田明玉， 湯立軍

(渤海大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 遼寧 錦州 121013)

0 引言

氟是人體必需的元素之一，氟離子(F-)在牙齒健康中起著重要的作用〔1-3〕.氟的缺乏容易患齲齒，但過(guò)量攝入F-會(huì)引發(fā)中毒并導(dǎo)致人體腎毒性改變和尿石癥〔4-8〕.因此，對(duì)F-的識(shí)別與檢測(cè)具有重要的意義.

迄今為止，已有多種用于F-檢測(cè)的分析方法，包括光學(xué)分析，在線分析等.然而，這些技術(shù)通常需要昂貴的設(shè)備或?qū)I(yè)操作人員.相比之下，熒光探針技術(shù)具有實(shí)施簡(jiǎn)單，靈敏度高，響應(yīng)快速，非侵入性和實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)〔9-11〕，因而熒光探針在F-檢測(cè)方面?zhèn)涫荜P(guān)注.目前已有大量識(shí)別F-的熒光探針被相繼報(bào)道.然而，大部分已報(bào)道的F-探針的發(fā)射波長(zhǎng)都比較短(<650 nm)，因而限制了它們?cè)诩?xì)胞成像方面的應(yīng)用〔12-15〕.近紅外(NIR，650-900 nm)熒光探針在近紅外區(qū)域產(chǎn)生熒光，對(duì)活細(xì)胞的損傷小，具有更好的組織穿透能力，可有效減少生物系統(tǒng)中生物分子的背景熒光干擾，更適合用于生物體系的熒光成像.因此，設(shè)計(jì)合成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于合成的近紅外發(fā)射F-熒光探針仍有必要.

本文設(shè)計(jì)合成了一種基于異佛爾酮衍生物的新型近紅外熒光探針L(反應(yīng)式1).該探針利用叔丁基二甲基硅烷醚作為F-的識(shí)別基團(tuán)，通過(guò)探針與F-的特異性反應(yīng)，即F-觸發(fā)探針中Si-O鍵的裂解〔9，16-18〕，釋放出具有分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)性質(zhì)的熒光團(tuán)2，實(shí)現(xiàn)近紅外發(fā)射的F-識(shí)別.此外，探針L可用于MCF-7細(xì)胞中F-的熒光成像.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

如無(wú)特殊說(shuō)明，所用試劑和溶劑購(gòu)自供應(yīng)商并直接使用.化合物1和2按文獻(xiàn)〔19〕方法制備.1H NMR和13C NMR 采用Agilent 400 MR核磁共振儀測(cè)試.高分辨率質(zhì)譜(HRMS)用Bruker micrOTOF-Q質(zhì)譜儀測(cè)試.熒光光譜用970-CRT熒光分光光度計(jì)(中國(guó)上海)測(cè)試.用PHS-25 B pH計(jì)(中國(guó)上海)進(jìn)行pH測(cè)定.在Leica SP2(德國(guó)萊卡)激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察細(xì)胞成像.

反應(yīng)式1 熒光探針L的合成

1.2 合成探針L

將化合物2(174 mg，0.6 mmol)和三乙胺(162 mg，1.6 mmol)溶解在干燥的二氯甲烷(10 mL)中.將混合物在冰浴中冷卻，逐滴加入叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl，227 mg，1.5 mmol)的干二氯甲烷(3 mL)溶液.室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h后，減壓蒸除溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析分離(CH2Cl2洗脫)得到目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)(200 mg，收率82%).1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ7.64 (d,J=8.4 Hz,2H),7.28 (s,2H),6.91 (d,J=8.4 Hz,2H),6.87 (s,1H),2.60(d,J=29.6 Hz,4H),1.01 (d,J=24.8 Hz,15H),0.24 (s,6H);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ170.00,156.36,156.00,137.19,129.34,129.22,127.37,121.69,120.05,113.68,112.87,75.24,42.02,37.89,31.37,27.14,25.21.HRMS (ESI+):實(shí)測(cè)值C25H32N2OSi[M+H]+m/z404.2284, 計(jì)算值m/z403.2376.

