通過細胞周期限制點［6］；相反，部分基底樣TNBC細胞經(jīng)常進入CDK2高表達的增殖狀態(tài)，不需要CDK4/6繞過該限制點，分裂時間更短，因此對palbociclib治療具有耐藥性。以往研究已經(jīng)證明細胞周期蛋白E在促進CDK2高表達的同時，結(jié)合并激活CDK2，形成的復合物對CDK4/6抑制劑抵抗［24］，這在一定程度上解釋了基底樣和潛在的許多其他TNBC類型對CDK4/6抑制具有的耐藥性，也表明細胞周期蛋白E在RNA或蛋白水平上的表達有可能作為乳腺癌中CDK4/6耐藥的預測生物標志物。

2.2 CDK4/6抑制劑聯(lián)合抗雄激素治療TNBC

恩雜魯胺（enzalutamide）是第二代AR拮抗劑，相較第一代，對AR親和力更高［25］，已被美國FDA批準用于治療晚期耐去勢或耐化療前列腺癌患者［26］。除了前列腺癌，近年來的證據(jù)表明，enzalutamide對TNBC也有抗癌作用，這意味著靶向AR可能是TNBC的一種良好策略［27］。在TNBC中，palbociclib聯(lián)合enzalutamide可增強AR/Rb雙陽性TNBC細胞的抑制作用，誘導細胞G1期阻滯，而對其陰性的TNBC細胞抑制作用不明顯［22］。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，enzalutamide聯(lián)合palbociclib可有效阻滯AR/Rb雙陽性TNBC的生長，提示AR和Rb的共表達可能是palbociclib聯(lián)合enzalutamide聯(lián)合治療TNBC的生物標志物，為選擇CDK4/6抑制劑聯(lián)合AR拮抗劑治療提供了依據(jù)。

2.3 CDK4/6抑制劑聯(lián)合PI3Ka抑制劑治療TNBC

在LAR和間充質(zhì)干細胞亞型（mesenchymal stem-like，MSL）等非基底亞型TNBC中，富含PI3K催化亞基PIK3CA基因的激活突變［28］。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑、mTOR抑制劑與palbociclib在PIK3CA突變的細胞系中都存在協(xié)同作用［23，29］。與單一治療相比，PI3Ka和CDK4/6雙重阻斷對多種Rb基因野生型TNBC模型的協(xié)同效應表現(xiàn)在抑制TNBC細胞糖代謝［30］，顯著增加TNBC細胞系的凋亡、周期阻滯、腫瘤免疫原性和產(chǎn)生免疫原性細胞死亡。在同源TNBC小鼠模型中，PI3Ka和CDK4/6聯(lián)合抑制顯著增加了腫瘤浸潤T淋巴細胞的活化和細胞毒性［31］。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑降低了有絲分裂后CDK2的活性，造成依賴CDK4/6活性來啟動細胞周期的細胞內(nèi)微環(huán)境。同時，藥物抑制CDK4/6導致cyclin D1聚積并引發(fā)AKT信號上調(diào)，cyclin D1可以通過非經(jīng)典途徑激活CDK2［32-33］。聯(lián)合抑制CDK4/6活性和PI3KAKT-mTOR軸可以防止有絲分裂上游信號上調(diào)導致的細胞反饋性增殖，為TNBC提供一種新的治療思路，此類藥物組合有可能進一步擴大對CDK4/6抑制敏感的亞型。

2.4 CDK4/6抑制劑聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療TNBC

Goel等［34］通過乳腺癌小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，CDK4/6抑制劑在誘導腫瘤細胞周期阻滯的同時，很大程度上促進了機體抗腫瘤免疫，表現(xiàn)為增強腫瘤抗原的呈現(xiàn)、細胞毒性T細胞識別和抑制負性免疫調(diào)節(jié)的T細胞增殖。在一項最新研究中，CDK4/6抑制劑體內(nèi)可通過阻止cyclin D-CDK4介導的斑點型POZ蛋白磷酸化，提高PD-L1蛋白水平，揭示細胞周期激酶調(diào)控PD-L1蛋白穩(wěn)定性的新分子機制，提出CDK4/6抑制劑聯(lián)合PD-1/PD-L1免疫檢查點阻斷在提高人類癌癥療效的潛力［35］，為CDK4/6抑制劑與免疫療法作為抗癌治療的新組合方案提供了理論依據(jù)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組（PI3Ka抑制劑、CDK4/6抑制劑、抗PD-1抗體、抗CTLA-4抗體）在小鼠體內(nèi)誘導建立的TNBC腫瘤中，顯著增加腫瘤的免疫原性和T細胞毒性，使腫瘤消退有效且持久（＞1年），總生存期明顯優(yōu)于其他治療組［31］。

2.5 CDK4/6抑制劑聯(lián)合其他藥物治療TNBC

Foidart等［36］研究發(fā)現(xiàn)，在膜4型基質(zhì)金屬蛋白酶、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）與Rb三者共表達的TNBC中，對CDK4/6抑制劑palbociclib與抗EGFR的erlotinib聯(lián)合作用具有很強的敏感性，并提出三者生物標志物可以作為篩選CDK4/6抑制劑敏感的標志物。

現(xiàn)階段，TNBC患者的主要治療手段為DNA化療，包含蒽環(huán)類、紫杉類和鉑類藥物等。Dean等［37］研究表明，在Rb高表達的TNBC中，紫杉烷類和蒽環(huán)類藥物的細胞毒性作用常與CDK4/6抑制劑的細胞周期抑制作用相拮抗，阻止DNA損傷和細胞死亡誘導；在Rb突變的TNBC中，palbociclib單藥無明顯作用，且聯(lián)合化療藥物并不改善預后［38］。CDK4/6抑制劑聯(lián)合化療在拮抗細胞毒性的同時，增加易出錯的DNA修復機制，這可能有助于疾病的進展。

2.6 CDK4/6抑制劑在TNBC中的耐藥機制

Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb-E2F信號通路功能的失調(diào)將直接影響CDK4/6抑制劑的療效。結(jié)合CDK4/6抑制劑的作用機制和上文相關(guān)的基礎(chǔ)實驗，可以將TNBC的耐藥機制歸納為：①細胞內(nèi)cyclin E-CDK2的富集［23］，使細胞周期繞過依賴cyclin D-CDK4/6的限制點，而出現(xiàn)依賴于cyclin E-CDK2的增殖分裂，TNBC富含cyclin E1，CDK4/6抑制劑單藥治療的固有耐藥性已被報道［39-40］，而TNBC中的LAR存在分裂后cyclin E-CDK2低濃度而對CDK4/6抑制劑敏感。②Rb基因突變，30%的TNBC表現(xiàn)出Rb腫瘤抑制因子的功能喪失［41］，導致下游E2F轉(zhuǎn)錄因子釋放失控而耐藥，此外，Rb mRNA低轉(zhuǎn)錄的細胞往往對CDK4/6抑制劑較不敏感［40］。③細胞自身高表達抑制因子INK4家族，內(nèi)源性抑制CDK4/6，在P16INK4a修飾后的乳腺癌模型中，palbociclib治療對其無明顯療效［33］，Rb和P16INK4a表達水平可聯(lián)合預測乳腺癌患者對于CDK4/6的治療反應。④CDK6基因的擴增及細胞內(nèi)高表達CCND1，使其信號通路高度活化而難以抑制。⑤其他基因的突變，包括異常的MYC癌基因、TP53［42］、PDK1［43］、FGFR1［44］等，這些基因的變異均可導致對CDK4/6抑制劑敏感性降低。