1.3 光譜性能測(cè)試

陰離子儲(chǔ)備液(10 mM，包括，F(xiàn)-,SO32-,SCN-,S2O32-,S2-, PO42-,P2O74-,N3-,HSO3-,HPO4-,HCO3-,CO32-,C2O42-,AcO-,I-,Br-,NO2-,Cl-,NO3-, ClO4-,H2PO4-,HSO4-和CN-，使用相應(yīng)的鉀鹽或鈉鹽) 用去離子水配制.在DMSO中制備L(1.0 mM)的儲(chǔ)備液，將該儲(chǔ)備液用DMF/H2O(1/1，v/v，PBS 20 mM，pH=9.7)的混合溶液進(jìn)一步稀釋至最終濃度為10 μM.通過(guò)將相同劑量的陰離子加入到探針L中測(cè)定熒光光譜.對(duì)于滴定實(shí)驗(yàn)，將不同劑量的F-加入到探針L溶液中并熒光光譜變化.

1.4 細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

用MCF-7細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn).首先將MCF-7細(xì)胞與探針L(10 μM)在37 ℃下孵育30分鐘.用PBS緩沖液洗滌三次后，進(jìn)行細(xì)胞成像.為了檢測(cè)探針L在活細(xì)胞中傳感F-的能力，將L預(yù)處理的活MCF-7細(xì)胞與不同濃度的NaF在37 ℃下原位孵育30分鐘，然后將相同組的細(xì)胞用于熒光成像.

2 結(jié)果與討論

2.1 探針L對(duì)F-的熒光響應(yīng)

如圖1A所示，探針L(10 μM)在DMF/H2O(1/1，v/v，PBS 20 mM，pH=9.7)溶液中顯示出以675 nm為中心的弱發(fā)射帶.向探針L中加入45倍(摩爾倍數(shù)，以下同)的F-時(shí)，可以觀察到顯著的熒光增強(qiáng).然而，添加等倍數(shù)的其他陰離子，例如SO32-,SCN-,S2O32-,S2-,PO42-,P2O74-,N3-,HSO3-, HPO42-,HCO3-,C2O42-,AcO-,I-,Br-,NO2-,Cl-,H2PO4-,HSO4-和CN-，熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化.這些結(jié)果表明探針L對(duì)F-具有高度選擇性.此外，考察了探針L對(duì)F-的時(shí)間響應(yīng)(圖B)，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，并在40分鐘內(nèi)達(dá)到基本穩(wěn)定，說(shuō)明探針L對(duì)F-具有較快的時(shí)間響應(yīng).

圖1 (A)探針L在DMF/H2O (1:1, v/v, PBS 20 mM, pH=9.7)溶液中對(duì)各種陰離子的熒光光譜響應(yīng)

(B)在F-(450 μM) 存在下，探針L的熒光發(fā)射強(qiáng)度(675 nm)隨時(shí)間的變化

進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，以研究在其他潛在干擾陰離子(SO32-,SCN-,S2O32-,S2-,PO42-,P2O74-,HSO3-,HPO4-,HCO3-,CO32-,C2O42-,AcO-,I-,Br-,N3-,H2PO4-, SO42-和CN-)存在下，探針L對(duì)F-的識(shí)別能力.如圖2A所示，向探針L中分別加入45倍的各種陰離子，熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，繼續(xù)向測(cè)試液中加入45倍的F-后，熒光強(qiáng)度均顯著增強(qiáng).這一結(jié)果表明，其他共存的陰離子對(duì)F-的識(shí)別過(guò)程沒(méi)有明顯干擾.由此可見(jiàn)，L對(duì)F-的識(shí)別具有良好的抗干擾能力.

為了進(jìn)一步考察探針L的傳感性質(zhì)，進(jìn)行了熒光滴定實(shí)驗(yàn).如圖2B所示，隨著F-濃度的不斷增大，探針L(10 μM)的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng).當(dāng)F-濃度為450 μM時(shí)，熒光光譜不再變化，此時(shí)已經(jīng)達(dá)到了滴定飽和.可以觀察到F-濃度在30-150 μM范圍內(nèi)與675 nm處的熒光強(qiáng)度之間具有良好線性相關(guān)性(R2=0.9904)(圖3A)，表明探針L能夠定量檢測(cè)F-.基于滴定曲線的方法，計(jì)算出探針L對(duì)F-的檢測(cè)限(LOD=3σ/k)為2.70×10-7M，說(shuō)明探針L對(duì)F-的識(shí)別具有較高的靈敏度.