3 CDK4/6抑制劑治療TNBC的臨床研究

CDK4/6抑制劑palbociclib（PD0332991）和ribociclib（LEE011）聯(lián)合內(nèi)分泌治療在晚期ER+/HER2-乳腺癌臨床試驗的突出療效，已被美國FDA批準用于治療此類患者［10］。安全性分析結(jié)果顯示［45］，palbociclib試驗組中性粒細胞減少、白細胞減少、貧血及乏力等不良反應發(fā)生率高。Abemaciclib常見的不良反應為消化道癥狀，如惡心、腹瀉，另外還包括中性粒細胞減少、靜脈血栓栓塞和肝損害［19］。同時，基于CDK4/6抑制劑在TNBC相關(guān)的眾多基礎(chǔ)實驗中取得的重大發(fā)現(xiàn)，近年來CDK4/6抑制劑在TNBC的臨床試驗也正在進行中（表1）。

目前，CDK4/6抑制劑在TNBC的臨床試驗，已經(jīng)完成的僅有一項（NCT01037790），共入組4例Rb陽性的TNBC患者，經(jīng)palbociclib單藥治療后，其中3例疾病進展（progressive disease，PD），1例疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）［39］。在一項由Ruth O'Rega團隊負責的I/Ⅱ期非隨機多中心研究（NCT03090165，2017年3月2日—2019年9月）中，CDK4/6抑制劑ribociclib（LEE011）與AR抑制劑比卡魯胺（bicalutamide）聯(lián)合治療晚期AR陽性的TNBC。邵志敏教授團隊下一項Ib/Ⅱ期開放標簽的綜合性研究（NCT03805399，2018年7月17日—2022年6月1日），對CDK4/6抑制劑聯(lián)合AR抑制劑治療的患者，進行了更為精準的篩選，此類患者入組標準為Rb基因野生型、CCDN1擴增或CDKN2A拷貝數(shù)丟失的LAR。類似的臨床試驗還有，CDK4/6抑制劑trilaciclib（G1T28）治療接受吉西他濱和卡鉑化療后轉(zhuǎn)移性TNBC患者Ⅱ期研究（NCT02978716，2017年2月7日—2020年2月）以及palbociclib聯(lián)合bicalutamide治療AR陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的I/Ⅱ期臨床試驗（NCT02605486，2015年11月11日—2020年11月）和有關(guān)TNBC的Ⅱ期臨床試驗（NCT03519178，2018年7月—2021年12月）。這些臨床試驗的藥代動力學結(jié)果、PFS、ORR、OS、CBR等值得我們期待。

表1 CDK4/6抑制劑治療TNBC的臨床試驗Tab.1 Clinical trial of CDK4/6 inhibitor in TNBC

4 總結(jié)和展望

從現(xiàn)有的研究來看，CDK4/6抑制劑對腫瘤細胞的抑制作用，不僅局限于細胞周期的阻滯，還包括細胞凋亡的誘導、腫瘤細胞激酶信號的改變、免疫調(diào)節(jié)的變化及眾多信號轉(zhuǎn)導通路的改變，這使得CDK4/6抑制劑的應用和藥物配伍也不斷擴大。在TNBC中，CDK4/6抑制劑單用療效十分有限，但其聯(lián)合用藥在增強藥物療效的同時，也擴大了受益人群，更彰顯優(yōu)勢［46］。在眾多聯(lián)合治療方案中，CDK4/6抑制劑聯(lián)合雄激素受體阻斷可能成為TNBC中LAR的一種有效的選擇性治療，但仍需等待臨床試驗的驗證。盡管目前palbociclib、ribociclib、abemaciclib這3種CDK4/6抑制劑在臨床試驗中療效可觀，但是現(xiàn)有的CDK6、CCND1、cyclin E-CDK2、INK4家族、Rb、激素受體等評估條件，除廣泛認可的激素受體ER+外，與三者療效相關(guān)的其他生物標志物尚無統(tǒng)一定論。因此，尋找CDK4/6抑制劑的療效預測分子，指導合理的聯(lián)合用藥方案，挖掘潛在的TNBC患者，進一步實現(xiàn)個體精準化治療，是未來努力的方向。