2.2 探針L對(duì)F-的識(shí)別機(jī)制

為了驗(yàn)證L對(duì)F-的識(shí)別機(jī)理，首先對(duì)L，L+F-和化合物2的薄層色譜(TLC)進(jìn)行了對(duì)照，結(jié)果如圖3B所示.可以看出，L+F-與化合物2具有相同的Rf值，由此推測(cè)F-造成了L中Si-O鍵裂解，釋放出了化合物2.為了進(jìn)一步證實(shí)該過(guò)程，將反應(yīng)混合物中與化合物2具有相同Rf值的組分進(jìn)行分離，并測(cè)試其1H NMR譜，所得氫譜與化合物2的氫譜進(jìn)行比較(圖4).在探針L的1H NMR光譜中(圖4a)，0.24 ppm處的峰信號(hào)歸屬于芐基(CH2)，在探針L與F-反應(yīng)的分離產(chǎn)物的1H NMR譜中消失，并且可以清楚地觀察到歸屬于酚羥基的質(zhì)子峰(9.98 ppm)(圖4b).很明顯，該分離產(chǎn)物與化合物2的氫譜幾乎相同，證明L與F-反應(yīng)生成了化合物2.L和F-的識(shí)別機(jī)制如反應(yīng)式2所示.

圖2 (A)在其他陰離子存在下探針L(10 μM)在DMF / H2O(1:1，v/v，PBS 20 mM，pH=9.7)溶液中對(duì)F-的熒光響應(yīng)

(B)探針L的熒光光譜隨F-濃度增大的變化

圖3 (A)熒光強(qiáng)度(675 nm)與F-濃度(30-150 μM)之間的線性關(guān)系

(B)在手持紫外燈254 nm (左) 和365 nm (右) 照射下，探針L、L+F-的反應(yīng)混合物和化合物2的TLC比較.TLC上的斑點(diǎn)為：a. 探針L, b. L+F-的反應(yīng)混合物, c. 化合物2

2.3 探針L特異性識(shí)別F-的細(xì)胞成像

為了驗(yàn)證探針L在細(xì)胞成像中的潛在用途，研究了細(xì)胞中探針L對(duì)F-的熒光成像.在將探針應(yīng)用于活細(xì)胞成像前，通過(guò)CCK-8方法測(cè)定了探針L對(duì)MCF-7細(xì)胞的毒性(圖5).結(jié)果表明，即使在高達(dá)10 μM的探針濃度下，細(xì)胞存活率也大于90%，說(shuō)明該探針對(duì)MCF-7細(xì)胞具有較低的毒性.因此，選擇10 μM探針L進(jìn)行細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn).用探針L孵育細(xì)胞30分鐘，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞幾乎無(wú)熒光(圖6B)，當(dāng)用不同濃度的NaF(100, 200, 500 μM)進(jìn)一步處理探針?lè)跤^(guò)的細(xì)胞30分鐘，觀察到隨著F-濃度增加，細(xì)胞熒光逐漸增強(qiáng)(圖6C和D和E).這些結(jié)果表明L具有良好的細(xì)胞滲透性，并且能夠?qū)CF-7細(xì)胞中的F-進(jìn)行熒光成像.

圖4 (a) 探針，L(b) 探針L與F-的分離產(chǎn)物，(c) 化合物2的部分1H NMR光譜比較

反應(yīng)式2 探針L與F-的反應(yīng)機(jī)制

圖5 在不同濃度的探針L存在下培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞，通過(guò)CCK-8測(cè)定評(píng)估存活率(%)

3 結(jié)論

綜上，本文設(shè)計(jì)并合成了一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的用于識(shí)別F-的熒光探針L，探針L在DMF/H2O(1/1，v/v，PBS 20 mM，pH=9.7)溶液中可高選擇性、高靈敏度識(shí)別F-，且具有良好的抗其他陰離子干擾的能力，檢測(cè)限為2.70×10-7M.探針L對(duì)F-識(shí)別的機(jī)理是通過(guò)F-造成探針中Si-O鍵的裂解，釋放出相應(yīng)的NIR發(fā)射熒光團(tuán).此外，探針L對(duì)MCF-7細(xì)胞具有很低毒性，并可用于MCF-7細(xì)胞中F-的熒光成像.